Ottenere osteociti primari attraverso il frazionamento calvario murino degli osteociti che esprimono GFP

Sommario

Questo protocollo descrive la dissezione della calvaria di topo neonatale dmp1-topazio e l'isolamento degli osteociti che esprimono la proteina fluorescente verde attraverso la digestione e il frazionamento cellulare, oltre alla preparazione degli osteociti per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Abstract

L'osteocita, una volta ritenuto un residente passivo dell'osso data la funzione dietro le quinte di rilevare il carico meccanico, è ora portato sotto i riflettori e ha dimostrato di avere molteplici funzioni importanti come modificare attivamente la matrice extracellulare e formare un organo endocrino con il sistema lacunocanalicolare che lo racchiude inviando messaggi a siti distanti. Grazie ai metodi che hanno permesso di testare l'osteocita in vitro dall'isolamento degli osteociti primari alle linee cellulari simili agli osteociti, gli osteociti stanno ora vivendo un interesse clamoroso e un'ondata di conoscenze sulla struttura e la funzione. Molti aspetti della biologia degli osteociti e dell'interazione con altri componenti molecolari devono ancora essere scoperti. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio l'isolamento efficiente degli osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio, che esprimono la proteina fluorescente verde negli osteociti, attraverso il frazionamento cellulare e successivamente l'acquisizione di colture di osteociti primari da parte di FACS.

Introduzione

Gli osteociti sono cellule terminalmente differenziate dai progenitori osteoblastici che sono stati incorporati nella loro matrice secreta¹. Sono le cellule più abbondanti e più longeve tra le popolazioni di cellule ossee. Risiedono all'interno di lacune e hanno una caratteristica morfologia stellata con dendriti che si estendono attraverso canali chiamati canalicoli formando una vasta rete di comunicazione e scambio metabolico con l'ambiente circostante e la superficie ossea². Gli osteociti coreografano sia i ruoli degli osteoblasti che degli osteoclasti nel rimodellamento osseo, sono le cellule meccanosensoriali primarie che conferiscono adattamento al carico meccanico³, sono coinvolte nell'omeostasi del fosfato⁴ e nella mineralizzazione della matrice ossea⁵ e, insieme al sistema lacunocanalicolare, agiscono come un organo endocrino che segnala i tessuti distanti⁶.

Gli osteociti sono situati all'interno di una matrice mineralizzata, che limita l'accessibilità e rende difficile il loro isolamento, ostacolando così l'indagine in vitro. Uno dei primi metodi di isolamento ha descritto osteociti isolati dalla calvaria di pollo utilizzando un anticorpo monoclonale osteocita-specifico (OB7.3)⁷ che in seguito è stato conosciuto per essere la variante aviaria di PHEX (PHosphate-regulating gene with homology to Endopeptidases on the X chromosome)⁸. Altri ricercatori hanno utilizzato la digestione sequenziale delle ossa lunghe del ratto 9 o del topo 10 per ottenere frazioni ricche di osteociti in cui la purezza degli osteociti è stata riportata intorno al⁷⁰%⁹. I limiti di questa procedura includono la purezza sub-ottimale delle colture contaminate con altri tipi di cellule oltre agli osteociti e che gli osteociti potrebbero essere potenzialmente ricoperti da altre cellule in coltura poiché gli osteociti hanno perso la capacità di dividersi. Queste sfide limitano l'usabilità delle culture a lungo termine.

