Sfruttare la turbidità e la tromboelastografia per la caratterizzazione complementare dei coaguli

Summary

La fibrina è responsabile della formazione di coaguli durante l'emostasi e la trombosi. I saggi di turbidità e il tromboelastograhy (TEG) possono essere utilizzati come strumenti sinergici che forniscono una valutazione complementare di un coagulo. Queste due tecniche insieme possono dare maggiori informazioni su come le condizioni di coagulazione influenzano la formazione di coaguli di fibrina.

Abstract

La trombosi è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. La fibrina (ogen) è la proteina principalmente responsabile della formazione di coaguli o trombosi. Pertanto, caratterizzare la formazione di coaguli di fibrina è utile per lo studio della trombosi. Turbidità e tromboelastografia (TEG) sono entrambi ampiamente utilizzati in vitro saggi per monitorare la formazione di coaguli. La turbidità misura dinamicamente la trasmissione della luce attraverso una struttura di coagulo di fibrina attraverso uno spettrometro ed è spesso utilizzata nei laboratori di ricerca. TEG è una tecnica viscoelastica specializzata che misura direttamente la forza del coagulo di sangue ed è utilizzata principalmente in ambienti clinici per valutare l'emostasi dei pazienti. Con l'aiuto di questi due strumenti, questo studio descrive un metodo per caratterizzare un coagulo di fibrina in vitro utilizzando un modello semplificato di coagulo di fibrinogeno/trombina. Le tendenze dei dati in entrambe le tecniche sono state confrontate in varie condizioni di coagulazione. I coaguli di fibrina umana e bovina sono stati formati fianco a fianco in questo studio, poiché i fattori di coagulazione bovina sono spesso utilizzati come sostituti di fattori di coagulazione umana in ambienti clinici e di ricerca. I risultati dimostrano che TEG e la turbidità tracciano la formazione di coaguli attraverso due metodi distinti e, se utilizzati insieme, forniscono informazioni complementari sulla resistenza del coagulo e sulla struttura delle fibre in diverse condizioni di coagulazione.

Introduction

La trombosi è la formazione patologica di un coagulo di sangue nel corpo che blocca la circolazione sanguigna che porta ad alta morbilità e mortalità in tutto il mondo. Ci sono da 1 a 2 casi di tromboembolismo venoso e da 2 a 3 casi di malattie vascolari indotte dalla trombosi ogni 1000 persone^{all'anno 1,2}. Presentato qui è un metodo che sfrutta la tromboelastografia (TEG) e la torbidità per monitorare la formazione di coaguli in varie condizioni di coagulazione. Fibrin(ogen) è la proteina primaria che è responsabile della formazione di coaguli nel corpo. Nelle fasi finali della cascata di coagulazione, i fibrinopeptidi vengono sciolti dal fibrinogeno da thrombin iniziando la polimerizzazione dei monomeri fibrin insolubili man mano che il coagulo si^{sviluppa 3,4}. Per comprendere la formazione di coaguli nella trombosi patologica, è necessario caratterizzare la formazione di fibrina in diverse circostanze di coagulazione. Sono stati utilizzati più saggi di monitoraggio dei coaguli per studiare la formazione di coaguli di fibrina in vitro. Il tempo di prothrombina (PT/INR) e il tempo di tromboplastin parziale attivato (aPTT) sono due saggi clinici comuni che misurano l'integrità di una specifica via di coagulazione. Tuttavia, utilizzano il tempo come unica variabile che non fornisce alcuna indicazione delle proprietà fisiche del coagulo⁵. La microscopia elettronica consente la visualizzazione della microstruttura di un coagulo di fibrina completamente formato, ma non fornisce informazioni sul processo di formazione del coagulo^{stesso 6}. Tra tutti i saggi, i saggi di torbidità e TEG offrono la possibilità di monitorare dinamicamente le caratteristiche dei coaguli nel tempo. Queste tecniche consentono la misura di profili di coagulazione completi e, pertanto, forniscono qualche beneficio rispetto ad altri strumenti di caratterizzazione del coagulo di fibrina.

