Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Sommario

Mostriamo l'automazione delle colture di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e delle differenziazioni neuronali compatibili con l'imaging e l'analisi automatizzati.

Abstract

I protocolli manuali di coltura e differenziazione per le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono difficili da standardizzare, mostrano un'elevata variabilità e sono soggetti a differenziazione spontanea in tipi di cellule indesiderate. I metodi sono ad alta intensità di lavoro e non sono facilmente suscettibili a esperimenti su larga scala. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un sistema automatizzato di coltura cellulare accoppiato a un sistema di imaging ad alta produttività e implementato protocolli per mantenere più linee hiPSC in differenziazione parallela e neuronale. Descriviamo l'automazione di un protocollo di differenziazione a breve termine utilizzando l'espressione sovra-espressione Neurogenin-2 (NGN2) per produrre neuroni corticali derivati dall'hiPSC entro 6\u20128 giorni e l'implementazione di un protocollo di differenziazione a lungo termine per generare neuroni dopaminergici midbrain (mDA) derivati dall'hiPSC entro 65 giorni. Inoltre, abbiamo applicato l'approccio NGN2 a una piccola molecola di cellule precursori neurali derivate (smNPC) trasdotto con lentivirus GFP e stabilito un saggio di crescita automatica della neurite a cellule vive. Presentiamo un sistema automatizzato con protocolli adatti alla coltura hiPSC di routine e alla differenziazione in neuroni corticali e dopaminergici. La nostra piattaforma è adatta per la cultura a lungo termine a mani libere e gli screening a base di hiPSC ad alto contenuto / alta produttività, RNAi e CRISPR / Cas9 per identificare nuovi meccanismi di malattia e obiettivi farmacologici.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) si rinnovano e possono differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule adulte. Queste caratteristiche rendono l'hiPSC uno strumento utile per la modellazione delle malattie nella ricerca di base e nella scoperta di^{farmaci 1}. L'iPSC umano mantiene il background genetico del donatore che consente di derivare tipi cellulari rilevanti per la malattia che sono più colpiti / coinvolti nel decorso della malattia, ad esempio diversi sottotipi neuronali per le malattie neurodegenerative^2,3. Inoltre, hiPSC supera alcuni dei limiti dei modelli di sovra-espressione animale e cellulare modellando le malattie in un contesto umano e i livelli fisiologici di espressione proteica e si sono dimostrati una risorsa preziosa nella modellazione di malattie che vanno da disturbi monogenici, complessi ed epigenetici, nonché malattie ad esordio tardivo⁴.

Nonostante questi vantaggi e opportunità, diverse limitazioni dell'hiPSC devono ancora essere affrontate. Gli attuali protocolli di coltura e differenziazione hiPSC non sono convenienti, difficili da standardizzare e richiedono molto lavoro. Le fasi manuali della coltura possono comportare un'elevata variabilità nei rendimenti e nei fenotipi a causa delle differenze di crescita e differenziazione spontanea dell'hiPSC. Pertanto, la variazione dipendente dallo sperimentatore deve essere ridotta implementando tecniche di movimentazione più standardizzate e semplificando i protocolli che possono essere ottenuti utilizzando l'automazione⁵. L'istituzione di protocolli automatizzati di cultura e differenziazione hiPSC stabiliremo standard comuni per progetti di ricerca accademica e industriale e consentiranno la generazione di modelli di malattia biologicamente rilevanti e risultati più riproducibili.

Lavori precedenti hanno tentato l'automazione delle colture hiPSC^6,7,^{8 ma}i loro protocolli sono stati limitati a specifici formati di lastre di coltura cellulare dipendenti dal sistema e privi di adattabilità ai diversi formati di dosaggio. Tali sistemi sono utili nella carica di cellule, ma potrebbero non essere adatti per la differenziazione automatizzata nei tipi di cellule desiderati, fenotipizzazione delle malattie e scopi di screening. Inoltre, è stata descritta una piattaforma automatizzata su larga scala per la derivazione, la generazione e la differenziazione dei fibroblasti^9, ma su una scala che può essere raggiunta solo da laboratori ad alta produttività dedicati alla produzione di linee che sembrano attraenti ma possono essere inaccessibili per molti laboratori accademici.

Abbiamo sviluppato un sistema di coltura cellulare completamente automatizzato basato su una stazione di movimentazione dei liquidi in un ambiente filtrato hepa (High-Efficiency Particulate Air) in combinazione con un incubatore di CO 2 di_{grande capacità,} un citometro di imaging a campo brillante e un braccio robotico per il trasporto delle lastre. Questi componenti forniscono la base per una coltura e una differenziazione hiPSC stabili e riproducibili. Abbiamo integrato il sistema con un sistema di archiviazione automatizzato a -20 °C per lo stoccaggio di composti o virus e un imager a celle vive confocale a disco rotante ad alta velocità. Sono stati generati protocolli su misura che consentono il seeding automatico delle cellule, le modifiche dei supporti, i controlli di confluenza, l'espansione delle celle e la generazione di lastre di dosaggio con il trattamento del campione e l'imaging delle lastre, rendendo il sistema compatibile con screening ad alto contenuto / ad alta produttività. La coltura cellulare automatizzata e il sistema di imaging sono gestiti utilizzando il software di controllo e l'interfaccia utente grafica (GUI) su misura. La GUI consente agli utenti di importare file CSV contenenti parametri specifici della riga di cella necessari per l'esecuzione del metodo. Inoltre, la GUI consente di pianificare numerosi esperimenti in qualsiasi sequenza utilizzando la visualizzazione calendario integrata, consentendo così il pieno controllo del tempo di avvio di ogni metodo.

Il nostro sistema automatizzato di coltura cellulare utilizza velocità di pipettaggio standardizzate, tempi di passaging, soglie di confluenza, densità di semina e volumi medi con la flessibilità di coltura delle celle in una varietà di formati di piastre (formato piastra da 96, 48, 24, 12, 6 o 1 pozzo). Abbiamo adattato un protocollo di differenziazione a breve termine recentemente pubblicato per convertire hiPSC in neuroni in grado di produrre neuroni positivi TUBB3 in 6^{giorni 10,11}. Abbiamo anche stabilito la differenziazione automatizzata e l'imaging delle cellule precursori neurali di piccole molecole (smNPC) in neuroni che esprimono costitutivamente GFP sotto il promotore EF1a¹² e iPSC nei neuroni dopaminergici midbrain (mDA), adattando un protocollo di inibizione dual-SMAD^{precedentemente pubblicato 13} che produce neuroni mDA entro 65 giorni.