Per superare queste limitazioni, sono state sviluppate diverse linee cellulari di osteociti. La linea cellulare MLO-Y4¹¹ e la linea cellulare MLO-A5¹² sono in particolare le linee cellulari più studiate che sono utili per lo studio degli osteociti allo stadio iniziale; tuttavia, sono meno utili per studiare la segnalazione degli osteociti maturi in quanto esprimono bassi livelli di sclerostina e FGF23¹³, entrambi marcatori di osteociti maturi. Altre linee cellulari, tra cui IDG-SW3 14 e Ocy454¹⁵, esprimono alti livelli di sclerostina e FGF23 e sono utili nello studio dello stadio tardivo degli osteociti. Le linee cellulari si rivelano utili strumenti di ricerca; Tuttavia, non sono privi di limitazioni in quanto non rappresentano pienamente la biologia della cellula primaria. Diverse linee cellulari rappresentano diversi stadi di sviluppo dello spettro di maturità degli osteociti e le linee cellulari non riescono a rappresentare l'eterogeneità degli osteociti primari^16,17.

Per ottenere colture pure di osteociti primari, i ricercatori hanno sfruttato il modello murino cre in cui il promotore dmp1 da 8 kb viene utilizzato per guidare l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) negli osteociti^18,19. Topi transgenici doppi (pOB-Col 2.3- GFP-ciano e DMP1-GFP-topazio) di Paic et ^al.19 e topi transgenici dmp1-topazio di Nakashima et ^al.20 sono stati utilizzati per ottenere popolazioni di osteociti. In cui hanno impiegato la digestione sequenziale e FACS di osteociti che esprimono GFP per acquisire colture di osteociti primari^19,20. La direzione del cre nel topo reporter Ai9 dmp1 da 10 kb, che attiva la proteina tdTomato, ha dimostrato di essere presente negli osteociti, negli osteoblasti, nei muscoli e nelle cellule all'interno del midollo osseo. Il promotore dmp1 da 8 kb aveva lo stesso pattern di espressione, ma solo una percentuale di osteoblasti e cellule del midollo osseo esprimeva la proteina, il che indica che il promotore dmp1 da 8 kb è più specifico²¹. Nonostante ciò, i risultati ottenuti utilizzando il promotore dmp1 da 8 kb devono essere interpretati con cautela e i profili di espressione genica devono essere eseguiti di routine utilizzando marcatori specifici degli osteociti rispetto agli osteoblasti per garantire che la popolazione ottenuta sia di purezza sufficientemente elevata.

I marcatori osteoclasti OSCAR e Dcstamp sono stati trovati in popolazioni di osteociti ematopoietici non impoveriti rispetto a quelli impoveriti, questa scoperta ha portato gli autori a concludere che i digesti ottenuti dal frazionamento della calvaria neonatale dmp1-topazio 8-kb e dalla selezione GFP sono contaminati da cellule ematopoietiche. La contaminazione con cellule ematopoietiche avrebbe potuto essere mitigata stringendo la porta di ordinamento della GFP poiché le cellule ematopoietiche GFP-positive avevano un'intensità GFP ragionevolmente inferiore rispetto alle cellule mesenchimali GFP-positive (osteociti)²².

I metodi per lo studio degli osteociti in vitro hanno contribuito alla recente ricchezza di informazioni sulla biologia degli osteociti. Tuttavia, l'isolamento degli osteociti rimane una procedura laboriosa e lunga con basse rese cellulari. Il metodo descritto di digestione ossea utilizzando collagenasi e EDTA spesso fino alla frazione 8²³, richiede diverse ore in cui la vitalità degli osteociti è tassata. I ricercatori hanno riferito di utilizzare frazioni (2\u20125) per l'ordinamento cellulare 20 e hanno dimostrato che il profilo di espressione dei geni associati agli osteociti rispetto a quelli degli osteoblasti conferma il successo dell'isolamento di popolazioni di osteociti puri²⁰. In questo articolo, descriviamo il processo di ottenimento delle frazioni (2-0125) e confrontiamo la resa degli osteociti da ciascuna frazione a partire dalla frazione da 1 a 8 per determinare il ritorno degli osteociti in ogni frazione. Descriviamo anche la dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonatale e la digestione calvariale usando collagenasi e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), nonché la preparazione delle cellule per FACS.

Protocollo

Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite in conformità con le regole e i regolamenti dell'Università di Tohoku.

1. Dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonato

1. Per questo protocollo, utilizzare 6\u20127 cuccioli di C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia topi con inalazione di isoflurano al 5% e quindi trasferire i cuccioli in etanolo al 70%.
2. Trasferire il cucciolo eutanasia in un piatto di coltura non trattato.
3. Usando forbici e pinzette, afferrare la pelle alla base del cranio e fare un'incisione.
4. Usando la prima incisione come punto di partenza, tagliare su entrambi i lati laterali del cranio davanti alle orecchie, rimuovere la pelle ed esporre la calvaria.
5. Tenere la testa dal ponte nasale e tagliare la calvaria lungo la sutura lambdoide. Tagliare lungo i bordi laterali delle ossa parietali ed estenderlo per includere la parte frontale.
6. Separare il calvario dal tessuto cerebrale sottostante.
   NOTA: Per garantire un calvario osseo pulito con un attacco minimo dei tessuti molli, non tagliare in profondità l'osso; Per riferimento, si dovrebbe essere in grado di vedere l'ombra delle forbici sotto l'osso.
7. Trasferire la calvaria in soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4 durante tutto il protocollo). Assicurati che la parte concava sia rivolta verso l'alto.

2. Frazionamento della calvaria di topo appena nata

1. Trasferire fino a 5 calvario in un tubo conico da 50 mL contenente 5 mL di soluzione di collagenasi 2 mg/mL. Utilizzare una soluzione di collagenasi fresca preparata appena prima dell'uso.
   1. Per preparare una soluzione di collagenasi fresca, aggiungere la polvere di collagenasi al tampone isolante (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitolo,₃ mM K 2 HPO₄, 1 mM CaCl 2, 1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA), 5 mg/ml di glucosio e 25 mM HEPES) a₂mg/ml. Sciogliere la polvere di collagenasi su un agitatore magnetico.
   2. Far passare la soluzione di collagenasi attraverso un'unità filtrante sterile da 0,22 μm in un tubo da 50 ml e tenerla in ghiaccio per tutta la durata del protocollo.
2. Incubare la calvaria a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 giri/min per ottenere la frazione 1.
3. Scartare il digesto della frazione 1, lavare il calvario con 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e gettare il lavaggio.
4. Incubare il calvario in 5 mL di acido etilendiamminotetraacetico 5 mM contenente 1 mg/mL di BSA in PBS, PH 7,4 a 37 °C per 15 minuti su uno shaker a 300 rpm.
5. Raccogliere il digest in un tubo conico da 50 ml. Lavare la calvaria con 5 ml di PBS e aggiungere la soluzione di lavaggio al digest.
   NOTA: In ogni punto di raccolta del digesto e lavaggio, pipettare le ossa nella loro soluzione per staccare le cellule dall'osso e per prevenire doppietti e aggregati cellulari.
6. Per ottenere la frazione 2, centrifugare il digesto a 300 x g a 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 8 ml di α-Minimum Essential Medium (MEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina. Seminare su un piatto di coltura di 10 cm. Incubare la frazione 2 a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
7. Incubare il calvario in 5 mL di soluzione di collagenasi a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 rpm.
8. Per raccogliere la frazione 3, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 3 a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
   NOTA: A questo punto, le ossa diventeranno più piccole e saranno ridotte a frammenti. Per garantire che nessuna osso venga aspirato accidentalmente nei digesti, il che porta alla perdita di cellule nel processo, utilizzare una piccola pipetta a punta per la raccolta dei digesti (punte per pipette da 1000-2000 μL).
9. Incubare il calvario in 5 mL di soluzione di collagenasi a 37 °C per 20 minuti su uno shaker a 300 rpm.
10. Per raccogliere la frazione 4, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 4 a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
11. Incubare il calvario in 5 mL di 5 mM EDTA contenente 1 mg/mL di BSA in PBS (pH 7,4) a 37 °C per 15 minuti su uno shaker a 300 giri/min.
12. Per raccogliere la frazione 5, ripetere i passaggi 2.5\u20122.6. Incubare la frazione 5 a 37 °C sotto il 5% di CO₂. Gli osteociti possono essere preparati per la selezione nello stesso giorno o coltivati fino a 24 ore prima della selezione.