In particolare, i saggi di torbidità (o torbidimetria del coagulo) sono ampiamente utilizzati per la ricerca e le applicazioni cliniche grazie alla sua implementazione semplicistica e all'ampia accessibilità degli spettrometri nei laboratori di ricerca. Questo saggio permette una misurazione dinamica della trasmissione della luce attraverso un coagulo di formatura prendendo singole letture ripetitive a una lunghezza d'onda definita (più comunemente a una lunghezza d'onda nell'intervallo di 350 – 700 nm)⁷. La temperatura nella camera di lettura può anche essere regolata. Con la forma del gel fibrina, la quantità di luce che viaggia attraverso la rete proteica si riduce causando un aumento dell'assorbimento nel tempo. Allo stesso modo, l'assorbimento diminuisce quando la rete di coaguli si degrada. I saggi di turbidità possono essere facilmente multiplex utilizzando un formato di piastra multi-pozzo per consentire lo screening del campione ad alta velocità effettiva in entrambe le piastre 96 e 384-well. Diverse caratteristiche del coagulo possono essere derivate da una curva di tracciamento della torbidità (assorbimento nel tempo di misurazione) che includono: massima torbidità, tempo alla torbidità massima, tempo per l'insorgenza del coagulo e tasso di formazione dei coaguli (Vmax). Un rapporto massa/lunghezza in fibra di fibrina può anche essere derivato dai dati grezzi di torbidità per stimare lo spessore della fibra di fibrina^8,9,10.

TEG è utilizzato principalmente nell'ambiente clinico per valutare l'emostasi e la lisi coagulata dei pazienti. È anche comunemente usato in applicazioni chirurgiche per determinare quando i farmaci anti-fibrinolitici o prodotti ematici emostatici devono essere somministrati^11,12. La formazione di coaguli avviene all'interno di una tazza TEG con tutti i componenti di coagulazione aggiunti alla coppa prima dell'inizio del saggio. La coppa, con coagulo in evoluzione, ruota fisicamente contro un perno che viene inserito nel suo centro e un sensore di torsione elettromeccanica misura la crescente forza viscoelastica del coagulo. Questo saggio viene in genere effettuato alla temperatura fisiologica di 37 gradi centigradi; tuttavia, la temperatura può essere regolata manualmente sullo strumento. L'ampiezza massima (MA), la velocità di reazione (R), il tempo di cinetica (K), l'angolo di z (Angolo) e il tempo di ampiezza massima (TMA) vengono estratti dal software TEG dal tracciamento DINAMICO TEG. Questi valori vengono in genere confrontati con intervalli normali clinici per valutare lo stato di coagulazione di un paziente. Mentre TEG non è esattamente un viscometro, in quanto misura la forza del coagulo in unità millimetriche, fornisce importanti dati di coaguli viscoelastici e funziona come un prezioso strumento decisionale clinico per i medici per decidere di amministrare specifici prodotti sanguigni e regolare il dosaggio terapeutico¹³. Quando si utilizzano insieme sia i saggi TEG che i saggi di torbidità, forniscono informazioni complementari sulla caratterizzazione dei coaguli, poiché la forza del coagulo e la cinetica sono facilmente estratte dallo spessore della fibra teG e lo spessore della fibra di fibrina è accessibile mediante misurazioni ottiche della torbidità.

Poiché la fibrina è una componente critica di un coagulo di sangue, la caratterizzazione del coagulo di fibrina in diverse condizioni di formazione dei coaguli può fornire preziose informazioni su come una variabile specifica contribuisce al processo di formazione del coagulo e alle proprietà finali del coagulo. Comprendere questo può fornire indicazioni per la diagnosi di trombosi e lo sviluppo di terapie. Per ottenere una caratterizzazione del coagulo di fibrina più rappresentativa, il plasma può essere sostituito per monitorare la formazione di coaguli in quanto assomiglia più da vicino alle condizioni di coagulazione in vivo rispetto a un sistema di modelli fibrinogeni/trombini semplificato. Tuttavia, a causa dell'intricata natura della cascata di coagulazione, la formazione di coaguli utilizzando il plasma aumenta la complessità, rendendo più difficile isolare l'impatto dei singoli fattori. L'utilizzo di un modello semplificato di fibrinogeno/trombo impedisce la necessità di avviare l'intera cascata di coagulazione consentendo l'isolamento della fase finale della formazione della fibrina. Includendo due componenti di formatura di fibrina principali (fibrinogeno e trombano), questa configurazione crea una condizione di formazione del coagulo altamente controllata. È anche importante notare che, mentre qui viene utilizzato il modello di coagulo semplificato, questo protocollo può essere utilizzato anche per caratterizzare coaguli più complessi includendo ulteriori fattori di coagulazione. In questo studio, la caratterizzazione del coagulo di fibrina utilizzando torbidità e TEG viene effettuata variando concentrazioni di fibrinogeno e trombano, forza ionica, pH e concentrazione totale di proteine nella soluzione di coagulazione per imitare diverse circostanze di coagulazione in vivo¹⁴. I dettagli relativi a queste variazioni del protocollo sono stati inclusi nella Sezione 5.

