Articolo metodologico

Analisi funzionale delle cellule mieloidi infiltranti il tumore mediante citometria a flusso e trasferimento adottivo

DOI:

10.3791/61511

⸱

5 marzo 2021

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce metodi affidabili di dissociazione dei tumori solidi e di isolamento delle cellule mieloidi in modelli tumorali murini intradermici o sottocutanei. La citometria a flusso consente la caratterizzazione fenotipica di popolazioni mieloidi eterogenee all'interno del microambiente tumorale e lo smistamento dimostrerà la loro funzionalità nel contesto del trasferimento adottivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il compartimento delle cellule mieloidi infiltranti il tumore rappresenta una popolazione eterogenea di cellule ampiamente immunosoppressive che sono state sfruttate dal tumore per sostenerne la crescita. Il loro accumulo nel tumore e nel tessuto linfoide secondario porta alla soppressione delle risposte immunitarie antitumorali ed è quindi un bersaglio per l'intervento terapeutico. Poiché è noto che l'ambiente citochinico locale può dettare la programmazione funzionale delle cellule mieloidi infiltranti il tumore, sono state ideate strategie per manipolare il microambiente tumorale (TME) per esprimere un panorama di citochine più favorevole all'attività delle cellule mieloidi antitumorali. Per valutare i cambiamenti indotti dalla terapia nelle cellule mieloidi infiltranti il tumore, questo articolo delineerà la procedura per dissociare il tessuto tumorale intradermico/sottocutaneo da topi solidi portatori di tumore in preparazione al recupero dei leucociti. Verranno fornite strategie per l'analisi citofluorimetrica per consentire l'identificazione di popolazioni mieloidi eterogenee all'interno di leucociti isolati e la caratterizzazione di fenotipi mieloidi unici. Infine, questo articolo descriverà un mezzo per purificare le cellule mieloidi vitali per saggi funzionali e determinare il loro valore terapeutico nel contesto del trasferimento adottivo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il microambiente tumorale (TME) è costituito da cellule neoplastiche in rapida proliferazione e da un compartimento cellulare stromale eterogeneo circostante. Poiché i tumori in crescita sono spesso scarsamente vascolarizzati, la TME è un sito periferico caratterizzato unicamente da ipossia, privazione di nutrienti e acidosi1. Per sopravvivere in questo panorama, le risposte allo stress tumorale e la riprogrammazione metabolica provocano la secrezione di fattori solubili che promuovono il rimodellamento tissutale e l'angiogenesi, nonché il reclutamento selettivo di cellule immunitarie2. Poiché le cellule mieloidi sono uno dei tipi di cellule ematopoietiche più abbondanti nella TME, vi è un crescente interesse nell'esaminare il ruolo delle cellule mieloidi infiltranti il tumore nella TME.

Le cellule mieloidi sono un gruppo eterogeneo e plastico di cellule immunitarie innate, tra cui monociti, macrofagi, cellule dendritiche e granulociti. Sebbene abbiano un ruolo critico nell'omeostasi tissutale e nella regolazione della risposta immunitaria adattativa, la loro funzione può essere polarizzante a seconda della composizione dei segnali di attivazione all'interno del microambiente locale3. I tumori sfruttano le caratteristiche delle cellule mieloidi attraverso la secrezione di fattori solubili all'interno del TME. Questi segnali alternativi possono deviare la mielopoiesi verso una differenziazione immatura e distorcere la funzione delle cellule mieloidi infiltranti il tumore esistenti3. Infatti, le cellule mieloidi all'interno della TME spesso promuovono la progressione del cancro e possono sopprimere le risposte immunitarie antitumorali, portando a effetti avversi sulla terapia del cancro.

