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Articolo metodologico

Accesso alla citotossicità e alla risposta cellulare ai biomateriali

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DOI:

10.3791/61512

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8 luglio 2021

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1Institute of Integrated Clinical Practice, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 3Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 4Clinical Academic Center of Coimbra, CACC, Portugal, 5Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 6Laboratory of Oncobiology and Hematology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 7Institute of Endodontics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, Coimbra, Portugal

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questa metodologia mira a valutare la citotossicità dei biomateriali attraverso la preparazione di estratti solubili, utilizzando saggi di vitalità e analisi fenotipiche, tra cui citometria a flusso, RT-PCR, immunocitochimica e altre tecniche di biologia cellulare e molecolare.

Abstract

I biomateriali entrano in contatto diretto o indiretto con i tessuti umani, rendendo importante valutarne la citotossicità. Questa valutazione può essere eseguita con diversi metodi, ma esiste un'elevata discrepanza tra gli approcci utilizzati, compromettendo la riproducibilità e il confronto tra i risultati ottenuti. In questo articolo, proponiamo un protocollo per valutare la citotossicità dei biomateriali utilizzando estratti solubili, che utilizziamo per i biomateriali dentali. La preparazione degli estratti è dettagliata, dalla produzione di pellet alla sua estrazione in un terreno di coltura. La valutazione della citotossicità dei biomateriali si basa sull'attività metabolica utilizzando il saggio MTT, sulla vitalità cellulare utilizzando il saggio Sulphorhodamine B (SBR), sul profilo di morte cellulare mediante citometria a flusso e sulla morfologia cellulare utilizzando May-Grünwald Giemsa. Oltre alla valutazione della citotossicità, viene descritto un protocollo per valutare la funzione cellulare basato sull'espressione di marcatori specifici valutati mediante immunocitochimica e PCR. Questo protocollo fornisce una guida completa per la citotossicità dei biomateriali e la valutazione degli effetti cellulari, utilizzando la metodologia degli estratti, in modo riproducibile e robusto.

Introduzione

La biocompatibilità può essere definita come la capacità di un materiale di integrare il tessuto e indurre una risposta terapeutica favorevole, priva di danni locali e sistemici 1,2,3. La valutazione della biocompatibilità è fondamentale per lo sviluppo di qualsiasi materiale destinato all'uso medico. Pertanto, questo protocollo fornisce un approccio sistematico e completo per ogni ricercatore che mira a sviluppare nuovi biomateriali o a studiare nuove applicazioni per i biomateriali esistenti.

I test di citotossicità in vitro sono ampiamente utilizzati come prima fase per la valutazione della biocompatibilità, utilizzando colture cellulari primarie o linee cellulari. I risultati costituiscono un primo indicatore di potenziale applicazione clinica. Oltre ad essere vitale per lo sviluppo di biomateriali, questo test è obbligatorio per conformarsi alle normative vigenti per l'introduzione sul mercato, da parte dei regolatori EUA e UE (certificazione FDA e CE)4,5,6,7,8. Inoltre, la sperimentazione standardizzata nella ricerca biomedica offre un vantaggio significativo in termini di riproducibilità e confronto dei risultati di diversi studi su biomateriali o dispositivi simili9.

Le linee guida ISO (International Organization for Standardization) sono ampiamente utilizzate da più laboratori commerciali, normativi e accademici indipendenti per testare i materiali in modo accurato e riproducibile. La ISO 10993-5 si riferisce alla valutazione della citotossicità in vitro e la ISO 10993-12 riporta la preparazione del campionamento10,11. Per l'analisi dei biomateriali sono previste tre categorie, da selezionare in base al tipo di materiale, ai tessuti a contatto e all'obiettivo del trattamento: estratti, contatto diretto e contatto indiretto 8,11,12,13. Gli estratti sono ottenuti arricchendo un terreno di coltura cellulare con il biomateriale. Per i test di contatto diretto, il biomateriale viene posto direttamente sulle colture cellulari e, in contatto indiretto, l'incubazione con le cellule viene eseguita separata da una barriera, come un gel di agarosio11. I controlli appropriati sono obbligatori e devono essere eseguiti almeno tre esperimenti indipendenti 5,8,10,11,14.