Protocol

1. Preparazione della salina tampone di fosfati (PBS)

NOTA: PBS è stato utilizzato in tutto questo studio in quanto gli saggi descritti non richiedevano l'aggiunta di calcio. È importante notare che quando si aggiunge calcio, spesso utilizzato per ri-calcificare i prodotti sanguigni citratti, PBS dovrebbe essere evitato come calcio è noto per precipitare in tamponi di fosfati.

1. Fare un tampone di 0,01 M, pH 7,4 PBS mescolando 137 mM di cloruro di sodio, 1,8 mM di monobasico di fosfato di potassio, 10 mM dibasico di sodio e cloruro di potassio 2,7 mM in acqua DI.
2. Verificare il pH tampone utilizzando una sonda pH e regolare il pH utilizzando idrossido di sodio o acido cloridrico in base alle esigenze.
3. Utilizzare questo PBS per la preparazione di fibrinogeno e saggi di coagulazione (se non diversamente specificato).
   NOTA: Si suggerisce di ricostituire la polvere di fibrinogeno poiché la reidratazione nell'acqua DI può provocare precipitazioni di fibrinogeno anche a 37 gradi centigradi.

2. Preparazione e stoccaggio delle proteine

NOTA: Nel corso del protocollo le concentrazioni di stock proteico vengono preparate a diverse concentrazioni per torbidità e TEG per consentire il rapporto costante di sale, acqua DI, PBS e altri fattori residui nelle soluzioni di coagulazione finali.

1. Preparazione e conservazione del fibrinogeno
   NOTA: I contaminanti nei fibrinogeni disponibili in vendita includono una quantità significativa di fattore XIII, quantità residue di altri fattori di coagulazione, tampone di stoccaggio e sali. In presenza di calcio, fattore XIII è noto per crosslink la rete di coaguli di fibrina. Questo effetto contribuisce a una struttura di coaguli serrata e a una maggiore resistenza al coagulo che influisce sulla caratterizzazione della fibrina. I kit di attività disponibili in modo commerciale possono essere utilizzati per determinare i livelli di fattore attivo XIIIa. Per ridurre al minimo la variabilità causata dal fattore XIIIa, gli esperimenti devono essere progettati con l'esclusione del calcio o ulteriori passaggi per rimuovere il fattore XIIIa dovrebbero essere incorporati in questo protocollo. Inoltre, è necessario valutare il sale di immagazzinamento delle proteine e il tipo di tampone e, se necessario, eseguire la dialisi per il trasferimento in un buffer di lavoro di analisi preferito.
   1. Pesare e aliquot polvere di fibrinogeno licofilizzato (bovino o umano) in tubi da 2 mL a 20 mg di proteine per tubo e conservare le quotte a -20 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.
   2. Lasciare che il fibrinogen aliquot si acclimata a RT (temperatura ambiente) per 10 minuti il giorno dell'esperimento. Ricostituire il fibrinogeno aggiungendo 600 L di PBS all'aliquot 20 min prima dell'uso.
   3. Prendere 10 L di fibrinogeno e diluirlo con 190 L di PBS in una piastra UV trasparente a 96 po ' o una cuvette. Determinare la concentrazione di fibrinogeno prendendo l'assorbimento a 280 nm tramite uno spettrometro commerciale e il suo software.
   4. Calcolare la concentrazione di fibrinogeno (mg/mL) utilizzando la legge della birra. Preparare le soluzioni di stock di fibrinogeno da 12 mg/mL (per i test di torbidità) e 3,2 mg/mL (per TEG) per un'ulteriore diluizione con PBS (se non diversamente specificato).
      NOTA: Determinazione della concentrazione di fibrinogeno (mg/mL) dalla legge della birra:
      