Sebbene sia stato dimostrato che le strategie terapeutiche che promuovono la deplezione delle cellule mieloidi immunosoppressive ritardano la crescita tumorale4, la mancanza di specificità del bersaglio rischia la rimozione delle cellule mieloidi immunostimolatorie, che, al contrario, aiutano nella risoluzione del cancro. Queste cellule mieloidi infiammatorie possono esercitare profondi effetti antitumorali, tra cui l'uccisione diretta delle cellule tumorali e l'attivazione delle cellule T CD8+ citotossiche5. In alternativa, le strategie che normalizzano la composizione e la funzione delle cellule mieloidi nel TME hanno dimostrato il successo terapeutico6; Tuttavia, i meccanismi biologici alla base della loro rieducazione verso un fenotipo antitumorale non sono ancora stati completamente compresi. In definitiva, una caratterizzazione completa delle cellule mieloidi tumorali è necessaria per un ulteriore miglioramento della terapia del cancro.

Sfortunatamente, la disaggregazione riproducibile dei tumori per l'isolamento delle cellule mieloidi è impegnativa. Le cellule mieloidi derivate dal tumore sono sensibili alla manipolazione ex vivo rispetto ad altri sottogruppi di leucociti e l'aggressività dell'elaborazione tumorale può portare alla scissione enzimatica dell'epitopo e alla ridotta vitalità delle cellule recuperate7. Lo scopo di questo metodo è quello di fornire un mezzo affidabile di dissociazione tumorale per preservare l'integrità del marcatore di superficie per l'analisi e la vitalità cellulare per lo studio funzionale. Rispetto ai protocolli di isolamento dei leucociti infiltranti il tumore (TIL) che favoriscono miscele enzimatiche più dure per migliorare il rilascio riproducibile di vari sottogruppi cellulari, questo metodo favorisce una digestione enzimatica più conservativa per massimizzare il recupero delle cellule mieloidi. Vengono inoltre fornite strategie di gating del flusso multicolore di alto livello per identificare sottogruppi di cellule mieloidi tumorali murine per un'ulteriore caratterizzazione e/o smistamento.

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Protocollo

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NOTA: Tutti gli studi sugli animali sono conformi alle linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono stati approvati dall'Animal Research Ethics Board della McMaster University.

1. Prelievo e dissociazione del tumore

  1. Inoculare topi femmina di 6-8 settimane, C57BL/6 per via intradermica/sottocutanea con 2 × 105 cellule di melanoma B16 come descritto da Nguyen et al.8 Lasciare che i tumori crescano per 7 giorni prima del prelievo.
  2. Eutanasia del topo mediante lussazione cervicale assicurandosi di non interrompere il tumore quando lo si fa. Spruzza il mouse con etanolo al 70% prima della raccolta.
  3. Utilizzando un bisturi e delle forbici, rimuovere chirurgicamente il tumore intradermico/sottocutaneo dal tessuto circostante (compresi i linfonodi drenanti il tumore attaccati) e posizionare i tumori in un tubo microfugo prepesato. Mantenere il ghiaccio.
    NOTA: Condurre il prelievo del tumore in una cabina di biosicurezza per uso animale. Utilizzare una provetta conica da 15 ml per tumori più grandi.
  4. Pesare i tumori e aggiungere 500 μl di terreno RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) a ciascuna provetta, utilizzando le forbici per tagliare i tumori in piccoli pezzi all'interno della provetta o in una piastra a 6 pozzetti.
    NOTA: I pezzi di tumore devono essere abbastanza piccoli da poter essere miscelati da un pipettatore elettrico una volta aggiunto il mezzo di digestione.
  5. Preparare la miscela di dissociazione sciogliendo la collagenasi di tipo IV a 0,5 mg/mL e la DNasi a 0,2 mg/mL in terreno RPMI-1640 con il 10% di FBS e 5 mM di cloruro di calcio.
    NOTA: La miscela di dissociazione deve essere preparata fresca per massimizzare l'attività della collagenasi.
  6. Trasferire la sospensione tumorale tritata in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 10 mL di miscela di dissociazione per 0,25 mg di tumore. Porre la provetta in un agitatore orbitale a temperatura controllata per 30 minuti a 37 °C con agitazione a 200 giri/min. Neutralizzare l'attività della collagenasi aggiungendo due volumi di terreno freddo RPMI-1640 con il 10% di FBS e 2 mM di acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) e conservare in frigorifero per 10 minuti a 4 °C.
  7. Agitare brevemente e pipettare la sospensione in un colino da 40 μm su una provetta conica da 50 mL. Utilizzare uno stantuffo della siringa e un mezzo neutralizzante per disaggregare il tessuto tumorale residuo e lavarlo attraverso il colino. Centrifugare la sospensione per 5 minuti (500 × g, 4 °C), scartare il surnatante e risospendere il pellet in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con FBS al 2% e 1 mM di EDTA.

