Le formulazioni in polvere secca per inalazione hanno un grande potenziale nel trattamento delle malattie respiratorie. Prima di entrare in studi sull'uomo, è necessario valutare l'efficacia della formulazione della polvere secca in studi preclinici. Viene presentato un metodo semplice e non invasivo per la somministrazione di polvere secca nei topi attraverso la via intratracheale.
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Articolo metodologico
Somministrazione intratracheale della formulazione di polvere secca nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nello sviluppo di formulazioni in polvere secca inalabile, è essenziale valutare le loro attività biologiche in modelli animali preclinici. Questo documento introduce un metodo non invasivo di somministrazione intratracheale della formulazione della polvere secca nei topi. Viene presentato un dispositivo di caricamento a polvere secca costituito da una punta di pipetta di caricamento in gel da 200 μL collegata a una siringa da 1 ml tramite un fermacock a tre vie. Una piccola quantità di polvere secca (1-2 mg) viene caricata nella punta della pipetta e dispersa di 0,6 ml di aria nella siringa. Poiché le punte delle pipette sono usa e getta ed economiche, diverse formulazioni di polvere secca possono essere caricate in diverse punte in anticipo. Varie formulazioni possono essere valutate nello stesso esperimento animale senza pulizia del dispositivo e riempimento della dose, risparmiando così tempo ed eliminando il rischio di contaminazione incrociata dalla polvere residua. L'entità della dispersione della polvere può essere ispezionata dalla quantità di polvere rimanente nella punta della pipetta. È incluso un protocollo di intubazione nel mouse con una sorgente luminosa su misura e una cannula guida. La corretta intubazione è uno dei fattori chiave che influenza l'erogazione intratracheale della formulazione della polvere secca nella regione polmonare profonda del topo.
Introduzione
La via polmonare di somministrazione offre vari vantaggi nel fornire terapie sia per le azioni locali che sistemiche. Per il trattamento delle malattie polmonari, l'alta concentrazione locale di farmaci può essere ottenuta con l'erogazione polmonare, riducendo così la dose richiesta e abbassando l'incidenza di effetti collaterali sistemici. Inoltre, le attività enzimatiche relativamente basse nel polmone possono ridurre il metabolismo precoce dei farmaci. I polmoni sono anche efficienti per l'assorbimento del farmaco per l'azione sistemica a causa della superficie ampia e ben perfusa, dello strato cellulare epiteliale estremamente sottile e dell'alto volume sanguigno nei capillaripolmonari 1.
Le formulazioni in polvere secca inalato sono state ampiamente studiate per la prevenzione e il trattamento di varie malattie come asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, diabete mellito e vaccinazionepolmonare 2,3,4. I farmaci allo stato solido sono generalmente più stabili che nella forma liquida e gli inalatori a polvere secca sono più portatili e facili da usare rispetto ai nebulizzatori5,6. Nello sviluppo di formulazioni in polvere secca inalato, la sicurezza, il profilo farmacocinetico e l'efficacia terapeutica devono essere valutati in modelli animali preclinici dopo somministrazione polmonare7. A differenza degli esseri umani che possono inalare attivamente polvere secca, la consegna polmonare di polvere secca ai piccoli animali è impegnativa. È necessario stabilire un protocollo efficiente per fornire polvere secca ai polmoni degli animali.