Protocollo

1. Procedure di base per l'automazione delle colture cellulari e l'imaging

1. Carica nuove piastre e punte di coltura
   1. Aprire l'interfaccia utente grafica e fare clic sul pulsante di visualizzazione processo risorsa/strumento. Per eseguire qualsiasi processo di risorsa/strumento, selezionare il processo risorsa/strumento e fare clic sul pulsante Esegui processo strumento.
   2. Eseguire il processo di risorse RunHepaHood e Reloading (vedere il passaggio 1.1.1). Aprire la porta, caricare le piastre di coltura cellulare e le punte monouso nella posizione corrispondente come indicato nell'immagine pop-up sul PC di controllo.
   3. Pulire la porta con il 70% di etanolo per la decontaminazione e chiuderla. Eseguire il processo dello strumento Decontaminazione dalla GUI (vedere il passaggio 1.1.1). Il sistema viene sterilizzato dalle radiazioni UV per 30 minuti.
2. Riempire i mezzi di coltura e/o il reagente di dissociazione
   1. Eseguire il passaggio dello strumento RunHepahood (vedere il passaggio 1.1.1). Aprire la porta d'ingresso della stazione di movimentazione dei liquidi. Serbatoi decontaminati (contenenti supporti, PBS e/o reagente di dissociazione) con etanolo al 70% e posizionarli sul ponte al posittone assegnato (come definito nel file cfg.csv). De-coperchio i serbatoi.
   2. Decontaminare la porta con il 70% di etanolo e chiuderla. Potenzia il cofano HEPA eseguendo il processo risorsa/strumento "InitHepaHood" dalla GUI.
3. Creare una nuova "linea di celle" e proiettare nell'interfaccia utente grafica
   1. Creare/modificare i file "Cell line" definiti dall'utente costituiti dai file Config (*.cfg.csv), import (*.imp.csv), resource (*.rsv.csv) e workflow (*.wfl.csv).
   2. Aprire l'interfaccia utente grafica e creare una nuova "riga cella" facendo clic sul pulsante Aggiungi riga di cella nella visualizzazione "Editor di linee di celle". Viene aperta una procedura guidata in cui è necessario selezionare il file Config e immettere un nome di progetto con una breve descrizione.
   3. Spostarsi all'interno di questa procedura guidata utilizzando la punta della freccia verde e confermare le impostazioni facendo clic sul segno di spunta verde. Creare un nuovo progetto per la "riga cella" generata facendo clic sul pulsante Aggiungi progetto.
   4. Immettere il nome e la descrizione di un progetto e definire un colore di progetto che sarà visibile nella visualizzazione calendario dell'interfaccia utente grafica. Passare alla pagina successiva della procedura guidata facendo clic sulla punta della freccia.
   5. Creare un nuovo batch facendo clic sul pulsante Aggiungi batch e dando un breve nome e descrizione nella finestra popup. Selezionare tutti i passaggi del processo e pianificare l'ora di inizio per ogni passaggio del processo. Chiudere la finestra facendo clic su OK.
4. Eseguire un metodo automatizzato utilizzando la GUI
   1. Passare alla visualizzazione calendario dell'interfaccia utente grafica e fare clic sul pulsante Aggiungi passaggio processo.
   2. Selezionare la riga Cella e dopo aver passare alla pagina successiva della procedura guidata scegliere il progetto. Contrassegnare il batch da utilizzare e fare clic sulla punta della freccia rivolta a destra. A seconda del metodo utilizzato, i lotti devono essere vuoti (per ricevere nuove piastre) o contenere piastre di coltura o piastre di dosaggio (tutti gli altri processi).
   3. Passare alla pagina successiva della procedura guidata e selezionare il passaggio di processo che deve essere eseguito. Passare all'ultima pagina della procedura guidata e pianificare l'esperimento. Nella sezione "Dettagli parametro" è possibile modificare le variabili necessarie per eseguire il metodo. Confermare facendo clic su OK.
5. Caricamento delle piastre di coltura e dosaggio nell'incubatore di CO₂
   NOTA: Le piastre a 1 pozzo sono definite come piastre di coltura poiché sono comunemente utilizzate per le celle sfuse. Tutte le piastre multi-pozzo sono definite piastre di dosaggio.
   1. Eseguire il processo dello strumento "RunHepaHood" dalla GUI come descritto nel passaggio 1.1.1. e aprire la porta davanti al braccio robotico.
   2. Pulire il fondo delle piastre di dosaggio con 70% di etanolo e un tessuto privo di pelucchi se le piastre sono caricate per l'imaging automatizzato. Posizionare le piastre di coltura o di dosaggio sullo scaffale sinistro. Assicurarsi che l'orientamento della piastra sia corretto. Per le piastre di dosaggio, bene A1 deve puntare verso il braccio robotico mentre i bordi delle piastre di coltura devono puntare a destra.
   3. Pulire la porta con il 70% di etanolo per la decontaminazione e chiuderla.
   4. Eseguire il metodo "Caricamento di piastre di coltura" per l'importazione di piastre a 1 pozzo o "caricamento di piastre di dosaggio" per l'importazione di piastre multi-pozzo come descritto al passaggio 1.4. Utilizzare un batch vuoto per eseguire entrambi i metodi. Se i codici a barre della piastra sono già presenti in questo lotto, deselezionarli facendo clic sulle caselle di controllo.
   5. Trasportare singole piastre dallo scaffale alla piattaforma di_{incubatore di} CO 2 utilizzando il braccio robotico. La stazione shuttle integrata recupera la piastra e la memorizza in uno dei rack dell'incubatore di CO_2. Le cellule sono mantenute a 37 °C e al 5% di CO₂.
6. Scarico di piastre dall'incubatore di CO₂
   1. Eseguire il metodo "Scarica piastre" (vedere il passaggio 1.4). Selezionare il lotto contenente le lastre che devono essere esportate. Le singole lastre possono essere selezionate con i loro codici a barre.
   2. Trasportare le piastre dall'incubatore di CO₂ al ripiano sinistro utilizzando il braccio robotico.
   3. Avviare il cofano HEPA utilizzando il processo dello strumento "RunHepaHood" come descritto al passaggio 1.1.1. e aprire la porta davanti al braccio robotico. Rimuovere le piastre, decontaminare la porta con il 70% di etanolo prima di chiuderla e alimentare il cappuccio HEPA.

2. Protocolli di automazione

1. Semina di lamiere da tubi
   1. Avviare la cappa HEPA eseguendo il processo dello strumento RunHepaHood (vedere il passaggio 1.1.1). Aprire la porta di fronte alla stazione di movimentazione dei liquidi. Inserire il tubo da 50 ml contenente la sospensione cellulare e de-coperchio il tubo.
   2. Aprire la porta di fronte al braccio robotico e caricare le piastre di coltura rivestite per ricevere le celle sullo scaffale. Decontaminare e chiudere entrambe le porte. Eseguire il metodo "Semina di piastre da tubi" (vedere fase 1.4).
   3. Contare le cellule nel citometro di imaging a campo luminoso utilizzando la funzione di conteggio diretto delle celle. Per il conteggio delle celle, utilizzare 16 pozzi e repliche in formato piastra a 384 pozzetti.
   4. Trasportare la piastra di conteggio a 384 pozzi dal ponte al citometro di imaging brightfield tramite il giradischi utilizzando il braccio robotico e avviare il processo di imaging. Il citometro determina automaticamente il numero di cellulare per millilitro. Riportare la piastra di conteggio nella sua posizione originale utilizzando il braccio robotico.
   5. Trasportare una coltura rivestita o una piastra di dosaggio dal ripiano al ponte di pipettazione utilizzando il braccio robotico. Rimuovere le celle di rivestimento e di seme nel numero definito dall'utente e il volume adatto al formato della piastra (vedere tabella 1). Spostare la piastra sullo shaker sul ponte per 10 s a 500 giri/min per la distribuzione cellulare e il trasferimento all'incubatore di CO_2.
2. Valutazione automatizzata della confluenza
   1. Eseguire il metodo "Check Confluency" come descritto nel passaggio 1.4. Selezionare un batch contenente almeno una piastra di coltura e nessuna piastra di dosaggio. Nella sezione "Dettagli parametro" inserire "iPSCf_2020" per le impostazioni di acquisizione e analisi delle immagini.
   2. Trasportare la prima piastra dall'incubatore di CO₂ al citometro di imaging a campo luminoso tramite il giradischi utilizzando il braccio robotico.
   3. Eseguire l'imaging delle cellule nel citometro di imaging a campo luminoso per il controllo della confluenza delle colonie hiPSC. Utilizzare l'applicazione "confluenza" e l'immagine 13 campi del patè a 1 pozzo e calcolare automaticamente l'area media occupata dalle celle.
   4. Trasportare la piastra all'incubatore di CO₂ utilizzando il braccio robotico. Ripetere i passaggi 2.2.2. al 2.2.4. per le piastre rimanenti.
3. Cambiamento dei supporti delle piastre di coltura o delle piastre di dosaggio
   1. Eseguire il metodo "Media Change Of Culture Plates" come descritto nel passaggio 1.4. e selezionare un lotto contenente solo lastre di coltura. Impostare la variabile che indica se vengono utilizzate punte o aghi per i passaggi di pipettazione nella sezione "Dettagli parametro". Per il cambio multimediale di qualsiasi piastra multi-pozzo, eseguire il metodo "Media Change Of Assay Plates" e selezionare un lotto contenente piastre di dosaggio.
   2. Trasportare le singole piastre dall'incubatore di CO₂ al ponte utilizzando il braccio robotico e de-coperchiare le piastre. Inclinare automaticamente le piastre e aspirare i vecchi supporti e scartarlo nel modulo di raccolta dei rifiuti. Aggiungere 12 mL di supporti freschi. Ri-coperchiare la piastra e trasportare le piastre all'incubatore di CO₂ utilizzando il braccio robotico.
4. Subcoltivazione
   NOTA: eseguire il processo dello strumento "RunHepaHood" dalla GUI come descritto al punto 1.1.1. e aprire la porta d'ingresso della stazione di movimentazione dei liquidi. Carico del supporto e del reagente di dissociazione nelle posizioni richieste (vedere fase 1.2). Se è necessario ricaricare i suggerimenti, utilizzare il "Ricaricamento" come descritto nel passaggio 1.1. Inserire un tubo da 50 ml per ricevere la sospensione cellulare e de-coperchio il tubo.
   1. Eseguire il metodo "Subcultivation Of Adherent Cells" (vedere il passaggio 1.4). Selezionare il batch contenente piastre di coltura che necessitano di subcoltivazione.
   2. Trasportare le piastre dall'incubatore di CO₂ al ponte utilizzando il braccio robotico e de-coperchiare le piastre. Inclinare automaticamente le piastre e rimuovere i vecchi supporti e scartarlo nel modulo di raccolta dei rifiuti. Lavare le celle una volta con 8 mL di PBS. Aggiungere 8 mL di EDTA da 0,5 mM per la passaging a base di ciuffo. Incubare sul ponte per 8 minuti.
   3. Rimuovere la soluzione EDTA dalle piastre e scartarla nel modulo di raccolta dei rifiuti. Aggiungere 12 mL di mezzo fresco e trasportare le piastre allo shaker. Agitare a 2000 giri/min per 1 minuto per spodestare le colonie.
   4. Triturare la sospensione cellulare per cinque cicli di pipettazione per rompere le colonie iPSC in una dimensione più piccola (~50\u201280 μm). Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml sul ponte. Le cellule di semi vengono automaticamente descritte nel passaggio 2.1.5 utilizzando un rapporto di divisione di 1 su 7.
      NOTA: passaging opzionale a cella singola. Generare una sospensione a cella singola utilizzando un reagente di dissociazione a cella singola (vedere Tabella dei materiali). Invece di 0,5 mM EDTA nella fase 2.4.2., utilizzare 8 mL di reagente di dissociazione a singola cellula e incubare per 20 minuti a 37 °C. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml e aggiungere lo stesso volume di supporti. La dissociazione con il reagente di dissociazione a singola cella richiede un passaggio manuale per pellettare le cellule. Cellule centrifughe a 300 x g per 3 min. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 12 ml del supporto richiesto e procedere con "Semina di piastre dai tubi" (vedere fase 2.1). Integrare il supporto con 2 μM tiazovivin il giorno della semina quando si utilizza la sospensione a cella singola degli iPSC.
5. Imaging automatizzato ad alto contenuto e ad alta produttività
   NOTA: L'impostazione di misurazione deve essere disponibile (cfr. file complementare 1: fase 1.1). Le lastre di dosaggio da immagini sono disponibili nell'incubatore.
   1. Eseguire il metodo "Imaging" (vedere il passaggio 1.4). Selezionare un batch contenente almeno una piastra di dosaggio e nessuna piastra di coltura. Nella sezione "Dettagli parametro", inserire il tipo di piastra, le definizioni di lastra (per le lastre di imaging standard a 96 pozzi: "Plate-96-20170918113842") e il nome dell'impostazione di misurazione.
   2. Trasportare la piastra di dosaggio tramite il giradischi al microscopio confocale automatizzato utilizzando il braccio robotico per avviare il processo di imaging. Recuperare la piastra alla fine dell'imaging dal microscopio e trasportarla all'incubatore di CO_2. Ripetere il processo delle piastre rimanenti nel lotto.