2. Arricchimento TIL e colorazione citofluorimetrica (FACS)

  1. Per arricchire i TIL per la caratterizzazione delle cellule mieloidi, utilizzare un kit di separazione cellulare magnetica progettato per la selezione positiva alla biotina con anticorpi CD45.2 biotinilati secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS (PBS con 0,5% p/v di albumina sierica bovina (BSA)) e trasferirle in una piastra con fondo a U a 96 pozzetti.
    NOTA: Non superare una concentrazione di colorazione di 1 × 108 celle/mL. Regolare il volume e dividere i campioni in più pozzetti per compensare l'elevato numero di cellule.
  3. Centrifugare la piastra per 5 minuti (500 × g, 4 °C) ed eliminare il surnatante. Aggiungere 50 μl di soluzione di blocco Fc (diluizione 1:200 di CD16/CD32 purificato anti-topo di ratto [vedere la tabella dei materiali) in tampone FACS, concentrazione finale di 2,5 μg/mL) e risospendere le cellule mediante pipettaggio. Incubare per 10 minuti a 4 °C.
  4. Aggiungere 50 μl di tampone FACS contenente una concentrazione 2x di anticorpi con colorazione superficiale (diluizione 1:50 di CD45.2, NK1.1, CD11c, F4/80, CD8a, Ly6C, CD11b, CD4, Ly6G) e un colorante di vitalità fissabile (FVS, diluizione 1:500) e miscelare le cellule mediante pipettaggio. Incubare per 20 minuti a 4 °C.
    NOTA: Coprire la piastra con un foglio di alluminio per ridurre al minimo l'esposizione alla luce. Gli anticorpi devono essere titolati prima dell'esperimento per determinare empiricamente la diluizione ottimale.
  5. Lavare le cellule due volte aggiungendo 200 μl di tampone FACS a ciascun pozzetto, centrifugando la sospensione (5 min, 500 × g, 4 °C) e scartando il surnatante.
  6. Aggiungere 100 μl di soluzione di fissaggio/permeabilizzazione (vedere la Tabella dei materiali) in ciascun pozzetto, mescolare le cellule mediante pipettaggio e incubare per 20 minuti a 4 °C.
  7. Aggiungere 100 μl di tampone di permeabilizzazione 1x (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto, centrifugare la piastra per 5 minuti (500 × g, 4 °C) e scartare il surnatante.
  8. Lavare le cellule aggiungendo 200 μl di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun pozzetto, centrifugando la sospensione (5 min, 500 × g, 4 °C) e scartando il surnatante.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa durante la notte dopo aver risospeso le cellule nel tampone di permeabilizzazione. Conservare il campione a 4 °C e al riparo dalla luce. Riprendere dopo aver mescolato brevemente le cellule prima della centrifugazione.
  9. Aggiungere 100 μl di tampone di permeabilizzazione contenente 1 volta la concentrazione di anticorpi di colorazione intracellulare (diluizione 1:100 di ossido nitrico sintasi 2 (NOS2), arginasi 1 (Arg1)) e mescolare le cellule mediante pipettaggio. Incubare per 20 minuti a 4 °C.
    NOTA: Coprire la piastra con un foglio di alluminio per ridurre al minimo l'esposizione alla luce. Gli anticorpi devono essere titolati prima dell'esperimento per determinare empiricamente la diluizione ottimale.
  10. Aggiungere 100 μl di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun pozzetto, centrifugare la piastra per 5 minuti (500 × g, 4 °C) ed eliminare il surnatante.
  11. Lavare le cellule aggiungendo 200 μl di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun pozzetto, centrifugando la sospensione (5 min, 500 × g, 4 °C) e scartando il surnatante.
  12. Risospendere le cellule in 300 μL di tampone FACS. Filtrare il campione attraverso una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL con tappo filtrante da 40 μm prima di eseguire l'analisi di citometria a flusso.