I topi sono ampiamente utilizzati come modelli animali da ricerca perché sono economici e si riproducono bene. Sono anche facili da maneggiare e molti modelli di malattia sono ben consolidati. Esistono due approcci principali per somministrare polvere secca al polmone del topo: inalazione e somministrazione intratracheale. Per l'inalazione, il topo viene posto in una camera per tutto il corpo o solo per il naso in cui la polvere secca viene aerosolizzata e gli animali respirano nell'aerosol senza sedazione8,9. Sono necessarie attrezzature costose e l'efficienza di somministrazione dei farmaci è bassa. Mentre la camera di tutto il corpo può essere tecnicamente meno impegnativa, la camera di esposizione solo al naso potrebbe ridurre al minimo l'esposizione dei farmaci alla superficie corporea. Indipendentemente da ciò, è ancora difficile controllare e determinare con precisione la dose somministrata ai polmoni. La polvere secca viene depositata principalmente nella regione del nasofaringe dove lo sgombero mucociliare è prominente10. Inoltre, i topi all'interno della camera sono sotto stress significativo durante il processo di somministrazione perché sono vincolati e privati dell'approvvigionamento di cibo eacqua 11. Per la somministrazione intratracheale, si riferisce generalmente all'introduzione della sostanza direttamente nella trachea. Ci sono due diverse tecniche per raggiungere questo obiettivo: la tracheotomia e l'intubazione orotracheale. Il primo richiede una procedura chirurgica che faccia un'incisione nella trachea, che è invasiva e raramente utilizzata per la somministrazione della polvere. Qui viene descritta solo la seconda tecnica. Rispetto al metodo di inalazione, la somministrazione intratracheale è il metodo più comunemente usato per la consegna polmonare nel topo a causa della sua elevata efficienza di consegna con una perdita minimadi farmaci 12,13. È un metodo semplice e veloce per fornire con precisione una piccola quantità di polvere entro pochi milligrammi al topo. Sebbene il topo sia anatomicamente e fisiologicamente distinto dall'uomo e l'anestesia sia richiesta durante il processo di intubazione, la somministrazione intratracheale aggira le vie respiratorie superiori e offre un modo più efficace per valutare le attività biologiche della formulazione della polvere secca come l'assorbimento polmonare, la biodisponibilità e gli effetti terapeutici14,15.
Per somministrare polvere secca intratrachealmente, il mouse deve essere intubato, il che potrebbe essere impegnativo. In questo documento viene descritta la fabbricazione di un insufflatore di polvere secca su misura e di un dispositivo di intubazione. Vengono dimostrate le procedure di intubazione e insufflazione di polvere secca nel polmone del topo.
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Protocollo
Gli esperimenti condotti in questo studio sono stati approvati dal Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research (CULATR), The University of Hong Kong. Formulazioni in polvere secca preparate mediante liofilizzazione spray (SFD) contenenti lo 0,5% dell'RNA messaggero luciferasi (mRNA), il 5% di peptide sintetico PEG12KL4 e il 94,5% del mannitolo (w/w) sono utilizzate in questo studio per dimostrare l'espressione di mRNAnel polmone 16. Il diametro aerodinamico mediano di massa (MMAD) della polvere SFD è di 2,4 μm. La polvere di mannito essiccata a spruzzo (SD) viene utilizzata per studiare l'effetto del volume d'aria utilizzato nella dispersione dellapolvere 16. L'MMAD della polvere SD è di 1,5 μm.
1. Fabbricazione di insufflator a polvere secca e caricamento di polvere secca
- (Facoltativo) Neutralizzare le cariche statiche della polvere secca (in una fiala) e la punta della pipetta di caricamento del gel rotonda non filtrante da 200 μL. Utilizzare una pistola antistatica o un equilibrio con funzione di deionizzazione secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare una carta di pesatura con un formato di circa 4 cm x 4 cm. Piegare la carta a metà in diagonale e quindi aprirla.
- Pesare 1-2 mg di polvere secca sulla carta di pesatura.
- Riempire una punta di pipetta a caricamento in gel con polvere attraverso l'apertura più ampia della punta. Toccare delicatamente per imballare la polvere fino a quando la polvere non forma agglomerati sciolti vicino all'estremità stretta della punta(Figura 1A). Evitare di imballare la polvere troppo strettamente in quanto potrebbe ostacolare la dispersione della polvere.
- Collegare la punta caricata a polvere a una siringa da 1 ml attraverso un fermacock a tre velocità (Figura 1B). La dimensione della siringa può essere cambiata in base al volume d'aria utilizzato per disperdere la polvere. Tenere la punta e la siringa verticalmente durante il collegamento per evitare fuoriuscite di polvere. Se la somministrazione non viene eseguita immediatamente, utilizzare il parafilm per sigillare le aperture della punta e conservarla temporaneamente in condizioni adeguate fino alla somministrazione.