È fondamentale simulare o esagerare le condizioni cliniche per determinare il potenziale citotossico. Nel caso di prove sugli estratti, la superficie del materiale;  il volume medio; il pH del mezzo e del materiale; il rapporto di solubilità, osmolarità e diffusione del materiale; e le condizioni di estrazione come l'agitazione, la temperatura e il tempo influenzano gli arricchimenti dei mezzi5.

La metodologia consente la valutazione quantitativa e qualitativa della citotossicità di diverse formulazioni farmaceutiche, sia solide che liquide. È possibile eseguire diversi test, come il test di captazione del rosso neutro, il test di formazione delle colonie, il test MTT e il test XTT 5,10,14.

La maggior parte degli studi di valutazione della citotossicità pubblicati utilizzano saggi più semplici, vale a dire MTT e XTT, che forniscono informazioni limitate. La valutazione della biocompatibilità non dovrebbe comportare solo la valutazione della citotossicità, ma anche la bioattività di un determinato materiale di prova2, come approvato dal presente protocollo. Ulteriori criteri di valutazione dovrebbero essere utilizzati quando giustificati e documentati. Pertanto, questo protocollo mira a fornire una guida completa, dettagliando una serie di metodi per la valutazione della citotossicità dei biomateriali. Inoltre, viene descritta la valutazione di diversi processi cellulari, vale a dire il tipo di morte cellulare, la morfologia cellulare, la funzione cellulare nella sintesi di proteine specifiche e la produzione di tessuti specifici.

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Protocollo

1. Preparazione del pellet

  1. Preparare gli stampi in cloruro di polivinile (PVC) eseguendo fori di forma circolare di dimensioni note in lastre di PVC.
    NOTA: le modanature in PVC possono essere realizzate di diverse dimensioni. Calcolare la superficie di contatto degli stampi in PVC, utilizzando la formula A = h (2πr) + 2πr2 (r: raggio del cilindro; h: altezza del cilindro).
  2. Preparare il biomateriale da testare secondo le istruzioni del produttore e il più vicino possibile all'inizio dell'esperimento.
    NOTA: Per la preparazione di biomateriali di formulazione pasta/pasta, una quantità adeguata di pasta base e catalizzatore viene miscelata manualmente con una spatola di miscelazione. Per altri materiali a base di formulazioni liquide e in polvere, deve essere eseguita la spatolazione manuale o la miscelazione meccanica con vibrazioni, seguendo le istruzioni del fabbricante o quelle adeguate per i nuovi materiali. Per i materiali liquidi, questo passaggio non è necessario. Avviare il protocollo nel passaggio 2.
  3. Posizionare il biomateriale sugli stampi con una spatola e lasciarli riposare per il tempo opportuno.
    NOTA: Il tempo di presa e le condizioni di regolazione dei biomateriali devono seguire le istruzioni del produttore o le istruzioni adeguate per i nuovi materiali.
  4. Dopo la presa, rimuovere i pellet del biomateriale dagli stampi in PVC e metterli in un contenitore (è possibile utilizzare una piastra a 6 pozzetti o una capsula di Petri).
  5. Sterilizzare i pellet mettendoli sotto una lampada a luce ultravioletta (UV) per 20 minuti per ciascun lato.

2. Ottenere gli estratti dei biomateriali

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili rigorose.

  1. Determinare il numero necessario di pellet calcolando la superficie del pellet in base alla formula descritta al punto 1.1.
    NOTA: Come valore di riferimento, la superficie di contatto di 250 mm2/mL11,15 si ottiene aggiungendo 9 pellet (r 3 mm x h 1,5 mm) per mL del mezzo.
  2. Preparare gli estratti solubili (estratto arricchito con il biomateriale).
    1. Mettere i pellet in un tubo da 50 mL e aggiungere il corrispondente mezzo di coltura cellulare. Posizionare i tubi per 24 ore nell'incubatore a 37°, in rotazione costante.
      NOTA: utilizzare il terreno di coltura cellulare appropriato per le colture cellulari.
    2. Dopo 24 ore, rimuovere i tubi dall'incubatore. A questo punto, gli estratti corrispondono ad una concentrazione di 1/1 o 100%.
    3. Effettuare diluizioni dell'estratto mediante aggiunta sequenziale di volumi uguali di terreno condizionato a terreno di coltura cellulare.
      NOTA: non deve essere effettuata alcuna regolazione del pH del fluido.
      1. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a 1 mL di estratto al 100% per ottenere un estratto al 50%. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a 1 mL di estratto al 50% per ottenere un estratto al 25% e così via (Figura 1).
        NOTA: Utilizzare le concentrazioni ritenute rilevanti per ciascun composto.

