Questo protocollo descrive la dissezione della calvaria di topo neonatale dmp1-topazio e l'isolamento degli osteociti che esprimono la proteina fluorescente verde attraverso la digestione e il frazionamento cellulare, oltre alla preparazione degli osteociti per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
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Articolo metodologico
Ottenere osteociti primari attraverso il frazionamento calvario murino degli osteociti che esprimono GFP
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'osteocita, una volta ritenuto un residente passivo dell'osso data la funzione dietro le quinte di rilevare il carico meccanico, è ora portato sotto i riflettori e ha dimostrato di avere molteplici funzioni importanti come modificare attivamente la matrice extracellulare e formare un organo endocrino con il sistema lacunocanalicolare che lo racchiude inviando messaggi a siti distanti. Grazie ai metodi che hanno permesso di testare l'osteocita in vitro dall'isolamento degli osteociti primari alle linee cellulari simili agli osteociti, gli osteociti stanno ora vivendo un interesse clamoroso e un'ondata di conoscenze sulla struttura e la funzione. Molti aspetti della biologia degli osteociti e dell'interazione con altri componenti molecolari devono ancora essere scoperti. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio l'isolamento efficiente degli osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio, che esprimono la proteina fluorescente verde negli osteociti, attraverso il frazionamento cellulare e successivamente l'acquisizione di colture di osteociti primari da parte di FACS.
Introduzione
Gli osteociti sono cellule terminalmente differenziate dai progenitori osteoblastici che sono stati incorporati nella loro matrice secreta1. Sono le cellule più abbondanti e più longeve tra le popolazioni di cellule ossee. Risiedono all'interno di lacune e hanno una caratteristica morfologia stellata con dendriti che si estendono attraverso canali chiamati canalicoli formando una vasta rete di comunicazione e scambio metabolico con l'ambiente circostante e la superficie ossea2. Gli osteociti coreografano sia i ruoli degli osteoblasti che degli osteoclasti nel rimodellamento osseo, sono le cellule meccanosensoriali primar....
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Protocollo
Tutte le procedure e la cura degli animali sono state eseguite in conformità con le regole e i regolamenti dell'Università di Tohoku.
1. Dissezione della calvaria di topo dmp1-topazio neonato
- Per questo protocollo, utilizzare 6\u20127 cuccioli di C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Eutanasia topi con inalazione di isoflurano al 5% e quindi trasferire i cuccioli in etanolo al 70%.
- Trasferire il cucciolo eutanasia in un piatto di coltura non trattato.
- Usando forbici e pinzette, afferrare la pelle alla base del cranio e fare un'incisione.
- Usando la prima incisione come punto di partenza, tagliare su entrambi ....
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Risultati
Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare il processo di ottenimento di colture di osteociti primari dal calvario di topo neonatale dmp1-topazio attraverso un processo di frazionamento utilizzando collagenasi per degradare la matrice di collagene e EDTA per la chelazione del calcio, dopo di che le cellule vengono preparate per FACS per separare gli osteociti da altre popolazioni cellulari.
I metodi per ottenere osteociti primari dalla calvaria di topo neonatale spesso descrivono l'u.......
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Discussione
Il primo osteocita isolato proveniva da una calvaria di pollo7 isolata utilizzando (OB7.3) o la variante aviant di PHEX; Tuttavia, questo metodo è limitato dalla disponibilità di anticorpi funzionanti, poiché devono essere prodotti anticorpi specifici per osteociti che sono anche specie-specifici. I ricercatori hanno utilizzato una diversa modifica del processo enzimatico sequenziale per ottenere osteociti da ossa lunghe di topo e ratto; La purezza riportata di queste colture è stata fissata a cir.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione JSPS KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (n. 19K10397 a H.K. e n. 18K09862 a I.M.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | Acquisizione e analisi dati | |
| BD Falcon Tube | BD Biosciences | 352235 | Tubo 12 x 75 mm con tappo filtrante, 35 μ m rete di nylon. |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, MO, USA | ||
| Collagenase | Wako, Osaka, Giappone | 034-22363 | 0,2% (p/v), miscela di collagenasi grezza proveniente da C. histolyticum. |
| EDTA | Dojindo, Kumamoto, Giappone | 5mM EDTA preparato con 0,1% BSA | |
| FACSAriaTM II | BD Biosciences | ||
| di isolamento | 70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitolo, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (p/v) BSA, 0,5% (p/v) glucosio e 25 mM HEPES | ||
| Merck Millipore, Irlanda | SLGV033RS | 0.22μ m | |
| Filtro cellulare in nylon | FALCON, NY, USA | 40μ m | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies, NY, USA | 0,5% x10. diluito a x1 in PBS | |
| α-MEM | Wako, Osaka, Giappone | Contenente il 10% di siero fetale bovino, 100 UI/ml di penicillina G e 100 μ g/ml di streptomicina |
Riferimenti
- Manolagas, S. C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).
- Bonewald, L. F. Osteocy....
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Ristampe e permessi