2. Fabbricazione di dispositivi di intubazione
- Sorgente luminosa(Figura 2)
- Preparare una sorgente luminosa su misura con una torcia a diodo emettitore di luce (LED) e una fibra ottica flessibile con un diametro di 0,8-1 mm.
- Crea un orifizio centrato sulla lente chiara della torcia a LED con un trapano a mano o una punta di perforazione in modo che la fibra ottica possa passare a malapena.
- Inserire la fibra ottica attraverso l'orifizio. Accendere la torcia a LED per regolare la posizione e la profondità di inserimento per la massima luminosità all'altra estremità della fibra ottica.
- Apporre la fibra ottica in posizione con colla epossidica chiara.
- Cannula guida(Figura 3)
- Prendere una pipetta Pasteur in plastica da 1 mL (Figura 3A) e tenere la pipetta ad entrambe le estremità.
- Utilizzare una lampada alcool (o altre fonti di calore in laboratorio come un bruciatore Bunsen) per riscaldare il centro della pipetta posizionandolo a 5-10 cm sopra la fiamma(Figura 3B). Ruotare la pipetta per assicurarsi che sia riscaldata uniformemente.
- Quando la plastica diventa morbida e deformabile, allontanare la pipetta dalla fiamma e allungare delicatamente la pipetta.
- Tagliare la pipetta allungata al centro con un paio di forbici nella parte A e nella parte B(Figura 3C-E). Utilizzate la parte A come pipetta a punta fine e la parte B come cannula guida. Per aumentare le possibilità di successo dell'intubazione con la cannula guida, fare una smussatura (non troppo affilata che può aumentare il rischio di ferire l'animale) alla fine della parte B(figura 3F). Quando una punta di pipetta a caricamento in gel da 200 μL (per il caricamento della polvere) viene inserita nella cannula guida, deve sporgere la cannula di 1-2 mm.
NOTA: Una cannula guida (Parte B) con la dimensione appropriata (diametro interno ed esterno) per l'intubazione potrebbe avere un ago calibro 21 che si adatta al suo interno mentre può anche adattarsi all'interno di un ago calibro 17. Potrebbero essere necessari più tentativi per allungare le pipette per ottenere la quota appropriata. - (Facoltativo): Tagliare una piccola apertura all'estremità più ampia della cannula guida per renderla più flessibile in modo che sia più facile tenere la fibra ottica (Figura 3F). Questa apertura consente anche il montaggio di un microsprayer per la somministrazione di aerosol liquido.
3. Intubazione
- Anestetizzare il topo (BALB/c, 7-9 settimane) con chetamina (100 mg/kg) e xiazina (10 mg/kg) per iniezione intraperitoneale.
- Preparare una piattaforma in plexiglass e montarla su un supporto con un morsetto (Figura 4A). Posizionare il mouse anestetizzato sulla piattaforma (a circa 60° di inclinazione) in posizione supina. L'altezza e l'angolo di inclinazione della piattaforma potrebbero essere regolati dalla posizione del morsetto sul supporto.
- Sospendere il mouse agganciando i suoi incisivi su un filo interdentale di nylon (Figura 4B). Fissare la posizione del mouse con un pezzo di nastro o un elastico.
- Inserire la fibra ottica nella cannula guida prima dell'intubazione con la punta del livello della fibra con l'apertura della cannula guida. Accendere la torcia a LED per illuminare.
- Sporgere delicatamente la lingua del mouse con un paio di forcep per esporre la sua trachea.
- Utilizzare l'altra mano per tenere la cannula guida con fibra ottica all'interno. Inseriscili attraverso la cavità orale. Con l'illuminazione dalla fibra ottica, l'apertura della trachea può essere vista come un orifizio tra le corde vocali.
- Allineare la smussatura della cannula guida verso la linea mediana dell'apertura (Figura 5A). Intubare delicatamente la cannula guida con fibra ottica nella trachea puntando la punta più fine della cannula all'apertura tracheale.
- Al momento dell'intubazione, rimuovere rapidamente la fibra ottica e lasciare la cannula guida all'interno della trachea (Figura 5B). Si deve osservare una respirazione normale.