figure-protocol-1
Figura 1: Schema della preparazione e delle diluizioni degli estratti solubili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Incubazione cellulare con estratti di biomateriali

  1. Preparare una sospensione cellulare e placcarla in un contenitore cellulare adeguato, come una piastra multipozzetto, in base al numero di cellule necessarie per gli esperimenti.
    1. Inizia con un pallone delle celle desiderate con confluenza dall'80% al 90%.
    2. Eliminare i terreni di coltura cellulare, lavare con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e staccare le cellule con tripsina-EDTA (da 1 a 2 ml per un matraccio di coltura cellulare da 75 cma 2 cellule).
    3. Aggiungere il terreno di coltura cellulare (da 2 a 4 ml per un matraccio di coltura cellulare da 75 cm a 2 cellule), trasferire la sospensione cellulare in una provetta e centrifugarea 200 x g per 5 minuti.
    4. Sospendere il pellet in un volume noto di terreni di coltura cellulare.
      NOTA: Questo protocollo è progettato per l'uso di colture cellulari aderenti; Tuttavia, è possibile apportare semplici adattamenti per lavorare con colture cellulari in sospensione.
    5. Contare le cellule nell'emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare della sospensione cellulare.
    6. Sospendere la quantità determinata di sospensione cellulare nel terreno di coltura e trasferirla in piastre multipozzetto. Come valore di riferimento per la densità di semina, considerare 5 – 20 x 105 celle/cm2.
      NOTA: Il numero appropriato di celle deve essere calcolato in base al tipo di cella e alle caratteristiche della cella, vale a dire il tempo di raddoppio delle celle.
  2. Incubare le cellule per 24 ore per consentire l'adesione cellulare.
  3. Dopo questo periodo, somministrare gli estratti solubili nelle piastre di coltura.
    1. Aspirare il terreno di coltura cellulare.
    2. Aggiungere gli estratti dei biomateriali a ciascun pozzetto, secondo la sequenza delle concentrazioni, come descritto in precedenza. Aggiungere terreno di coltura cellulare fresco ai pozzetti di controllo.
    3. Incubare le piastre per 24 ore o più.
      NOTA: I controlli negativi devono essere eseguiti in ogni test, corrispondenti alle cellule non trattate, mantenute nel terreno di coltura. I tempi di incubazione possono essere selezionati in base agli obiettivi dello studio.

4. Valutazione dell'attività metabolica

  1. Dopo l'incubazione cellulare con gli estratti dei biomateriali, aspirare il mezzo dalle piastre e lavare ogni pozzetto PBS.
  2. Collocare, in ciascun pozzetto, il volume adeguato di 0,5 mg/mL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolo bromuro (MTT) preparato in PBS, pH 7,4.
  3. Incubare le piastre per 4 ore o durante la notte al buio a 37 ° C.
  4. Per solubilizzare i cristalli di formazan ottenuti, aggiungere il volume adeguato di soluzione 0,04 M di acido cloridrico in isopropanolo a ciascun pozzetto e mescolare le piastre per 30 minuti.
    NOTA: Regolare la quantità di MTT e isopropanolo in base alle dimensioni dei pozzetti.
  5. Mescolare e omogeneizzare il contenuto di ciascun pozzetto, se necessario, pipettando su e giù fino a quando non si vedono cristalli.
  6. Quantificare l'assorbanza ad una lunghezza d'onda di 570 nm con un filtro di riferimento di 620 nm, nello spettrofotometro.
  7. Per calcolare l'attività metabolica, dividere l'assorbanza delle cellule trattate per l'assorbanza delle colture di controllo. Per ottenere valori percentuali moltiplicare per 100.