3. Manutenzione automatizzata ed espansione di hiPSC

1. La sequenza di controlli automatizzati della confluenza, i cambiamenti dei media e la subcoltivazione
   1. Cellule di semi su piastre a 1 pozzo utilizzando il metodo "Semina di piastre da tubi" (vedere fase 2.1). In alternativa, importare piastre a 1 pozzo sementi manualmente utilizzando il metodo "Carico della piastra di coltura" (vedere fase 1.5).
   2. Pianifica quotidianamente controlli automatizzati della confluenza per monitorare la crescita della colonia dal primo al giorno 6 della cultura per iPSC (vedi passaggio 2.2).
   3. Aggiornare i supporti ogni due giorni utilizzando il metodo "Modifica multimediale delle piastre di coltura" (vedere il passaggio 2.3). Vengono utilizzati 12 mL di mezzo per piastra.
   4. Il giorno 6 inizia il processo di "Subcultivazione" (vedere il passaggio 2.4.).

4. Differenziazione automatizzata

1. Neuroni NGN2 corticali da iPSC a corticali
   NOTA: Preparazione hiPSC manuale. Il protocollo prevede l'espressione troppo di NGN2 utilizzando vettori lentivirali per la consegna. Trasduci hiPSC con lentivirus NGN2 a rTTA3 in un rapporto 1:2 (> ~10⁷ TU/mL). Le cellule vengono quindi selezionate per un passaggio con puromicina 0,5 μg/mL. Un protocollo dettagliato per la generazione di linee hiPSC-NGN2 stabili è nel file complementare 1: fase 2.
   1. Procedere con il processo di "Subcultivazione" come descritto utilizzando il reagente di dissociazione a singola cella descritto nella nota del passaggio 2.4.4. quando hiPSC raggiunge la confluenza 70\u201280%
   2. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 12 mL di mezzi NGN2(Table of Materials)contenenti 2,5 μg/mL di dox e 2 μM di tiazovivin.
   3. Iniziare la differenziazione utilizzando il metodo "Semina di piastre datubi" (vedere fase 2.1). Impostare la densità di semina desiderata di iPSC su 30.000/cm² (vedere tabella 1). L'iPSC è placcato su piastre pre-rivestite con 0,1 mg/mL di poli-L-ornitina (PLO) e 5 μg/mL laminina.
      NOTA: Le piastre a 1 pozzo sono preferite per gli studi basati sull'RNA e sulla proteomica, mentre il formato della piastra a 96 po 'è preferito per gli esperimenti di imaging. Possono essere utilizzati anche altri formati di piastre di dosaggio come piastre da 48, 24, 12 o 6 pozzi.
   4. Il primo giorno di differenziazione, Aggiornare i supporti utilizzando il "Cambio media delle piastre di dosaggio (vedere fase 2.3) utilizzando il mezzo NGN2, integrato con 2,5 μg/mL dox e 10 μM N-[2S-(3,5-difluorofenil)acetil]-L-alanil-2-fenil-glicina, 1,1-dimetiltile estere (DAPT). Continuare con le modifiche multimediali ogni 2\u20123 giorni fino al giorno desiderato di differenziazione (vedere il passaggio 2.3).
   5. Il giorno 4 della differenziazione, effettuare un altro cambiamento mediatico (vedi fase 2.3.) utilizzando il mezzo NGN2 integrato con fattore neurotrofico derivato dal cervello 10 ng / mL (BDNF), 10 ng / mL fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali (GDNF) e 10 ng / mL fattore neurotrofico 3 (NT-3) per migliorare la maturazione. Al termine dell'esperimento, esportare le piastre di coltura dal sistema per gli esperimenti a valle (cfr. fase 1.6).
2. Cellule precursori neurali di piccole molecole (smNPC) ai neuroni NGN2
   NOTA: Derivare smNPC seguendo la versione adattata del protocollo^{pubblicato 12} (vedi File complementare 1: passaggio 5). Modificare il virus smNPC con NGN2 e rTTA3 (vedere File supplementare 1: passaggio 2). Un ciclo di trasduzione NGN2 e rTTA è sufficiente per generare una popolazione stabile. Modificare ulteriormente smNPC con il lentivirus pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 consentendo di eseguire il monitoraggio delle cellule vive. Una molteplicità di infezione (MOI) di 10 è usata per la trasduzione lentivirale della FPG.
   1. Passaggio smNPC al raggiungimento della confluenza utilizzando reagente di dissociazione a cella singola come descritto al passaggio 2.4. Nota.
   2. Cellule di semi che utilizzano il sistema automatizzato di coltura cellulare ad una densità cellulare di 50.000/cm² utilizzando il metodo "Semina di piastre da tubi" (vedere fase 2.1.) su piastre pre-rivestite con 0,1 mg/mL PLO e 5 μg/mL laminin nel mezzo NGN2 integrato con 2,5 μg/mL dox.
   3. Il giorno 3, eseguire un cambiamento multimediale (vedere il passaggio 1.3.) utilizzando un mezzo NGN2 fresco contenente 2,5 μg/mL dox e 10 μM DAPT. Dopo il terzo giorno, eseguire modifiche ai supporti ogni tre giorni con un mezzo NGN2 fresco contenente 2,5 μg/mL dox, BDNF, GDNF e NT-3 a 10 ng/mL ciascuno.
   4. Celle di immagini quotidiane utilizzando il metodo "Automated high content, high throughput imaging" (vedere il passaggio 2.5) per monitorare lo stato di differenziazione utilizzando GFP come lettura per la crescita della neurite. Impostare la potenza del laser sull'80% e utilizzare un tempo di esposizione di 30 ms. Acquisire un gran numero di campi (ad esempio, 25 campi) utilizzando l'obiettivo 20x.
3. Analisi delle immagini batch
   1. Eseguire l'analisi delle immagini con il software di analisi delle immagini 1, utilizzando il modello di crescita della neurite.
   2. Aprire il software. Selezionare l'opzione "Dati" e passare alla cartella dei dati di imaging, fare clic su OK per caricare i dati da analizzare. Fate clic su apri (Open) e dalla barra dei menu superiore selezionate protocollo (Protocol) e dal menu dell'applicazione selezionate nuova crescita. Vai agli "algoritmi" e usa il canale "488" per definire il nucleo, il corpo cellulare e la neurite. Regolare i parametri di soglia per ciascuno di essi.
   3. Selezionare i pozzi da utilizzare per l'analisi delle immagini. In basso a destra fare clic sul collegamento e selezionare le feature da analizzare, ad esempio la media del conteggio delle celle, il totale totale della lunghezza totale dell'ossatura. Procedere con "pre-analisi" seguita da "anteprima".
   4. Verificare se le impostazioni di anteprima sono accettabili e avviare l'analisi in modalità batch. I risultati sono disponibili nella cartella padre in "report" in .csv formato di file che può essere aperto in Excel.
      NOTA: lo script di analisi delle immagini è disponibile su richiesta.
   5. Traccia la lunghezza media della neurite ottenuta per lunghezza totale della neurite normalizzata al numero di cella.