3. Preparazione di osteociti per la selezione cellulare attivata a fluorescenza

1. Aspirare il mezzo di ciascuna frazione cellulare e lavare delicatamente con 10 ml di PBS due volte.
2. Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,5% in PBS e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C. Aggiungere 5 ml di FBS al 10% α-MEM e pipettare per staccare delicatamente le cellule. Combinare le cellule in ciascuna frazione setacciando un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.
3. Lavare le celle con 10 ml di PBS e raccogliere setacciando un filtro cellulare da 40 μm in una provetta conica da centrifuga da 50 ml. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 min.
4. Aspirare il surnatante e aggiungere il 10% di FBS α-MEM al pellet. Regolare la concentrazione cellulare a circa 1 x 10⁷ cellule/ml.
5. Filtrare le celle in un tubo con copertura in rete di nylon da 35 μm. Le celle sono ora pronte per FACS.
6. Per questo protocollo, utilizzare un ugello di dimensioni 100 μm. Il fluido di raccolta deve essere costituito per il 10% da FBS α-MEM. Mantenere il campione da selezionare in agitazione e a 4 °C in tutto il tipo, se possibile.
7. Prima dell'ordinamento, ottimizzare il gating per rimuovere artefatti e celle regolando l'area SSC (side scatter) e l'area FSC (forward scatter). Elimina i doppietti regolando SSC-width vs SSC-Height e FSC-area vs FSC-width. Gli osteociti GFP-negativi dovrebbero essere usati come controllo per regolare i parametri dello strumento di ordinamento.
8. Al termine della raccolta delle cellule, centrifugare le cellule a 300 x g a 4 °C per 10 minuti. Lavare le celle con PBS. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 min.
9. Risospendere le celle e regolare il numero come desiderato utilizzando il 10% FBS α-MEM.

Risultati

Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare il processo di ottenimento di colture di osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio attraverso un processo di frazionamento utilizzando collagenasi per degradare la matrice di collagene e EDTA per la chelazione del calcio, dopo di che le cellule vengono preparate per FACS per separare gli osteociti da altre popolazioni cellulari.

I metodi per ottenere osteociti primari dalla calvaria di topo neonatale spesso descrivono l'u...

Discussione

Il primo osteocita isolato proveniva da una calvaria di pollo⁷ isolata utilizzando (OB7.3) o la variante aviant di PHEX; Tuttavia, questo metodo è limitato dalla disponibilità di anticorpi funzionanti, poiché devono essere prodotti anticorpi specifici per osteociti che sono anche specie-specifici. I ricercatori hanno utilizzato una diversa modifica del processo enzimatico sequenziale per ottenere osteociti da ossa lunghe di topo e ratto; La purezza riportata di queste colture è stata fissata a cir...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BD FACSDiva software	BD Biosciences		Acquisizione e analisi dati
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	Tubo 12 x 75 mm con tappo filtrante, 35 μ m rete di nylon.
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Collagenase	Wako, Osaka, Giappone	034-22363	0,2% (p/v), miscela di collagenasi grezza proveniente da C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Giappone		5mM EDTA preparato con 0,1% BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
		di isolamento	70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitolo, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (p/v) BSA, 0,5% (p/v) glucosio e 25 mM HEPES
	Merck Millipore, Irlanda	SLGV033RS	0.22μ m
Filtro cellulare in nylon	FALCON, NY, USA		40μ m
Trypsin-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0,5% x10. diluito a x1 in PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Giappone		Contenente il 10% di siero fetale bovino, 100 UI/ml di penicillina G e 100 μ g/ml di streptomicina

Siero fetale bovino (FBS)Biowest, Nuaillé, Francia Tampone Millex Unità filtrante sterile