5. Valutazione della morte cellulare

NOTA: Per eseguire questa valutazione devono essere utilizzate almeno 106 cellule per condizione.

  1. Utilizzare provette da centrifuga opportunamente identificate, in base alle condizioni valutate.
  2. Dopo l'incubazione cellulare con gli estratti dei biomateriali, raccogliere i terreni di coltura nella rispettiva provetta.
  3. Staccare le celle e aggiungere la sospensione cellulare ai rispettivi tubi.
  4. Concentrare le sospensioni cellulari mediante centrifugazione a 120 x g per 5 minuti.
  5. Lavare il pellet con PBS. Rimuovere il PBS mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti.
  6. Aggiungere 1 mL di PBS e trasferire i pellet cellulari alle provette citometriche identificate.
  7. Rimuovere il PBS mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti.
  8. Incubare con 100 μL di tampone di legame (0,01 M HEPES, 0,14 mM NaCl e 0,25 mM CaCl2)16, e lasciare riposare le cellule per circa 15 minuti per il recupero della membrana cellulare.
  9. Aggiungere 2,5 μL di Annexin-V marcata con fluorescenza e 1 μL di ioduro di propidio per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
  10. Dopo l'incubazione, aggiungere 400 μL di PBS e analizzare sul citometro. Per l'analisi e la quantificazione delle informazioni utilizzare software appropriati.
  11. Presentare i risultati come percentuale di cellule vive, apoptosi, apoptosi tardiva / necrosi e necrosi.

6. Valutazione morfologica

  1. Selezionare la dimensione appropriata dei vetrini di vetro sterilizzati che si adattano all'interno della piastra multipozzetto.
  2. Posizionare ogni vetrino in un pozzetto usando una pinzetta sterile.
  3. Distribuire una sospensione cellulare ad una concentrazione adeguata nei pozzetti e lasciare per una notte in un incubatore a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2.
  4. Esporre le colture cellulari agli estratti, come descritto in precedenza.
  5. Aspirare il supporto e lavare con PBS.
  6. Lasciare asciugare i coperchi a temperatura ambiente e quindi aggiungere un volume sufficiente di soluzione di May-Grünwald per coprire i vetrini; Incubare per 3 minuti.
  7. Rimuovere il colorante e lavare con acqua distillata per 1 minuto.
  8. Rimuovere l'acqua e aggiungere un volume sufficiente di soluzione di Giemsa per coprire i vetrini; Incubare per 15 minuti.
  9. Lavare i coperchi in acqua corrente.
  10. Trasferire i vetrini in una diapositiva.
  11. Guarda al microscopio. Scatta le fotografie con l'ingrandimento scelto.

7. Valutazione della funzionalità cellulare mediante reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR)

NOTA: Per eseguire questa valutazione è necessario utilizzare almeno 2x106 celle per condizione. Ad esempio, la fosfatasi alcalina è presentata come un gene di interesse per la valutazione dell'attività degli odontoblasti. Altri geni di interesse possono essere visti nella Tabella 1.