      Coefficiente di estinzione molare: ɛ 513.400 L mol^-1 cm^-1 a 280 nm; Lunghezza del percorso (L); Fattore di diluizione (D); Il peso molecolare (MW) - 340.000 Da. ɛ è derivato moltiplicando E^0,1% - 1,51 (280 nm) (coefficiente di estinzione, dato dal fornitore) con MW.
2. Preparazione e stoccaggio della tromba
   1. Trombose lyophilized ricostituito (bovino o umano, 1000 U stock) in 200 L di acqua deionizzata (DI) per fare 200 L di 5000 U/mL soluzione di stock di trombino.
   2. Fare 5 aliquots (20 U/tube) della soluzione e mantenere gli aliquots congelati a 20 gradi centigradi.
   3. Scongelare gli aliquots tromboni a RT per 15 min il giorno dell'esperimento e fare la soluzione di lavoro trombante diluizione a 20 U/mL per saggi di torbidità e 18 U/mL per TEG con acqua DI (se non diversamente specificato).
      NOTA: Precauzioni devono essere prese per mantenere l'attività enzimatica che può essere eseguita mantenendo gli enzimi sul ghiaccio durante lo scongelamento e l'uso; tuttavia, nessuna riduzione dell'attività di tromba è stata osservata quando utilizzata direttamente dopo lo scongelamento a RT.

3. Turbidità

1. Utilizzare qualsiasi spettrometro disponibile in modo commerciale con un intervallo di assorbimento di 350 - 700 nm e un software corrispondente per monitorare la torbidità del coagulo nel tempo (vedere Tabella dei materiali).
2. Accendere lo spettrometro e aprire il software di analisi corrispondente.
3. Selezionare la piastra 1 e aprire la scheda Impostazioni piastra. Fare clic su Modalità ABS e Cinetico per monitorare una lettura dinamica dell'assorbimento nel tempo.
4. Selezionare 550 nm (o qualsiasi valore compreso tra 350 e 700 nm) nella scheda Lunghezza d'onda e regolare il tempo di esecuzione totale in modo che sia di 60 min con un intervallo di 30 s nella scheda temporizzazione. Selezionare i pozzetti di interesse per la lettura evidenziando i pozzetti. Se necessario, regolare altre impostazioni.
   NOTA: La selezione di una lunghezza d'onda all'estremità inferiore dell'intervallo (circa 350 nm) porta una migliore sensibilità, ma l'assorbimento potrebbe anche superare il limite di rilevamento dello spettrometro. La lunghezza d'onda più comunemente utilizzata per la misurazione della torbidità è di 405 nm in letteratura; tuttavia, questo protocollo utilizza 550 nm per garantire che i valori di torbidità dinamica siano entro il limite di rilevamento per tutti gli esperimenti. L'intervallo di lettura selezionato deve essere il più breve possibile per ottenere il massimo livello di sensibilità al saggio. Questo dipenderà dallo spettrometro e dal numero di pozzi letti durante un dato saggio.
5. Prendere una piastra UV trasparente a 96 po '. Pipette 140 PBS in un pozzo selezionato per la lettura. Aggiungere e mescolare 10 L di tromba (20 U/mL) nel pozzo.
   NOTA: Non utilizzare piastre di analisi ad alta legante per ridurre al minimo il legame proteico non specifico alla superficie del pozzo. Questo potrebbe influenzare la dispersione delle proteine nella soluzione e provocare un'elevata variabilità del saggio.
6. Iniziare immediatamente la coagulazione aggiungendo 50 L di fibrinogeno (12 mg/mL) nel pozzo per ottenere una soluzione di coagulazione di 200 lL con una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno e 1 trombo U/mL. Mescolare il contenuto nel pozzo pipettando su e giù cinque volte facendo attenzione a evitare la creazione di bolle nella soluzione in quanto avranno un impatto sull'assorbimento disperdendo la luce.
   NOTA: Utilizzare una pipetta multicanale quando si eseguono più campioni di coagulo sulla stessa piastra contemporaneamente. Registrare le differenze di tempo tra i pozzetti e il periodo di tempo prima della prima lettura dallo strumento per compensare i tempi di coagulazione.
7. Posizionare la piastra 96-well nel supporto e fare clic su Start nel software per avviare la lettura torbidità a RT.
   NOTA: Se si effettua il test ad una temperatura elevata, lo spettrometro, la piastra e i reagenti devono essere tutti mantenuti alla temperatura desiderata prima dell'inizio del coagulo.
8. Una volta completati, recuperare i dati di torbidità e ottenere una curva di tracciamento della torbidità tracciando la modifica dell'assorbimento nel tempo in un software di plottaggio.
9. Derivare Turb^Max (massima torbidità indicativa dello spessore della fibra di fibrina e densità di rete di fibrina) prendendo il valore massimo di assorbimento della curva nel tempo.
   NOTA: il rapporto massa/lunghezza in fibra di fibrina può essere calcolato in base ai valori di torbidità utilizzando l'equazione fornita nel seguente manoscritto⁸.
10. Calcola la torbidità massima del 90% moltiplicando Turb^Max per il 90%. Derivare Il tempo^Turb dal tempo di calcolo dall'avvio del coagulo al 90% di torbidità massima.
    NOTA: Il tempo al 90% di torbidità massima è una metrica più affidabile del tempo alla massima torbidità assoluta in quanto rappresenta meglio il tempo di coagulo eliminando il periodo di formazione del coagulo finale altamente variabile. Ulteriori parametri di coagulazione come il tempo di insordetta del coagulo (tempo dall'inizio del test a quando l'assorbimento inizia ad aumentare) e il tasso di formazione dei coaguli (Vmax, la pendenza più grande della regione lineare nella curva di tracciamento della torbidità) possono anche essere estratti dalle tracciazioni di torbidità.