- Tenere la pipetta a punta fine (parte A) all'apertura della cannula guida e insufflate un piccolo sbuffo d'aria (circa 0,2 mL) nel polmone del topo. Una leggera inflazione nel petto del topo indica una corretta intubazione. Rimuovere la pipetta della punta fine prima della somministrazione della polvere.
4. Somministrazione di polvere
- Tenere la punta caricata in polvere collegata alla siringa come descritto al passaggio 1.5. Assicurarsi che il flusso d'aria tra la siringa e la punta sia scollegato.
- Tirare lo stantuffo della siringa all'indietro per prelevare 0,6 ml di aria.
NOTA: Il volume d'aria utilizzato per disperdere la polvere dipende dalle proprietà della polvere e dalla quantità di polvere caricata. Questo è ulteriormente descritto nella sezione dei risultati. - Ruotare la valvola del fermaflusso a tre vie per collegare il flusso d'aria tra la siringa e la punta carica di polvere.
- Inserire la punta caricata a polvere nella cannula guida che è già stata posizionata nella trachea del mouse (Figura 5C). Tenere la cannula guida e spingere il pistone della siringa con forza in un'azione continua per disperdere la polvere come aerosol nel polmone.
NOTA: Qualsiasi movimento in avanti del dispositivo deve essere ridotto al minimo per evitare di ferire l'animale. - Rimuovere la punta e verificare se la polvere all'interno della punta è stata svuotata. In caso di meno, ripetere il passaggio da 4.1 a 4.4.
NOTA: Se la polvere è imballata troppo strettamente a causa di un'eccessiva maschiatura, potrebbe non essere dispersa correttamente. - Una volta completata la somministrazione, rimuovere la cannula guida dalla trachea.
- Lasciare che il mouse si riprenda posizionandolo orizzontalmente in posizione supina con la lingua semiverotta per evitare il blocco delle vie aeree.
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Risultati
Quando un insufflatore di polvere secca viene utilizzato per fornire aerosol di polvere al polmone di un animale, il volume d'aria utilizzato è fondamentale in quanto influisce sulla sicurezza e sull'efficienza di dispersione della polvere. Per ottimizzare il metodo, sono stati utilizzati diversi volumi d'aria (0,3 mL, 0,6 mL e 1,0 mL) per disperdere la polvere secca (1 mg di mannito essiccato a spruzzo) e il peso dei topi è stato monitorato per 48 ore dopo lasomministrazione (figura 6). L'u...
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Discussione
In questo documento vengono presentati dispositivi su misura per l'insufflazione di polvere secca e l'intubazione intratracheale. Nella fase di caricamento della polvere, la polvere secca viene caricata in una punta di pipetta a caricamento in gel da 200 μL. È importante toccare delicatamente la punta per consentire l'impacchettamento sciolto della polvere all'estremità stretta della punta. Tuttavia, se la polvere è imballata troppo strettamente, rimarrà bloccata nella punta e non può essere adeguatamente dispersa. Si ra...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i sig. e la Facoltà Core Facility per l'assistenza nell'imaging animale. Il lavoro è stato sostenuto dal Research Grant Council di Hong Kong (17300319).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BALB/c Topo | Femmina; 7-9 settimane di età; Peso corporeo 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Insufflatore di polvere secca | PennCentury | Modello DP-4M | |
| Ketamina 10% | Alfasan International B.V. | ||
| Torcia a diodi emettitori di luce (LED) | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitolo (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Puntale per pipetta rotonda con caricamento in gel non filtrante (200 &5; L) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Filo interdentale in nylon | Reach | 30017050 | |
| Siringa da un millilitro senza ago | Terumo | SS-01T | |
| Fibra ottica | Fibra dati | OMPF1000 | |
| peptide | PEG12KL4 EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLLKLLLLLLLLLKLLLK-NH2 | |
| Pipetta a punta fine Pasteur in plastica | Alpha Labotatori | LW4061 | |
| Rubinetto a tre vie | Braun | D201 | |
| Xilazina 2% | Alfasan International B.V. | ||
| Pistola antistatica NA Zerostat 3 | MILTY | 5036694022153 |
Riferimenti
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