5. Differenziazione automatizzata dell'hiPSC nei neuroni dopaminergici del midbrain (mDA)

1. Preparazione hiPSC manuale
   1. Dissociare l'hiPSC confluente 70\u201280% in singole celle utilizzando il reagente di dissociazione a singola cella. In breve, incubare cellule con reagente di dissociazione a singola cellula (100 μL/cm²) per 30 min a 37 °C, raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico, centrifugare a 200 x g per 5 minuti e rimosombiare il pellet cellulare in un mezzo di coltura iPSC.
   2. Seme 200.000 cellule/cm² su piastre extracellulari a matrice 1-pozza e mezzo di coltura iPSC integrato con 10 μM Y-27632. Cellule di coltura durante la notte a 37 °C e 5% CO₂.
2. Differenziazione automatizzata: Fase 1
   1. Preparare il sistema di impostazioni cultura automatizzate come descritto nel passaggio 1.1\u20121.2.
   2. Piastre di coltura del carico contenenti celle nell'incubatore di CO₂ del sistema di coltura automatizzato (vedere fase 1.5).
   3. Preparare il mezzo KSR (vedi Tabella dei materiali)e completare con piccole molecole (vedi tabella 2) necessarie per iniziare il giorno 0 di differenziazione. Utilizzare solo mezzi appena preparati con piccole molecole e fattori di crescita.
   4. Eseguire i cambiamenti multimediali delle piastre di coltura come descritto nel passaggio 2.3 nei giorni 0 e 1 di differenziazione e quindi ogni secondo giorno fino al giorno 25.
   5. A partire dal giorno 5, la formulazione dei mezzi di spostamento viene gradualmente descritta in dettaglio nella tabella 3.
   6. Il giorno 11, aggiungere il mezzo di differenziazione dei neuroni mDA integrato con CHIR (fino al giorno 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 e DAPT (vedi tabella dei materiali).
   7. Il giorno 25, scaricare le piastre (vedere il passaggio 1.6.)
3. Placcatura manuale 1
   1. Dissociare i precursori del giorno 25 mDA in singole cellule usando il reagente di dissociazione a singola cellula. In breve, incubare le cellule con reagente di dissociazione a singola cellula (100 μL/cm²) per 40 min a 37 °C, raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico, centrifugare a 200 x g per 5 minuti e rimostrare il pellet cellulare nel mezzo di differenziazione dei neuroni mDA.
   2. Seme 400.000 cellule/cm² in piastre di coltura a 1 pozzo pre-rivestite con 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL laminina e 2 μg/mL fibronectina nel mezzo di differenziazione neuronale mDA integrato con 10 μM Y-27632 (fino al giorno 26) e piccole molecole e fattori di crescita descritti nella tabella 2. Cellule di coltura durante la notte a 37 °C e 5% CO₂.
4. Differenziazione automatizzata: Fase 2
   1. Piastre di coltura del carico contenenti neuroni mDA nell'incubatore di CO₂ del sistema di coltura automatizzato come descritto al passaggio 1.5
   2. Preparare il mezzo di differenziazione dei neuroni mDA (vedi Tabella dei materiali)e completare con piccole molecole e fattori di crescita necessari per la differenziazione finale dal giorno 26 in poi (vedi tabella 2).
   3. Eseguire i cambiamenti multimediali delle piastre di coltura come descritto nel passaggio 2.3 il giorno 26 di differenziazione e quindi ogni 3\u20124 giorni fino al giorno 65.
      NOTA: Ai fini dell'imaging ad alta produttività, si consiglia di riporre i neuroni mDA in piastre a 96 po 'a bassa densità il giorno 32 di differenziazione, come descritto nel passaggio 5.5.
5. Placcatura manuale 2
   1. Scaricare le piastre di coltura come descritto al passaggio 1.6. Dissociare i neuroni mDA del giorno 32 in singole cellule come descritto nel passaggio 5.3.1.
   2. Seme 100.000 cellule/cm² in piastre a 96 pozza pre-rivestite con 0,1 mg/mL PLO, 10 μg/mL laminina e 2 μg/mL fibronectina nel mezzo di differenziazione dei neuroni mDA integrato con 10 μM Y-27632 (fino al giorno 33) e piccole molecole e fattori di crescita (vedi tabella 2). Cellule di coltura durante la notte a 37 °C e 5% CO₂.
   3. Il giorno 33, sostituire il mezzo con un mezzo di differenziazione dei neuroni DA appena preparato integrato con piccole molecole e fattori di crescita (senza Y-27632). Cambiare il supporto manualmente ogni 3\u20124 giorni fino al giorno 65.

6. Immunostaining, acquisizione e analisi automatizzate di immagini ad alta produttività

1. Colorazione a fluorescenza
   1. Eseguire l'immunostaining fluorescente come descritto nel file complementare 1: fase 4.
   2. Celle immagine come descritto nel file complementare 1: passaggio 1.2.
   3. Caricare i file di imaging generati dal sistema di imaging nel software di analisi delle immagini 2 (vedere Table of Materials) per ulteriori analisi delle immagini, come descritto al passaggio 6.2.
2. Analisi delle immagini utilizzando il software di analisi delle immagini 2
   1. Una volta caricati i file di imaging nel software di analisi delle immagini 2, vai alla funzione "analisi delle immagini" e costruisci l'algoritmo di analisi utilizzando il menu a discesa.
   2. Selezionare i nuclei utilizzando l'attività "trova nuclei", che rileva le regioni sull'immagine appartenenti ai nuclei cellulari (qui macchiati di Hoechst). Escludere i nuclei dalle cellule morte (nuclei pyknotic) fissando una soglia per l'area nucleare o il diametro.
   3. Selezionare il citoplasma cellulare usando il compito "trova citoplasma". Questo compito rileva le regioni attorno ai nuclei appartenenti al citoplasma cellulare. Includere solo celle ben segmentate. Escludere le cellule mitotiche, apoptotiche e mal segmentate. Rimuovere le celle che toccano il bordo dell'immagine.
   4. Aggiungere le attività "calcolare le proprietà morfologiche" e "calcolare le proprietà di intensità". I parametri morfologici includono il calcolo delle proprietà morfologiche come l'area per una regione di interesse. I parametri di intensità includono il calcolo delle proprietà di intensità come l'intensità media per una regione di interesse (ad esempio citoplasma dei neuroni).
   5. Selezionare una sottopopolazione (ad esempio, neuroni th positivi) della popolazione di input (tutti i citoplasmi selezionati) utilizzando una o più condizioni, morfologia e /o intensità.
      NOTA: Di solito, l'intensità viene scelta per i neuroni. Sulla base di controlli negativi, è possibile definire al di sopra di quale soglia di intensità i neuroni sono considerati positivi per TH.
   6. Definire i risultati dell'output. Questo è l'ultimo elemento costitutivo di ogni analisi. Definisce i valori di lettura del saggio per ogni pozzo di una piastra di coltura (risultati per pozzo).
   7. Eseguire l'analisi batch ed esportare i risultati. Normalizzare il numero di cellule positive al numero totale di nuclei e rappresentare i dati come percentuale di cellule positive.

7. Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR)

1. Eseguire il protocollo qRT-PCR come descritto nel file complementare 1: passaggio 3.

Risultati

Il nostro sistema automatizzato di coltura cellulare e imaging è stato progettato per ridurre al minimo l'intervento umano permettendoci di standardizzare la coltivazione dell'hiPSC e la differenziazione in diversi tipi di cellule come i neuroni dopaminergici corticali o midbrain (mDA). Una panoramica schematica del nostro sistema automatizzato di coltura cellulare con dispositivi di imaging integrati è illustrata nella figura 1. L'introduzione iniziale delle colture cellulari a questo sistema automatizzato di coltura cellulare può essere effettuata seminando automaticamente le cellule da un tubo da 50 ml o utilizzando il metodo "Caricamento delle piastre di coltura" o "Caricamento delle piastre di dosaggio" per l'importazione di coltura o piastre di dosaggio. Un componente centrale del nostro sistema è la stazione di movimentazione dei liquidi in cui vengono eseguite tutte le fasi di trasferimento del liquido come cambi di supporto o subcoltivazioni. Il layout del ponte personalizzato del gestore liquido è rappresentato nella figura 2. La stazione di movimentazione dei liquidi è dotata di quattro posizioni. È possibile trasferire fino a quattro piastre dall'incubatore al ponte, consentendo cambi di supporti paralleli. Poiché nel metodo di subcoltivazione, sia le piastre di coltura padre che figlia devono essere sistemate sul ponte, il numero massimo di piastre di coltura lavorate in parallelo è limitato a due. Una caratteristica importante della stazione di movimentazione dei liquidi è la possibilità di inclinare le piastre durante il cambio del supporto per la rimozione completa del supernatante di coltura cellulare. Inoltre, la stazione di movimentazione dei liquidi è dotata di agitatori per favorire la dissociazione enzimatica delle cellule durante l'esecuzione del protocollo di subcoltivazione. Il nostro sistema di coltura automatizzato è inoltre dotato di due sistemi di imaging: un citometro di imaging a campo luminoso per l'esecuzione di controlli di conteggio e confluenza delle celle e, quindi, il monitoraggio della crescita cellulare nel tempo, e un microscopio confocale a doppio disco rotante per immagini rapide, ad alto contenuto e ad alta risoluzione delle cellule.

Le colture hiPSC vengono monitorate quotidianamente per la crescita nel citometro di imaging a campo brillante e analizzate per la percentuale di confluenza. L'immagine brightfield nel pannello sinistro e nel pannello destro una maschera verde dall'analisi dell'immagine brightfield ottenuta con il citometro (Figura 3A). Nel corso del tempo si osserva una crescita omogenea dell'hiPSC, come dimostrano le percentuali di confluenza di due linee hiPSC (n = 4 piastre) coltivate in parallelo e sottoposte a controlli di confluenza dal primo al giorno 6(figura 3B). Una volta raggiunta la soglia impostata, l'hiPSC viene superato. Le linee cellulari sono state coltivate manualmente (m) o dal sistema di automazione (a) e osservate per il mantenimento della morfologia tipica delle cellule staminali per almeno due passaggi, immagini rappresentative dei campi luminosi(figura 4A). L'hiPSC coltivato manualmente (non mostrato) o nel sistema automatizzato presentava il tipico marcatore di cellule staminali OCT4 (rosso) e SSEA4 (verde), come mostrato nel saggio di immunofluorescenza(Figura 4B). L'espressione dei marcatori di pluripotenza OCT4, NANOG e REX1 è stata valutata anche a livello di mRNA da qRT-PCR (Figura 4C). Le quantificazioni relative sono state eseguite con campioni raccolti da una linea cellulare coltivata manualmente (m) e nel sistema di coltura automatizzata (a) in duplicati (repliche 1 e 2). I livelli di espressione di tutti e tre i marcatori di pluripotenza nelle repliche coltivate nel sistema di coltura automatizzato sono simili all'espressione marcatore dopo la coltura manuale. Il giorno 8 (D8), l'espressione dei marcatori di pluripotenza era assente nei neuroni corticali differenziati (Diff) dall'hiPSC.