3. Smistamento delle cellule mieloidi tumorali per studi funzionali

  1. Dopo aver identificato le popolazioni di cellule mieloidi desiderate mediante analisi di citometria a flusso, pre-arricchire le cellule mieloidi sfuse per la selezione con un kit di separazione cellulare magnetica progettato per la selezione CD11b o CD11c-positiva secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
  2. Utilizzando anticorpi con colorazione superficiale specifici per i sottogruppi di cellule mieloidi desiderati (diluizione 1:100 di CD11b, Ly6C, Ly6G), colorare le cellule pre-arricchite come descritto nei passaggi 2.2-2.5.
    NOTA: Includere un colorante di vitalità riparabile per garantire lo smistamento delle cellule mieloidi vive. Non superare una concentrazione di colorazione di 1 × 108 cellule/mL. Regolare il volume e dividere i campioni in più pozzetti per compensare l'elevato numero di cellule.
  3. Risospendere le cellule in tampone di selezione a freddo (PBS con 1% p/v BSA, 25 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e 1 mM EDTA). Filtrare il campione attraverso una provetta in polipropilene a fondo tondo da 5 mL con un tappo filtrante da 40 μm. Tenere le celle sul ghiaccio e coprire il tubo con un foglio di alluminio.
    NOTA: Regolare la concentrazione di celle/volume in base alle specifiche dello strumento desiderate per l'ordinamento.
  4. Preparare una provetta per la raccolta dei campioni con il terreno di cattura (provetta in polipropilene a fondo tondo da 5 mL contenente PBS con il 50% di FBS).
    NOTA: Rivestire le provette con 5 mL di terreno di cattura per una notte prima della cernita. Scartare tutti tranne 1-2 ml del terreno di cattura il giorno successivo prima di eseguire il campione.
  5. Modificare le impostazioni dello strumento di smistamento per ridurre la pressione del campione e prevenire le perturbazioni nella formazione di goccioline. Equipaggiare la punta dell'ugello da 130 μm e utilizzare l'impostazione di 10 psi. Far funzionare il campione a bassa portata con agitazione periodica del campione a 100 giri/min, assicurandosi che la deposizione delle goccioline avvenga al centro del tubo. Dopo lo smistamento, mantenere il campione sul ghiaccio.
  6. Incubare il campione per 10 minuti a 4 °C. Centrifugare la provetta per 5 minuti (500 × g, 4 °C), scartare il surnatante e risospendere il pellet nel terreno desiderato per i saggi funzionali o il trasferimento adottivo.