  1. Placcare le celle come descritto sopra.
    NOTA: Potrebbe essere necessario aggiustare la concentrazione delle cellule placcate, in base al tipo di cellula e alla citotossicità dei biomateriali studiati.
  2. Incubare con estratti solubili, come descritto sopra.
  3. Staccare le celle per ottenere una sospensione come descritto in precedenza.
  4. Lavare le celle due volte con PBS; Per questa centrifuga a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Lisare le cellule sospendendo il pellet in 1 mL di soluzione di purificazione dell'RNA (ad esempio, NZYol), agitazione intensa e pipettaggio successivo.
  6. Incubare i campioni per 5 minuti a temperatura ambiente.
  7. Aggiungere 200 μL di cloroformio e agitare i tubi a mano per 15 secondi.
  8. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
  9. Centrifugare lisati a 4°C per 15 min a 12.000 x g. Durante questa centrifugazione, due fasi hanno origine nel campione, lasciando l'RNA nella fase acquosa (superiore).
  10. Rimuovere la fase acquosa in un nuovo tubo e aggiungere 500 μL di isopropanolo freddo per precipitare l'RNA.
  11. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4°C.
  12. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75% mediante centrifugazione a 7.500 x g per 5 minuti a 4°C.
  13. Asciugare il pellet a temperatura ambiente fino all'evaporazione dell'etanolo.
  14. Sospendere in acqua priva di RNasi.
  15. Quantificare e determinare il grado di purezza dei campioni utilizzando la spettrofotometria di assorbimento, alle lunghezze d'onda 260 nm e 280 nm. Determinare la purezza dell'RNA e utilizzare campioni con un rapporto di purezza (A260/280) intorno a 2,0.
  16. Conservare i campioni a -80 ° C.
  17. Procedere all'esecuzione della RT-PCR seguendo il protocollo17 del produttore.
    NOTA: In base all'obiettivo dello studio, selezionare i marcatori specifici da valutare.

8. Valutazione della funzionalità cellulare attraverso l'identificazione delle proteine

NOTA: In base all'obiettivo dello studio, selezionare le proteine specifiche da valutare. Ad esempio, la sialoproteina della dentina (DSP) è presentata come una proteina di interesse per la valutazione dell'attività degli odontoblasti. Altre proteine di interesse possono essere viste nella Tabella 1.

  1. Colture di cellule in vetrini ed esporre agli estratti, come descritto prima.
  2. Lavare le colture cellulari con PBS.
  3. Fissare con paraformaldeide al 3,7% per 30 minuti a temperatura ambiente.
  4. Lavare due volte con PBS.
  5. Permeabilizzare con Tritone allo 0,5% in PBS per 15 minuti.
  6. Bloccare la perossidasi con perossido di idrogeno allo 0,3% in PBS per 5 minuti.
  7. Lavare due volte con PBS.
  8. Lavare due volte con albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA).
  9. Bloccare le colture cellulari con BSA al 2% per 45 minuti.
  10. Lavare con BSA allo 0,5% in PBS.
  11. Incubare le colture con l'anticorpo primario in base alla proteina selezionata per 60 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Questo protocollo utilizza l'anticorpo primario DSP (M20) (1:100) e l'anticorpo secondario Polyclonal Rabbit Anti-goat immunoglobuline/HRP (1:100).
  12. Lavare cinque volte con BSA allo 0,5% in PBS.
  13. Incubare con anticorpi secondari per 90 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Effettuare le diluizioni anticorpali utilizzando lo 0,5% di BSA in PBS.
  14. Lavare cinque volte con BSA allo 0,5% in PBS per 1 minuto in ogni lavaggio.
  15. Incubare colture con un substrato e una miscela di cromogeno ad una concentrazione di 20 μL di substrato cromogeno/mL per 25 minuti.
  16. Lavare due volte con BSA allo 0,5% in PBS.
  17. Controcolorazione con Ematossilina per 15 minuti.
  18. Lavare con una sequenza di 0,037 mol/L di ammoniaca e acqua distillata per 5 minuti per rimuovere il colorante in eccesso.
  19. Montare i coprivetrini sulle diapositive. Utilizzare il glicerolo come mezzo di montaggio.
  20. Lasciare asciugare durante la notte.
  21. Guarda al microscopio. Scatta le fotografie con l'ingrandimento scelto.