4. Tromboelastografia (TEG)

1. Accendere l'analizzatore di tromboelastografo e attendere che la temperatura si stabilizzi a 37 gradi centigradi.
2. Aprire TEG - software. Una volta effettuato l'accesso, crea un nome di esperimento nella sezione ID.
3. Eseguire un e-test per tutti i canali seguendo le istruzioni del software sullo schermo. Posizionare la leva nella posizione di carico una volta completati tutti i controlli.
   NOTA: È necessario un test e-test TEG che deve essere condotto ogni volta che si utilizza lo strumento. I test di controllo della coagulazione TEG (utilizzando i controlli TEG di livello 1 e di livello 2) sono necessari a intervalli suggeriti dal produttore quando vengono utilizzati per campioni clinici.
4. Fare clic sulla scheda TEG, immettere informazioni di esempio per i canali che verranno utilizzati. Inserire una tazza TEG trasparente non rivestita nel canale corrispondente. Far scorrere il supporto verso l'alto e premere la tazza inferiore 5 volte per apporre il perno alla canna da torsione. Abbassare il supporto e premere la tazza verso il basso nella base del vettore fino a quando non "clic".
5. Pipette 20 L di soluzione di tromba (18 U/mL) nella tazza TEG. Iniziare immediatamente la coagulazione aggiungendo 340 L di fibrinogeno (3,2 mg/mL) nella tazza TEG per ottenere una soluzione di coagulazione di 360 L con una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno e 1 tromba U/mL nella tazza. Mescolare il contenuto pipettando su e giù cinque volte.
   NOTA: I potenziali fattori di coagulazione o altri componenti di interesse devono essere aggiunti durante questa fase facendo attenzione a mantenere sempre un volume finale di 360 L nella coppa TEG.
6. Far scorrere il supporto caricato tazza verso l'alto, spostare la leva nella posizione di lettura e fare clic su Avvia nel software per avviare la lettura TEG.
7. Una volta completato IL TEG (dopo circa un'ora), recuperare i parametri TEG e ottenere una curva di ricalco TEG tracciando l'ampiezza nel tempo in un software di plottaggio.
8. Raccogliere MA come TEG^Max (l'ampiezza massima è indicativa della forza del coagulo) e TMA come tempo^TEG (tempo alla massima ampiezza) dal software.
   NOTA: MA è calcolato dal software come l'ampiezza massima al momento in cui l'ampiezza ha meno di una deviazione del 5% in un periodo di tempo di 3 minuti. La TMA viene determinata come il tempo dalla velocità massima di generazione del trombo (vicino al punto di divisione) all'oggetto MA. Altri parametri potrebbero anche essere utili per valutare quando si esegue l'analisi del coagulo. Alcuni esempi di questi parametri includono: R-time (il tempo dall'inizio del test a quando l'ampiezza raggiunge 2 mm), K (il tempo dalla fine di R a quando l'ampiezza raggiunge i 20 mm), alfa (pendenza della linea tra R e K) e CLT (tempo di lisi del coagulo).