4. Trasferimento adottivo di cellule mieloidi tumorali purificate

  1. Inoculare per via intradermica topi femmina di 6-8 settimane, di sesso femminile, con 1 × 106 cellule tumorali di melanoma B16 risospese in 30 μL di PBS.
    NOTA: Inoculare i topi in anticipo in modo tale che la crescita del tumore non superi i 100 mm3 al momento del trasferimento adottivo.
  2. Risospendere le cellule mieloidi tumorali selezionate in PBS con 25 mM di HEPES e 1 mM di EDTA a una concentrazione di 2 × 106 cellule/mL. Filtrare il campione attraverso una provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL con un tappo filtrante da 40 μm. Mantenere il ghiaccio.
  3. Indurre e mantenere i topi in anestesia con isoflurano al 3%. Applicare un unguento oftalmico per prevenire secchezza/lesioni oculari.
  4. Caricare una siringa da 31 G con 50 μL di sospensione cellulare. Eliminare le bolle d'aria muovendo delicatamente la siringa. Pulisca il sito di iniezione utilizzando un tampone imbevuto di alcol.
  5. Usando una pinza sterile, sollevare la pelle alla base del tumore. Inserire l'ago nello spazio sottocutaneo con un leggero angolo verso l'alto per entrare nel tumore da sotto la pelle. Usa la pinza per pizzicare la pelle che circonda l'ago ed eroga lentamente il volume della siringa. Continua a pizzicare la pelle con la pinza mentre rimuovi lentamente l'ago e usa un batuffolo di cotone per pulire potenziali perdite.
    NOTA: Se lo si desidera, procedere con eventuali trattamenti terapeutici aggiuntivi.
  6. Consenti ai topi di riprendersi dall'anestesia.

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Risultati

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I risultati dimostrano che questo metodo produce un'elevata resa di cellule mieloidi da tumori solidi murini. La conservazione dell'integrità del recettore e della vitalità cellulare facilita un'analisi funzionale affidabile dei sottogruppi mieloidi desiderati. Questi miglioramenti nell'isolamento delle cellule mieloidi hanno permesso di discernere il cambiamento della funzione delle cellule mieloidi intratumorali dopo la normalizzazione del TME con l'inibitore dell'istone deacetilasi di classe I (HDACi), MS-275, durante...

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Discussione

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Sebbene le cellule mieloidi infiltranti il tumore esistano in vari stati di attivazione e differenziazione all'interno del tumore, sono stati identificati diversi sottogruppi, tra cui le DC associate al tumore (TADC), i neutrofili associati al tumore (TAN), le cellule soppressori di derivazione mieloide (MDSC) e i macrofagi associati al tumore (TAM)12. Sfortunatamente, l'espressione sovrapposta dei marcatori della superficie cellulare utilizzati per identificare q...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ontario Institute for Cancer Research attraverso finanziamenti forniti dal governo dell'Ontario, nonché dal Canadian Institutes of Health Research (FRN 123516 e FRN 152954), dalla Canadian Cancer Society (sovvenzione 705143) e dal Terry Fox Research Institute (TFRI-1073).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2BD Biosciences5606931:100
APC-Cy7 Topo Anti-Topo NK-1.1BD Biosciences5606181:100
Topo Biotina Anti-Topo CD45.2BD Biosciences553771
BV421 Criceto Anti-Topo CD11cBD Biosciences5627821:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80BD Biosciences7432821:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences5630461:100
Collagenasi, Tipo IV, polvereGibco17104019
DNasi IRoche10104159001
EasySep Mouse CD11b Kit di selezione positiva IITecnologie delle cellule staminali18970
EasySep Mouse CD11c Kit di selezione positiva IITecnologie delle cellule staminali18780
Kit di selezione positiva della biotina nel topo con rilascio EasySepTecnologie delle cellule staminali17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6CBD Biosciences5531041:100
Colorazione di vitalità fissabile 510BD Biosciences5644061:1000
(BD Cytofix/Cytoperm)BD Biosciences
PE Rat Anti-CD11bBD Biosciences5573971:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences5527751:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6GBD Biosciences5606021:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)BD Biosciences554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553141
anticorpo monoclonale iNOS (CXNFT), APCThermo Fisher17-5920-821:100
arginasi umana/di topo. 1/ARG1 Anticorpo coniugato con fluoresceinaR& Sistemi DIC5868F1:100
Kit di soluzioni di fissazione/permeabilizzazione 554714

Riferimenti

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