9. Valutazione della mineralizzazione mediante saggio Alizarin Red S

  1. Preparare una soluzione di Alizarin Red S ad una concentrazione di 40 mM18. Mescolare la soluzione per l'omogeneizzazione per 12 ore al buio.
    NOTA: Per preparare 100 mL di soluzione di Alizarin Red S, solubilizzare 1,44 g di polvere di alizarina (Peso molecolare: 360 g/mol) in acqua ultrapura, al riparo dalla luce. Per questa soluzione, il valore del pH è critico e dovrebbe essere compreso tra 4,1 e 4,3.
  2. Incubare la coltura cellulare con estratti solubili, come descritto sopra.
  3. Lavare le colture cellulari tre volte con PBS.
  4. Fissare con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
  5. Lavare tre volte con PBS.
  6. Colorare con Alizarin Red Staining solution per 20 minuti a 37 °C al buio.
  7. Dopo la colorazione, lavare le piastre con PBS per rimuovere il colorante in eccesso.
  8. Guarda al microscopio. Scatta le fotografie con l'ingrandimento scelto.
  9. Aggiungere una soluzione di estrazione, composta da acido acetico al 10% (p/v) e metanolo al 20% (p/v), in ciascun pozzetto e lasciare agitare per 40 minuti a temperatura ambiente.
  10. Misurare l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 490 nm su uno spettrofotometro19.

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Risultati

I risultati rappresentativi qui si riferiscono allo studio dei biomateriali dentali. La metodologia dell'estratto consente di ottenere un profilo di citotossicità e funzione cellulare dopo l'esposizione ai materiali dentali, per quanto riguarda gli effetti sull'attività metabolica (Figura 2), la vitalità cellulare, il profilo di morte cellulare e la morfologia cellulare (Figura 3) e l'espressione di proteine specifiche (Figura 4).

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Discussione

Questo protocollo è stato progettato prendendo in considerazione la ISO 10993-5, che si riferisce alla valutazione della citotossicità in vitro dei biomateriali che entrano in contatto con i tessuti, per valutare la biocompatibilità e contribuire alla riproducibilità degli studi21. Questa è una preoccupazione crescente nella scienza, e molti autori stanno già seguendo queste raccomandazioni nella progettazione sperimentale dei loro studi in vitro 15,22,23,24,25,26,27,28....

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Si ringraziano per il supporto: GAI 2013 (Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra); CIBB è finanziato da fondi nazionali tramite FCT (Foundation for Science and Technology) attraverso il progetto strategico UIDB/04539/2020 e UIDP/04539/2020 (CIBB). Ringraziamo Jacques Nör, University of Michigan Dental School, per aver fornito la linea cellulare MDPC-23.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo assolutoMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas Reagente di dissociazione cellulare
Anticorpo ALDHSanta Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
Soluzione antibiotica antimicoticaSigmaA5955
Test BCAThermo Scientific23225Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce
Albumina sierica bovinaSigmaA9418
CaCl2Sigma10035-04-8
Anticorpo CD133Miteny Biotec293C3-APCAnticorpo alloficocianina (APC)
CD24BD Biosciences658331Alloficocianina H7 (APC-H7)
CD44 anticorpoBiolegend103020Pacific Blue (PB)
Filtro cellulareBD Falcon35234040 µ M
Collagenasi, tipo IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DAB + CromogenoDakoK3468
DitiotreitoloSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
DSP (M-20) Anticorpo, 1: 100Santa Cruz BiotechnologyLS-C20939
ECC-1ATCCCRL-2923Linea cellulare di adenocarcinoma endometriale umano Fattore di
crescita epidermicoSigmaE9644
Hepes 0,01 MSigmaMFCD00006158
Fattore di crescita dei fibroblasti di baseSigmaF0291
Giemsa Stain, GS-500 modificatoSigmaMFCD00081642
GliceroloDakoC0563
EmocitometroVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335Linea cellulare di carcinoma a cellule squamose mammario umano
Insulina, transferrina, soluzione di selenioGibco41400045
maggio-Grü nwald Stain MG500SigmaMFCD00131580
MCF7ATCCHTB-22Linea cellulare di adenocarcinoma mammario umano
MetilcellulosaAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
Coniglio policlonale Anti-immunoglobuline caprine / HRP, 1: 100DakoG-21234
Poli(2-idrossietil-metacrilatoSigmaP3932
PutrescineSigmaP7505
RL95-2ATCCCRL-1671Linea cellulare di carcinoma dell'endometrio umano
Acido desossicolico di sodioJMSEINECS 206-132-7
Dodecil solfato di sodioSigma436143
Substrato TamponeDako926605
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
Trypan bluSigmaT8154
Tripsina-EDTASigmaT4049
β Anticorpo -actinaSigmaA5316

Riferimenti

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