Un'importante applicazione del sistema di coltura automatizzato è la differenziazione dell'hiPSC in diversi tipi di cellule, compresi i neuroni. Qui mostriamo la differenziazione dell'hiPSC in neuroni usando la strategia NGN2, che produce una pura cultura corticale dei neuroni in pochissimo tempo (circa 6 giorni). I neuroni differenziati nel sistema di coltura automatizzato (a) presentavano morfologia e organizzazione della rete neuronale simili a quella dei neuroni coltivati manualmente (m) (Figura 5A). I neuroni corticali differenziati automatizzati sono stati positivi per TUBB3 (neurone-specifico classe III β-tubulina, rosso) e BRN2 (marcatore dello strato corticale superiore, verde)(Figura 5B),paragonabile ai neuroni differenziati manualmente (dati non mostrati). L'espressione di marcatori neuronali tra cui la proteina associata al microtubulo 2 (MAP2), la molecola di adesione delle cellule neurali(NCAM1) e Synapsin-1 (SYN1), così come i marcatori neuronali corticali BRN2 e CUX1 (strato corticale superiore) sono stati arricchiti nei neuroni al giorno 8 (D8) di differenziazione(Figura 5C). In hiPSC è stata osservata un'espressione molto bassa o nessuna di questi marcatori. Le quantificazioni relative sono state eseguite con campioni raccolti da una linea cellulare coltivata manualmente (m) e nel sistema di coltura automatizzata (a) in duplicati (repliche 1 e 2). I livelli di espressione nelle repliche mostrano variazioni simili tra differenziazioni manualmente e automatizzate.

La capacità di imaging integrata del sistema di coltura automatizzato consente la raccolta di dati a mani libere per la salute delle culture, consentendo così l'acquisizione automatizzata a lungo termine di letture fenotipiche. Utilizzando l'approccio NGN2 a una linea di precursore neurale derivata da piccole molecole (smNPC) trasdutta con lentivirus GFP, abbiamo stabilito un saggio di crescita automatica della neurite a cellule vive in cui la lunghezza della neurite è stata misurata su 11 giorni di differenziazione senza alcun intervento manuale. La complessità della neurite aumentò nel tempo, come dimostrato dall'area occupata con neuriti nei giorni 1, 3 e 11, espressione GFP e immagini mascherate dall'analisi(Figura 6A, B). L'aumento della lunghezza della neurite dal primo all'11° giorno di differenziazione è stato quantificato e ha mostrato uno sviluppo simile in diversi pozzi. Per semplicità, i dati di solo 3 colonne con 6 pozzali ciascuno da una piastra di 96 po 'sono raffigurati nel grafico rappresentativo anche se tutti i 60 pozzi interni sono stati analizzati(Figura 6C).

Un'altra applicazione del sistema di coltura automatizzato mostrata qui è la differenziazione dell'hiPSC in neuroni mDA. La differenziazione si basa su modifiche ai media a seguito di un protocollo prestabilito ed è stata eseguita sul sistema di coltura automatizzato dai giorni 0 a 65. I cambiamenti automatici dei supporti non hanno causato il distacco delle celle o altri cambiamenti visivamente rilevabili nella differenziazione. Alla fine della differenziazione, il giorno 65, i neuroni mDA mostrano organizzazione cellulare e morfologia (soma sferico, dendriti lunghi e spinosi) paragonabili alla differenziazione manuale(Figura 7A, B). A livello di mRNA, i neuroni mDA differenziati nel sistema di coltura automatizzato mostrano l'espressione di marcatori neuronali e mDA, MAP2 e TH (tirosina idrossilasi), rispettivamente (Figura 7C). Entrambe le differenziazioni hanno generato notevoli quantità di neuroni positivi TH e MAP2 (Figura 7D).

Figura 1: Panoramica schematica della coltura cellulare automatizzata e della piattaforma di imaging.
Il sistema è stato progettato con un alloggiamento in policarbonato e due cappe HEPA (A e B) dotate di quattro lampade UV che garantiscono un ambiente sterile per applicazioni di coltura cellulare. Le piastre di coltura cellulare vengono caricate sugli scaffali di fronte al braccio robotico a cui è possibile accedere tramite la porta d'ingresso (C). Le piastre vengono caricate nell'incubatore di CO₂ (D) con una capacità di 456 piastre. Un citometro a celle a campo luminoso (E) viene utilizzato per i controlli di confluenza e il conteggio delle celle durante le routine di subcoltivazione. La stazione di movimentazione dei liquidi si trova al di sotto di una delle cappe HEPA (B). Il layout del ponte del gestore liquido è descritto nella figura 2. Il braccio di tubazione della stazione di movimentazione dei liquidi trasporta una testa di pipettazione a 96 canali, otto canali di pipettazione da 1 mL e quattro canali di pipettazione da 5 mL. Nel caso dei canali di pipettazione da 1 mL, le punte o gli aghi possono essere utilizzati per i trasferimenti di liquidi. A fini di screening, le cellule sementi in piastre di dosaggio possono essere trattate con campioni conservati a -20 °C nel sistema di stoccaggio automatizzato a -20 °C (F) dopo lo scongelamento di questi campioni in un secondo incubatore (G). L'imaging ad alta produttività viene eseguito nel microscopio confocale automatizzato (H) offrendo di acquisire immagini in modalità confocale utilizzando due dischi rotanti o in modalità epifluorescenza. Una camera a cellule vive integrata nel microscopio consente di eseguire immagini a lungo termine di cellule coltivate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Disposizione del ponte della stazione di movimentazione dei liquidi.
Le posizioni delle punte sono indicate da "50 μL" per punte da 50 μL, da "standard" per punte da 300 μL, da "alte" per 1 mL e da "5 mL" per punte da 5 mL. Componenti del ponte: (A) Quattro posizioni dello shaker riscaldato (velocità massima: 2500 giri/min) che possono essere utilizzate per qualsiasi piastra di coltura o formato di piastra di dosaggio. Le posizioni dello shaker sono dotate di pinze bloccabili che vengono utilizzate anche per l'allineamento della piastra dopo i trasporti sul ponte. Inoltre, le posizioni dello shaker funzionano come posizione di parcheggio del coperchio per le piastre durante le fasi di trasferimento del liquido. Per scopi rappresentativi, tutte le posizioni dello shaker sono occupate da 96 piastre di dosaggio. (B) Quattro moduli di inclinazione per la lavorazione simultanea di quattro lastre di qualsiasi formato sono posizionati sulla parte superiore. La posizione più bassa segna la camera di raccolta dei rifiuti per le piastre di coltura e dosaggio e la testa di pipettazione a 96 canali. Per scopi rappresentativi, tutti i moduli di inclinazione sono occupati da piastre di dosaggio da 96 pozzi. (C) Nella posizione superiore si trova la piastra da 384 pozzi per il conteggio delle celle. Di seguito sono riportate due posizioni per piastre occupate da piastre da 96 potte per scopi rappresentativi e un rack per quattro tubi da 50 mL e quattro tubi da 15 ml. La posizione più bassa è occupata da punte da 5 mL. (D)Tre linee mediali con posizioni per serbatoi di supporti. Le linee multimediali possiedono sensori a livello liquido che consentono di riempire automaticamente il serbatoio del supporto con fino a 250 mL di supporti. (E) Due moduli di scarico liquido con scarico attivo si basano sulla parte superiore, sotto un modulo a temperatura controllata con una posizione per un contenitore (bianco) e un portasci da 5 mL. (F) Cinque posizioni per 1 mL punte. (G) Due moduli a temperatura controllata sono posizionati nella parte inferiore e una posizione per parcheggiare uno dei loro coperchi sulla parte superiore. (H) Posizioni per due portasci nidificati da 50 μL (NTR) nella parte superiore seguite da due posizioni per il prelievo a canale singolo e a 96 canali di punte da 300 μL e un portasci da 5 mL nella parte inferiore. (I) Uno stacker per piastre di conteggio a 384 pozza nella parte superiore seguito da tre NTR da 300 μL e da un portasci da 5 mL nella parte inferiore. (J) Stazione di stoccaggio e lavaggio per tre serie di otto aghi metallici riutilizzabili da 1 mL. (K) Posizione dei rifiuti per canali di pipettazione da 1 mL e 5 mL e NTR vuoto (grigio), nonché un blocco di pinza per canali da 1 e 5 mL (bianco) utilizzati per le fasi di trasporto sul ponte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Controllo automatico della confluenza dell'hiPSC.
( A ) Immagini rappresentative a campo luminoso (BF) dell'hiPSC scattate dal citometro cellulare(asinistra) e dopo un'analisi automatizzata della confluenza (a destra) che indica l'area proporzionale occupata dalle cellule in verde; (B) Percentuali di confluenza registrate da due linee hiPSC (iPS #1 e #2) dal primo al 6° giorno di coltura, n = 4 lastre da 1 pozzo per linea cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Passamento dell'hiPSC.
(A) Immagine BF di una linea hiPSC coltivata manualmente (a sinistra) e utilizzando il sistema di coltura automatizzato (a destra). Le immagini sono state scattate 6 giorni dopo il secondo passaging; (B) Immagini rappresentative di hiPSC macchiate per i marcatori a pluripotenza OCT4 e SSEA4 e controsostenibili con Hoechst 33342 (Nuclei); (C) Risultati di qRT-PCR per i marcatori di pluripotenza OCT4, NANOG e REX1 in una linea hiPSC coltivata in duplicati (1 e 2) manualmente (m) e nel sistema di coltura automatizzato (a), e i rispettivi neuroni corticali derivati dall'hiPSC (Diff) al giorno 8 (D8) di differenziazione. I dati sono rappresentati come quantità relativa (RQ) utilizzando iPS_a_1 come esempio di riferimento. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD) da 3 repliche tecniche della reazione qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 e RPLPO sono stati utilizzati come geni delle pulizie. Barra di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Neuroni corticali derivati dall'iPSC umano.
(A) Immagini brightfield dei neuroni corticali differenziati del giorno 6, m) e automatizzati (a) che mostrano reti neuronali simili; (B) Immagini rappresentative di cellule macchiate per TUBB3 (pan neuronale), BRN2 (neuroni corticali) e Hoechst 33342 (nuclei) il giorno 8 della differenziazione; (C) Risultati di qRT-PCR per geni marcatori di neuroni corticali (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 e SYN1) arricchiti nel giorno 8 (D8) di differenziazione. I dati sono rappresentati come quantità relativa (RQ) utilizzando iPS_a_1 come esempio di riferimento. Le barre di errore rappresentano l'SD da 3 repliche tecniche della reazione qRT-PCR. GAPDH, RPL13A1 e RPLPO sono stati utilizzati come geni delle pulizie. Barra di scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Un saggio ad alta produttività per la crescita della neurite.
(A) Immagini rappresentative della FPG che esprimono cellule nei giorni 1, 3 e 11 della differenziazione; (B) Immagini binarie rappresentative dei neuriti nei giorni 1, 3 e 11 di differenziazione. La crescita della neurite è stata quantificata utilizzando il software di analisi delle immagini ad alto contenuto 1 ed è rappresentata come lunghezza di neurite; (B) Il grafico mostra l'aumento della lunghezza della neurite nei neuroni NGN2 derivati da NPC e la formazione di una rete densa. Vengono immagini tre piastre da 96 pozzi con celle nei 60 pozzi interni. Per semplicità, solo tre colonne di pozzi per piastra da 96 pozzi sono mostrate come esempio con n = 6 pozzi per colonna. Una media di 1308 cellule sono state analizzate per pozzo. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (S.E.M.). Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Neuroni mDA derivati dall'iPSC umano.
I neuroni DA midbrain si differenziano manualmente (m) e nel sistema di coltura automatizzato (a). (A, B) Immagini fluorescenti rappresentative di neuroni mDA macchiati per tirosina idrossilasi (TH, marcatore neuronale mDA; verde), MAP2 (marcatore neuronale; rosso) e Hoechst 33342 (nuclei; blu); (C) Risultati rappresentativi qRT-PCR per i geni marcatori dei neuroni mDA differenziati manualmente e nel sistema di coltura automatizzato. I livelli di espressione TH e MAP2 sono rappresentati come quantità relativa (RQ) normalizzata ai geni delle pulizie (OAZ1 e GAPDH); (D) Percentuali di neuroni positivi TH e MAP2 generate dalla differenziazione manuale e automatizzata. Le barre di errore rappresentano l'SD di due differenziazioni indipendenti eseguite con due linee iPSC distinte (#1 e #2). Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo di cella	Scopo	Passaggio del protocollo	Densità cellulare	Formato piastra	Numero di cella/pozzo
Differenziazione NGN2
Ipsc	Generazione di linee stabili NGN2	S.2.3.	30.000 celle/cm2	12-bene	1,17,000
Ipsc	Differenziazione neuronale NGN2	3.1.3.	30.000 celle/cm2	1-pozzo	25,20,000
Ipsc	Differenziazione neuronale NGN2	3.1.3.	30.000 celle/cm2	96-bene	9,600
generazione smNPC
SmNPC	Riporsimento giorno 12 e 16	S5.9. e S5.11.	70.000 celle/cm2	6-bene	6,72,000
SmNPC	Placcatura dal passaggio 5	5.11.	50.000 celle/cm2	6-bene	4,80,000
SmNPC	neuroni da smNPC a NGN2	3.2.2	50.000 celle/cm2	96-bene	16,000
differenziazione mDA
Ipsc	Differenziazione dei neuroni mDA	4.1.2.	200.000 celle/cm2	1-pozzo	1,68,00,000
Neuroni DA	Ripiazzamento del giorno 25	4.3.2.	400.000 celle/cm2	1-pozzo	3,36,00,000
Neuroni DA	Ripiazzamento del giorno 25	4.5.2.	100.000 celle/cm2	96-bene	32,000
Rivestimento	Scopo	Passaggio del protocollo	Concentrazione/ Diluizione	Formato piastra	Dettagli del rivestimento
Cultura iPS
Matrice extracellulare	iPSC, linea NGN2, Neuroni mDA	1.5.7. e S2.3.	1 aliquota*; 25 mL DMEM/F-12	1-/12-bene	8/0,5 mL/pozzo; 1 h presso RT
Differenziazione NGN2
Poli-L-Ornitina	Differenziazione neuronale NGN2	3.1.3. e 3.2.2.	0,1 mg/mL; Pbs	1-/96-bene	8/0,1 mL/pozzo; 12 ore a 37°C; Lavaggio 3x PBS
Laminin	Differenziazione neuronale NGN2	3.1.3. e 3.2.2.	5 μg/mL; Pbs	1-/96-bene	8/0,1 mL/pozzo; 4 ore a 37°C
generazione smNPC
Matrice extracellulare	generazione e cultura smNPC	S5.6., S5.9., S5.11.	1 aliquota*; 25 mL DMEM/F-12	6-bene	1 mL; 2 h presso RT
differenziazione mDA
Matrice extracellulare	differenziazione mDA	4.1.2.	1 aliquota*; 25 mL DMEM/F-12	1-pozzo	12 mL; 12 ore a 37°C
Poli-L-Ornitina	differenziazione mDA	4.3.2. e 4.5.2.	0,1 mg/mL; Pbs	1-/96-bene	12/0,1 mL/pozzo; 12 ore a 37°C; Lavaggio 3x PBS
Laminin	differenziazione mDA	4.3.2. e 4.5.2.	10 μg/mL; Pbs	1-/96-bene	12/0,1 mL/pozzo; 12 ore a 37°C
Fibronectin	differenziazione mDA	4.3.2. e 4.5.2.	2 μg/mL; Pbs	1-/96-bene	12/0,1 mL/pozzo; 12 ore a 37°C
*Un'aliquota della matrice extracellulare è definita come il fattore di diluizione (in μL) presente nel certificato di analisi di questo prodotto.

