Attivazione forzata di RNA enhancer in situ attraverso il sistema di mediatori di attivazione sinergica dCas9

Zian Liao; Joo-Hyung Lee; Joanna Krakowiak; Ruoyu Wang; Wenbo Li

doi:10.3791/61460

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Articolo metodologico

Attivazione forzata di RNA enhancer in situ attraverso il sistema di mediatori di attivazione sinergica dCas9

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DOI:

10.3791/61460

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5 giugno 2020

Zian Liao^*¹^,² , Joo-Hyung Lee^*¹ , Joanna Krakowiak¹ , Ruoyu Wang¹^,² , Wenbo Li¹^,²

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center, ²Graduate School of Biomedical Sciences, University of Texas MD Anderson Cancer Center and UTHealth

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Gli RNA enhancer (eRNA) sono RNA non codificanti prodotti da enhancer attivi. Un approccio ottimale per studiare le funzioni degli eRNA consiste nel manipolare i loro livelli nelle regioni native della cromatina. Qui introduciamo un robusto sistema per lo studio degli eRNA utilizzando attivatori trascrizionali fusi con CRISPR-dCas9 per indurre l'espressione di eRNA di interesse.

Abstract

Gli enhancer sono elementi genomici fondamentali sparsi nel genoma dei mammiferi e dettano i programmi di espressione genica tessuto-specifici. Prove crescenti hanno dimostrato che gli enhancer non solo forniscono motivi di legame del DNA per i fattori di trascrizione (TF), ma generano anche RNA non codificanti che vengono indicati come eRNA. Gli studi hanno dimostrato che i trascritti di eRNA possono svolgere un ruolo significativo nella regolazione genica sia in fisiologia che in malattia. I metodi comunemente usati per studiare la funzione degli eRNA sono limitati ad approcci di "perdita di funzione" mediante knockdown degli eRNA o mediante inibizione chimica della trascrizione dell'enhancer. Non esiste un metodo robusto per condurre studi di "guadagno di funzione" degli eRNA per imitare condizioni patologiche specifiche come il cancro umano, dove gli eRNA sono spesso sovraespressi. Qui, introduciamo un metodo per attivare in modo preciso e robusto gli eRNA per l'interrogazione funzionale dei loro ruoli applicando il sistema di mediatori di attivazione sinergica (SAM) mediato da dCas9. Presentiamo l'intero flusso di lavoro dell'attivazione degli eRNA, dalla selezione degli eRNA, alla progettazione dei gRNA fino alla validazione dell'attivazione degli eRNA mediante RT-qPCR. Questo metodo rappresenta un approccio unico per studiare i ruoli di un particolare eRNA nella regolazione genica e nello sviluppo della malattia. Inoltre, questo sistema può essere impiegato per lo screening CRISPR imparziale per identificare bersagli di eRNA che guidano il fenotipo nel contesto di una malattia specifica.

Introduzione

Il genoma umano contiene una costellazione di elementi regolatori ^1,2,3. Tra questi, gli enhancer emergono come una delle categorie più critiche ^4,5,6. Gli enhancer svolgono un ruolo essenziale nella regolazione dello sviluppo e sono responsabili della generazione di programmi di espressione genica spazio-temporale per determinare l'identità cellulare ^5,6,7.....