Microsezione laser-cattura RNA-Sequenziamento per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto nelle piante

Lim Chee Liew; Yan Wang; Marta Peirats-Llobet; Oliver Berkowitz; James Whelan; Mathew  G. Lewsey

doi:10.3791/61517

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Articolo metodologico

Microsezione laser-cattura RNA-Sequenziamento per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto nelle piante

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DOI:

10.3791/61517

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5 agosto 2020

Lim Chee Liew¹^,² , Yan Wang¹^,² , Marta Peirats-Llobet¹ , Oliver Berkowitz¹^,²^,³ , James Whelan¹^,²^,³ , Mathew G. Lewsey¹^,³

¹Department of Animal, Plant and Soil Science, AgriBio Building, La Trobe University, ²Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology, La Trobe University, ³Australian Research Council Research Hub for Medicinal Agriculture, AgriBio Building, La Trobe University

In questo articolo

Sommario

Presentato qui è un protocollo per la microdissezione laser-cattura (LCM) di tessuti vegetali. LCM è una tecnica microscopica per isolare aree di tessuto in modo privo di contaminazione. La procedura include fissazione del tessuto, incorporamento di paraffina, sessazione, LCM e estrazione dell'RNA. L'RNA viene utilizzato nell'analisi dei trascrimi specifici del tessuto a valle e tempormente risolta.

Abstract

Lo sviluppo di un organismo multicellulare complesso è governato da tipi di cellule distinti che hanno diversi profili trascrizioni. Per identificare le reti di regolamentazione trascrizionali che governano i processi di sviluppo è necessario misurare i profili di espressione genica spaziale e temporale di questi singoli tipi di cellule. Pertanto, la comprensione del controllo spatio-temporale dell'espressione genica è essenziale per comprendere come sono regolati i processi biologici e di sviluppo. Qui, descriviamo un metodo di microdissezione laser-cattura (LCM) per isolare un piccolo numero di cellule da tre organi embrionali d'orzo in un corso di tempo durante la germinazione seguito dalla profilazione della trascrizione. Il metodo consiste nella fissazione dei tessuti, nell'elaborazione dei tessuti, nell'incorporazione di paraffina, nella sessazione, nell'estrazione di LCM e RNA seguita da PCR o RNA-seq in tempo reale. Questo metodo ci ha permesso di ottenere profili spaziali e temporali di trascrittori di organi di semi da un numero variabile di cellule (da decine a centinaia), fornendo una specificità del tessuto molto maggiore rispetto alle tipiche analisi dei tessuti sfusi. Da questi dati siamo stati in grado di definire e confrontare le reti normative trascrizioni, nonché prevedere i fattori di trascrizione normativa candidati per i singoli tessuti. Il metodo deve essere applicabile ad altri tessuti vegetali con ottimizzazione minima.

Introduzione

Lo sviluppo e la crescita delle piante comportano l'azione coordinata delle reti di regolamentazione trascrizionali all'interno di diverse cellule esistenti in un ambiente cellulare complesso. Per comprendere l'attività di queste reti normative, abbiamo bisogno della conoscenza dell'espressione genica spaziale e temporale all'interno di diversi tipi di cellule attraverso le fasi di sviluppo. Tuttavia, le analisi dell'espressione genica sono più comunemente condotte in interi organi o campioni di tessuto sfusa a causa della sfida tecnica di isolare e analizzare un piccolo numero di cellule. Il metodo che descriviamo qui ha permesso di ottenere un'analisi del trascrittu....