Tabella 1: Densità e rivestimento delle cellule di semina rispettivi al formato della piastra.

Giorno	Reagente
Giorno 0 - 1	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542
Giorno 1 - 3	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b
Giorno 3 - 5	100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021
Giorno 5 - 7	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b, 3 μM CHIR99021
Giorno 7 - 9	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021
Giorno 9 - 11	100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021
Giorno 11 - 13	3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0,2 mM L-acido ascorbico (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT
Giorno 13 - 65	20 ng/mL BDNF, acido L-ascorbico da 0,2 mM (AA1), GDNF 20 ng/mL, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT

Tabella 2: Aggiunta di piccole molecole per la differenziazione dei neuroni dopaminergici.

Giorno	Mezzo KSR	N2 medio	Mezzo di differenziazione
Giorno 0 - 1	100%	0	0
Giorno 1 - 3	100%	0	0
Giorno 3 - 5	100%	0	0
Giorno 5 - 7	75%	25%	0
Giorno 7 - 9	50%	50%	0
Giorno 9 - 11	25%	75%	0
Giorno 11 - 13	0	0	100%
Giorno 13 - 65	0	0	100%

Tabella 3: Gradiente media per la differenziazione dei neuroni dopaminergici.

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Discussione

Introduciamo un sistema automatizzato di coltura cellulare con capacità di imaging integrate per la standardizzazione della coltura hiPSC e della differenziazione neuronale. A causa del minimo intervento dell'utente, la variazione sperimentale è bassa garantendo la riproducibilità dei fenotipi cellulari durante la differenziazione. L'utilità di pianificazione basata sul calendario supporta l'organizzazione e la parallelizzazione degli esperimenti e consente un alto grado di flessibilità nel momento in cui vengono eseguiti gli esperimenti. I metodi esistenti possono essere facilmente adattati e lo spettro dei metodi disponibili può essere aumentato. Inoltre, è possibile utilizzare un gran numero di formati di lastre di dosaggio che aumentano la flessibilità di questo sistema. Il sistema minimo costituito da un incubatore di CO_2, un braccio robotico, un citometro a celle a campo luminoso e una stazione di movimentazione dei liquidi forma l'unità di base necessaria per la cultura e la differenziazione hiPSC, con costi accessibili per i laboratori di ricerca accademici. La combinazione del sistema automatizzato di coltura cellulare con un sistema di archiviazione automatizzato -20 °C per lo stoccaggio di composti, librerie RNAi o librerie CRISPR /Cas9 e l'integrazione di un microscopio ad alto contenuto / alta produttività consentono l'esecuzione di screening fenotipici.

Nello studio attuale, il sistema automatizzato di coltura cellulare utilizzava punte usa e getta e i supporti di coltura sono stati riempiti manualmente nel serbatoio, limitando così l'uso della stazione di movimentazione dei liquidi per i cambiamenti dei supporti e altri processi di coltura, specialmente durante la notte. Per aggirare questa limitazione, i metodi possono essere regolati in base all'utilizzo dell'ago anziché alle punte usa e getta e, dopo aver installato i collegamenti dei tubi tra le linee dei supporti e i sacchetti multimediali conservati in frigorifero, i serbatoi dei supporti possono essere ricaricati automaticamente con supporti freschi preri riscaldati da elementi riscaldanti. Ciò ridurrebbe le interferenze degli utenti causate dal riempimento manuale di punte, supporti di coltura e scambi di serbatoi.

Il nostro sistema automatizzato di coltura cellulare offre diversi vantaggi. Uno è il sistema di tracciamento dei codici a barre. Le piastre caricate nel sistema sono identificate da un codice a barre unico che viene letto e salvato dal sistema consentendo il tracciamento dei campioni durante e dopo l'esecuzione del metodo. Un altro vantaggio è la possibilità di creare progetti specifici per l'utente. Qui, le piastre di coltura caricate nel sistema possono essere assegnate a un progetto specifico e raggruppate in lotti. La strutturazione in lotti semplifica l'esecuzione della stessa procedura a tutte le piastre di un determinato lotto poiché non è necessario selezionare singole piastre. Inoltre, un editor di classi liquide consente di regolare la velocità e l'altezza della pipettaggio, nonché i parametri di aspirazione e erogazione per ogni fase di trasferimento del liquido. Ogni processo è documentato in file di registro che consentono di ripercorrere quali attività sono state eseguite per una determinata coltura o piastra di dosaggio.