5. Caratterizzazione della fibrina in diverse condizioni di coagulazione

NOTA: Eseguire esperimenti di caratterizzazione della fibrina modulando una variabile specifica nelle soluzioni di coagulazione come: concentrazioni di fibrinogeno e trombano, forza ionica, pH e concentrazioni totali di proteine. I preparativi sperimentali con queste variabili di esempio sono descritti in questa sezione; tuttavia, possono essere sostituiti anche altri fattori di coagulazione e condizioni di interesse. Selezionare con attenzione un sistema di buffer adatto tenendo conto di ogni requisiti di analisi unici. Per i test di torbidità e TEG, includere un controllo solo buffer per garantire una sottrazione accurata dello sfondo durante l'analisi dell'effetto di queste variabili.

1. Concentrazione variabile di fibrinogeno (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
   1. Regolare il punto 2.1.4 per preparare lo stock di fibrinogeno a concentrazioni diverse (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL per i saggi di torbidità e 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL per TEG).
   2. Regolare il passo 3.6 per "aggiungere 50 fibrinogeno 50 L (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL) in più pozzetti del pozzo 96" per i saggi di torbidità.
   3. Regolare il passo 4.5 per "aggiungere 340 fibrinogeno L (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL) in coppe TEG chiare" per TEG.
2. Concentrazione di tromba variabile (0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1, 2.5, 5, 10 U/mL)
   1. Regolare il punto 2.2.3 per preparare lo stock di tromba a concentrazioni diverse (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL per saggi di torbidità e 1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL per TEG).
   2. Regolare il passo 3.5 per "aggiungere 10 trombo di L (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) in più pozzi del 96 well-plate" per i saggi di torbidità.
   3. Regolare il passo 4.5 in "pipette 20 N. 20 N. L (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL) in coppe TEG chiare" per TEG.
3. Potenza ionica variabile (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 e 0,3 M)
   1. Sciogliere il cloruro di sodio (21, 101, 111, 121, 131, 141 e 271 mM) insieme a 1,8 mM di monobasic di fosfato di potassio, 10 mM dibasic di sodio e cloruro di potassio 2,7 mM in acqua DI per realizzare soluzioni PBS da 0,01 M con diverse forze ioniche.
   2. Regolare il passo 1.3 per utilizzare PBS realizzato a diversi punti di forza ionici per preparare soluzioni di fibrinogeno e coagulazione sia per i saggi di torbidità che per teG.
4. PH variabile (5.8, 6.6, 7.3, 7.4, 7.5 e 8.0)
   1. Sciogliere il fosfato di sodio (0.7, 3.2, 7.7, 8.1, 8.4, 9.5 mM) e il monobasico di fosfato di potassio (8.2, 6.0, 2.0, 1,7, 1,4, 0,5 mM) insieme a 2,7 mM di cloruro di potassio e cloruro di sodio (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) per realizzare soluzioni PBS da 0,01 M con pH variabile e una forza ionica finale a 0,165 M.
   2. Verificare il valore del pH del buffer tramite la sonda pH e regolare il pH, se necessario.
   3. Regolare il passo 1.3 per utilizzare PBS realizzato a diversi pH per preparare la soluzione di fibrinogeno e coagulazione sia per i saggi di torbidità che per teG.
5. Concentrazione di albumina variabile (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
   1. Sciogliere 2 g di albumina lolia in 500 L di PBS a RT per 20 min il giorno dell'esperimento.
   2. Determinare la concentrazione di albumina utilizzando la stessa procedura di cui ai punti 2.1.3 e 2.1.4 con un coefficiente di estinzione mol di 43.800 L^{mol 1} cm¹ (a 280 nm) per l'albumina.
   3. Preparare lo stock di albumin a diverse concentrazioni.
   4. Regolare il passo 3.5 su "Pipette 40 PBS in un pozzo selezionato per la lettura e aggiungere 10 tromba L (20 U/mL)". Regolare il passaggio 3.6 su "Avviare immediatamente la coagulazione aggiungendo 50 fibrinogeno l(12 mg/mL) con 100 albumina L (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) in pozzi multipli ad una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno, 1 trombina U/mL e 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumin nei pozzi."
   5. Regolare il passaggio 4.5 su "Avviare immediatamente la coagulazione aggiungendo una miscela di albumina da 200 72, 90, 108, 144, 180 mg/mL) e 140 L 7,7 mg/mL fibrinogen nelle tazze TEG per ottenere una soluzione di coagulazione a 360 L con una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno, 1 tromba U/mL e 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumina nelle tazze TEG."