Neuroni e altri tipi di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono utili strumenti in vitro per studiare i meccanismi delle malattie neurodegenerative in specifiche popolazioni di pazienti (ad esempio neuroni dopaminergici per il morbo di Parkinson) offrendo la possibilità di screening personalizzati dei farmaci. Coltivare hiPSC richiede molto tempo e richiede persone addestrate per eseguire protocolli di differenziazione complessi, di solito limitati alla produzione su bassa scala. Abbiamo adattato la cultura senza alimentatori dell'hiPSC a una coltura automatizzata e implementato due protocolli di differenziazione neuronale, un protocollo di differenziazione dei neuroni corticali rapido basato sull'espressione troppo NGN2 sotto un promotore tet-on^10,11e un protocollo a lungo termine a base di piccole molecole per la generazione di neuroni dopaminergici midbrain (mDA)¹³. Il semplice trasferimento e riproducibilità della cultura manuale e dei protocolli di differenziazione rende il sistema di coltura automatizzato molto utile. L'iPSC umano coltivato nel sistema automatizzato di coltura cellulare ha mostrato una morfologia coerente delle cellule staminali ed ha espresso importanti marcatori di pluripotenza, riproducibili tra esperimenti indipendenti. Inoltre, l'automazione del protocollo di coltura hiPSC favorì la coltura e l'espansione di un maggior numero di linee cellulari in parallelo. I controlli automatizzati di confluenza programmati per essere eseguiti durante la notte hanno fatto risparmiare tempo lasciando il sistema libero durante il giorno per le fasi del processo a valle effettuate quando l'utente era in laboratorio (ad esempio, raccolta di cellule o ripiazzatura manuale per differenziazioni). Al raggiungimento della soglia di confluenza definita dall'utente, le cellule vengono tralette e rilate in piastre rivestite a matrice extracellulare disponibili sullo stacker del sistema automatizzato di coltura cellulare. Ogni passaggio rotondo dura circa 70 minuti e genera quattro piastre da 1 pozzo da una piastra madre, che si traduce in una capacità di 20 passaggi in un giorno.

L'automazione del protocollo di differenziazione NGN2 è stata fatta con successo e ha permesso la generazione di una popolazione omogenea di cellule neuronali attraverso diversi passaggi e paragonabile alle differenziazioni manuali. Inoltre, i costi sperimentali per studi di screening su larga scala che coinvolgono più linee cellulari o esperimenti di screening con migliaia di condizioni/composti di prova sarebbero ridotti a causa di rapide differenziazioni. Letture convenienti e ad alta produttività, incluse le misurazioni della crescita della neurite a cellule vive, possono essere facilmente sviluppate, implementate e utilizzate come letture fenotipiche per la modellazione delle malattie, come^{mostrato in precedenza 14,15,16}. Pertanto, abbiamo ulteriormente adattato il protocollo NGN2 usando cellule precursori neurali derivate da piccole molecole (smNPC) che esprimono in modo costitutivo la GFP. Le celle smNPC offrono ulteriori vantaggi, tra cui la riduzione dei costi con i mezzi di coltura (un terzo del costo con la coltura iPSC) e il tempo necessario per scalare gli esperimenti. Le rese cellulari da smNPC sono da 7 a 10 volte superiori a quelle ottenute con iPSC. I neuroni differenzianti sono stati monitorati e immagini con successo per diversi giorni utilizzando un processo di imaging completamente automatizzato senza la necessità di colorazioni manuali degli anticorpi o etichettatura chimica, risparmiando costi e tempo necessari per le procedure manuali tra cui l'imaging da solo. L'attuale imaging di 60 pozzi interni di una piastra da 96 pozzetti richiede circa 16 minuti per piastra quando vengono imageizzati 25 campi per pozzo, il che significa che i dati per uno screening basato sull'imaging per 1000 composti, potrebbero essere acquisiti e analizzati in un giorno. In futuro, questa lettura potrebbe essere utilizzata in studi di screening composto per il salvataggio di difetti di crescita della neurite.

Inoltre, dimostriamo anche il trasferimento di un protocollo di differenziazione manuale per la generazione di neuroni dopaminergici midbrain (mDA) da iPSC. Questo piccolo protocollo di differenziazione basato su molecole richiede 65 giorni ed è ad alta intensità di lavoro a causa dei molteplici passaggi di rimpiazzamento e dei frequenti cambiamenti dei media, per lo più ogni 2 giorni, che limita la produzione di neuroni mDA a poche linee iPSC contemporaneamente. Il protocollo di differenziazione mDA automatizzato ha il grande vantaggio di aumentare la differenziazione a dozzine di linee iPSC. Fino a 30 linee cellulari potrebbero essere differenziate in parallelo. Poiché la differenziazione si basa principalmente sui cambiamenti dei media, quasi l'intero processo di differenziazione può essere condotto senza interferenze umane. Utilizzando l'utilità di pianificazione basata sul calendario del sistema automatizzato, potremmo pianificare le modifiche dei supporti in base ai passaggi di differenziazione. Una limitazione del lavoro con un numero così elevato di linee cellulari e piastre di coltura era l'impossibilità di eseguire cambiamenti multimediali durante la notte. Il motivo principale è il fatto che il nostro sistema è impostato per l'utilizzo di punte usa e getta e il riempimento manuale di supporti di coltura che richiedono a un utente in laboratorio di eseguire questo passaggio manuale. Per facilitare il processo di cambio del supporto, le piastre caricate nel sistema sono state assegnate a un progetto e raggruppate in lotti. La dimensione del lotto è stata quindi adattata al numero di punte usa e getta e al volume dei supporti di coltura disponibili. Come discusso in precedenza, questa limitazione può essere facilmente superata mediante l'implementazione di aghi riutilizzabili / lavabili e il riempimento automatico dei supporti. Il passaging/ripiazzamento automatizzato delle celle, come mostrato per iPSC, è una delle comodità offerte dal nostro sistema automatizzato di coltura cellulare. Abbiamo testato la ripiazzatura automatizzata dei neuroni mDA il giorno 25 della differenziazione. Tuttavia, la dissociazione dei neuroni mDA richiede un'incubazione più lunga (40 min) con l'enzima di dissociazione rispetto all'iPSC (8 min) che estende il processo di placcatura automatica a più di 1 h per linea cellulare. Di conseguenza, la ripiazzatura automatizzata di 30 linee cellulari nello stesso giorno è diventata impossibile. Accelerare altre fasi durante la piastra automatica (trasporto di piastre, pipettaggio) e adattare il sistema all'uso di aghi e linee multimediali che rende possibile un lavoro notturno risolverebbe questa limitazione. Nonostante gli svantaggi, potremmo trasferire con successo il protocollo manuale a una differenziazione automatizzata dei neuroni mDA che producono colture con quantità sostanziali di cellule positive MAP2 (neuroni) e TH (neuroni mDA).