Results

Gli esperimenti mostrati nella Figura 1 sono curve rappresentative di torbidità che tracciano le curve dei coaguli di fibrina umana e bovina a diversi livelli di fibrinogeno. Nella Figura 2 sono illustrate le curve di tracciamento TEG rappresentative per la formazione di coaguli di fibrina a diversi livelli di fibrinogeno. Entrambe le curve di tracciamento dimostrano che dopo un periodo di ritardo dopo l'iniziazione del coagulo, la torbidità del coagulo o l'ampi...

Discussion

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di due distinti strumenti di caratterizzazione del coagulo che testano un modello semplificato di coagulo fibrinogen/trombo utilizzando componenti disponibili in modo commerciale. Sia TEG e turbidity saggi sono facili da condurre. Non solo forniscono esami del coagulo del punto finale come la formazione di coaguli max (Turb^Max e TEG^Max) e i tempi di formazione dei coaguli (Tempo di^Turb e Tempo^TEG),ma valutano anche il processo di formazione...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropiastra trasparente ai raggi UV a fondo piatto a 96 pozzetti	Corning	3635	Copolimero acrilico non trattato, albumina non sterile
da siero umano	Millipore Sigma	A1653	≥ 96%, polvere liofilizzata
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI fonte idrica Albumina
sierica bovina	Millipore	Sigma A2153	≥ 96%, polvere liofilizzata
Tazze e spilli monouso per TEG 5000 (trasparente)	Haemonetics	REF 6211
Fibrinogeno, plasma bovino	Millipore	Sigma 341573	contiene oltre il 95% di proteina coagulabile
Fibrinogeno, plasma umano impoverito di plasmingogeno	Millipore Sigma	341578	Contiene ≥ 95% di proteine coagulabili.
Soluzione salina tamponata con fosfato	Millipore Sigma	P3813	in polvere, pH 7,4, per la preparazione di soluzioni da 1 L
Cloruro di potassio	Millipore Sigma	60130	≥ Purezza 99,5%
Fosfato di potassio monobasico	Millipore Sigma	P9791	≥ Purezza 98%
Misuratore di pH SevenEasy	Mettler Toledo	S20
Cloruro di sodio	Millipore Sigma	71378	≥ Purezza 99,5%
Sodio fosfato bibasico	Millipore Sigma	71636	≥ Purezza del 99,5%
Sistema di lettura di micropiastre multi-rilevamento SpectraMax M5	Molecular Devices	M5
TEG 5000 Thrombelastograph Sistema di analisi dell'emostasi	Haemonetics	07-022
Trombina, Millipore bovino	Sigma	605157
Trombina, Plasma umano, Alta attività	Millipore Sigma	605195