Differenziare dozzine di linee cellulari iPSC in parallelo è di grande interesse in progetti che indagano i meccanismi molecolari delle malattie neurodegenerative, incluso il morbo di Parkinson. Tuttavia, completare le attività più velocemente con meno errori e a costi ridotti è una grande sfida. Grazie all'automazione dei protocolli qui presentati (iPSC, smNPC e mDA neuron), potremmo accelerare, ridurre i costi e aumentare la riproducibilità nei nostri progetti. Lo sviluppo di progetti come FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) che coinvolgono centinaia di linee cellulari dei pazienti dimostra la necessità di protocolli automatizzati di coltura e differenziazione. Le nostre prospettive future includono il trasferimento di modelli manuali di coltura cellulare tridimensionale (3D) al sistema automatizzato. Piccoli adattamenti nelle impostazioni di definizione della piastra e l'uso di adattatori consentiranno l'uso di piastre commerciali o su misura e camere microfluidiche necessarie per le colture 3D. Inoltre, l'implementazione di un modello automatizzato di imaging senza etichette ci permetterà di monitorare la crescita neuronale in tempo reale e tradurre i cambiamenti nella crescita della neurite, nell'organizzazione dei neuroni e nella morte cellulare in una migliore comprensione dei meccanismi della malattia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpi	Distributore	Numero catalogo	Diluizione
iPSC marcatore di pluripotenza
Topo anti-SSEA4	Abcam	ab16287	da 1 a 33
Coniglio anti-Oct3/4	Abcam	ab19857	da 1 a 200
NGN2 marcatori neuronali
Topo anti-TUBB3	R & D	MAB1195	1 a 500
Coniglio anti-BRN2	NEB	12137	Da 1 a 1.000
mDA marcatori neuronali
Pollo anti-TH	Pel-Freez Biologicals	12137	1 a 750
Topo anti-MAP2	Santa Cruz	sc-74421	da 1 a 750
Anticorpi secondari
Capra anti-pollo IgY, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11039	da 1 a 2.000
capra anti-topo IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11029	da 1 a 2.000
capra anti-topo IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	da 1 a 2.000
capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	da 1 a 2.000
capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	da 1 a 2.000
IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012	da 1 a 2.000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342	Invitrogen	H3570	da 1 a 8.000
Instruments	Distributor	Numero catalogo	Description/Application
Agilent Sistema TapeStation	Tecnologie Agilent	4200	Elettroforesi automatizzata per campioni di DNA e RNA
Automatizzata -20 gradi Sistema di stoccaggio C	Hamilton Storage Technologies	Gestione dell'accesso ai campioni (SAM -20C, serie 3200)	Conservazione dei reagenti
Lettore di codici a barre	codici a barre Honeywell Scanner di codici		barre
Orbit Citomat cellulare in campo chiaro	Nexcelom	Celigo	Controllo della confluenza e conteggio delle cellule
CellVoyager 7000	Yokogawa	CellVoyager 7000	Microscopio confocale automatizzato
Cytomat per colture cellulari	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 24 C, CU	12 impilatori passo 28 mm, 12 impilatori passo 23 mm (totale di 456 piastre)
Cytomat per lo scongelamento dei campioni	Thermo Fisher Scientific	Cytomat 2-LIN, 60 DU (unità di essiccazione)	2 impilatori passo 28 mm (totale di 42 piastre)
Filtri HEPA	Hamilton Robotics	Cappa Flow Star	UV Modified by Hamilton Robotics
Stazione di manipolazione dei liquidi	Hamilton Robotics	Microlab Star	Channels: 8x 1 ml, 4x 5 ml e 96 canali MPH
Serbatoio dei terreni	Hamilton Robotics	188211APE	Serbatoio dei terreni/reagenti
Sistema di acqua pura	Veolia Water	ELGA PURELAB Classic	Fornisce acqua pura per la stazione di lavaggio degli aghi
QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	QSTUDIO12KOA	Macchina per PCR in tempo reale
Braccio robotico	Hamilton Robotics	Rackrunner	Trasporto di piastre
Piattaforma girevole	Hamilton Robotics	Piattaforma girevole	Regolazione dell'orientamento della piastra
di continuità	APC	Smart UPS RT, 10000 VA Potenza alimentazione	Alimentatore di backup
VIAFLO-pipette	Integra	4500	Pipetta elettronica
ViiA 7 Sistema di PCR in tempo reale	Biosystems applicata	4453545	Macchina
Materiali	Distributore	Numero di catalogo	< strong>Note
Piastra di coltura a 1 pozzetto (84 cm2)	Thermo Fischer Scientific	165218	Nunc OmniTray
Piastre di coltura a 6 pozzetti (9,6 cm2)	Greiner Bio-One	657160	TC trattato con coperchio
Piastra di coltura a 12 pozzetti (3,9 cm2)	Greiner Bio-One	665180	TC trattato con coperchio
Piastra di coltura a 96 pozzetti (0,32 cm2)	Perkin Elmer	6005558	CellCarrier-96 Punte per piastre nere
, 50-µ L	Hamilton Robotics	235987	Punte da 50 uL
Punte, 300-µ L	Hamilton Robotics	235985	300-µ L punte
Punte, 1000-µ L	Hamilton Robotics	235939	1000-µ Punte a L
Punte da 5 mL	Hamilton Robotics	184022	Punte da 5 mL
Greiner Bio-One	da	15 mL	Provette da 15 mL
Provette	Greiner Bio-One	227261	da 50 mL Greiner Bio-One Provette da 50 mL
Fiale criogeniche Nalgene da 2,0 mL	Sigma Aldrich	V5007	Cryovials
Plasmidi	Distributore	Numero catalogo	Note
pLV_hEF1a_rtTA3	Addgene	61472	Gentile regalo da Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro	Addgene	61474	Gentile regalo da Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus	Takara Bio	631983
Primers	Sequence (forward)	Sequence (reverse)	Source
iPSC pluripotenza
OCT4 (ID 4505967a1)	CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG	GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC	PrimerBank
NANOG (ID: 153945815c3)	CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA,	CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC,	PrimerBank
, REX1 (ID: 89179322c1)	AGAAACGGGCAAAGACAAGAC,	GCTGACAGGTTTTTTTTCGC	PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID: 87578393c1)	CTCAGCACCGCTAACAGAGG	CATTGGCGCTTCGGACAAG, PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1)	CGGCGGATCAAACTGGGATTT	TTGCGCTGCGATCTTTTCTAT	PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2)	CGAGACCTCCACACTTCGTG	TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3)	TGTCCGATTCATGTCCTCC	CTCACAGCGATAAGTGCCCTC	PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)	TGCTCAGGTACAACGTACC	GACACTTGCGATGTCCTGGAA	PrimerBank
mDA neuroni
TH	CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA	CTCCTCGGCGGTACTCCACA	NCBI primer-BLAST
MAP2	GGATCAACGGAGAGCTGAC	TCAGGACTGCTACAGCCTCA	NCBI primer-BLAST
strong>Housekeeping genes
GAPDH	GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG	GAGCCCCAGCCTTCTCCATG	NCBI primer-BLAST
OAZ1	AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT	ATGAAGACATGGTCGGCTCG	NCBI primer-BLAST
RPLPO	CCTCATATCCGGGGGAATGTG	GCAGCAGCTGGCACCTTATTG	NCBI primer-BLAST
RPL13A	GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC	TGGCTTTCTCTTTCCTCCTC	NCBI primer-BLAST
Terreni e reagenti	Distributore	Numero catalogo	Concentrazione d'uso
Matrice di rivestimento
Matrice extracellulare (Matrigel)	Corning	354277	10 μ g/mL
di Fibronectina	Corning	356008	2 μ g/mL
Laminin	Sigma	L2020	5 - 10 μ g/mL
Poli-L-Ornitina (PLO)	Sigma	P3655	0,1 mg/mL
Terreno di coltura
Terreno di coltura iPSC (Terreno Essential 8 Flex)	Neuroni Gibco	A2858501
NGN2 - Terreno NGN2
2-mercaptoetanolo	Gibco	21985023	0,909 mL (50 & micro; M)
Integratore di B27	Gibco	12587010	10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX	Gibco	31331093	484,75 mL
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL ( 2 mM)
Insulina	Sigma	I9278	0,25 mL (2,5 µ g/mL)
MEM Aminoacidi non essenziali	Gibco	11140050	5 mL (0,5%)
Integratore di N2	Gibco	17502048	5 mL (0,5%)
Mezzo neurobasale	Gibco	21103049	485
mLmDA neuroni - SRM medio
2-mercaptoetanolo	Gibco	21985023	0,5 mL (55 &; micro; M)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12	Gibco	12660012	409,5 mL
Knockout di sostituzione del siero (sostituzione del siero)	Gibco	10828028	75 mL (15%)
Aminoacidi non essenziali MEM	Gibco	11140050	5 mL (1%)
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	5 mL (1%)
mDA neuroni - N2 medium
B27 integratore	Gibco	12587010	10 mL (2%)
GlutaMAX	Gibco	35050038	5 mL (2 mM)
Integratore N2	Gibco	17502048	5 mL (1%)
Neurobasal medium	Gibco	21103049	475 mL
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	5 mL (1%)
< > mDA - Integratore di < / forte>
B27	Gibco	12587010	10 mL (2%)
Mezzo neurobasale	Gibco	21103049	485 mL
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	5 mL (1%)
NGN2 neuroni - Integratori
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Peprotech	450-02	10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R& D	4423/10	2 μ M
Doxiclina (dox)	Sigma	D9891	2.5 μ g/mL
Fattore neurotrofico di derivazione gliale (GDNF)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
Acido L-ascorbico 2-fosfato magnesio (AA2)	Sigma	A8960	64 mg/L
Fattore neurotrofico-3 (NT-3)	Peprotech	450-10	10 ng/mL
Purmorfemina (PMA)	Cayman	10009634	0,5 μ M
Puromicina	Sigma	P8833-10MG	0,5 μ g/mL
di Thiazovivin	Merk Millipore	420220-10MG	2 μ Neuroni M
mDA - Integratori
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Peprotech	450-02	20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR)	R& D	4423/10	3 μ M
DAPT	Cayman	13197	10 µ M
Dibutirril-cAMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	1 mM
Fattore di crescita dei fibroblasti 8B (FGF-8b)	Peprotech	100-25	100 ng/mL
Fattore neurotrofico di derivazione gliale (GDNF)	Peprotech	450-10	20 ng/mL
Acido L-ascorbico (AA1)	Sigma	A4403	0,2 mM
LDN193189 (LDN)	Cayman	11802	100 nM
Purmorphamine (Purm)	Cayman	10009634	2 μ M
Sonic Hedgehog/SHH (C24II) N-Terminus (SHH)	R& D	1845-SH	100 ng/mL
SB431542 (SB)	Cayman	13031	10 μ M
Fattore di crescita trasformante tipo ß 3 (TGFß 3)	R & D	243-B3	1 ng/mL
Y-27632	Cayman	10005583	10 µ Reagenti
di dissociazione M
Reagente di dissociazione di singole cellule (StemPro Accutase)	Gibco	A1110501	1x
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0	Gibco	11575020	0,5 mM
RNA kit di isolamento e cDNA
RNA	kit Qiagen	74106	Rneasy MiniKit
Tampone per lisi dell'RNA	Thermo Fisher Scientific	15596018	Tampone per lisi Trizol (RNA tampone per lisi)
Trascrittasi inversa (kit)	Thermo Fisher Scientific	18080-085	SuperScript III Reverse Trascrittasi
Software	Azienda	Numero di catalogo	Description/Application
Cell Culture Framework (CCF) (Interfaccia utente grafica, GUI)	Hamilton Robotics	Interfaccia	utente personalizzata per il sistema automatizzato
Software CellPathFinder (software di analisi delle immagini 1)	Yokogawa	CellPathfinder HCS Software	Strumento di analisi delle immagini
Sistema di misura CellVoyager	Yokogawa	Incluso con CellVoyager 7000	Software di controllo del microscopio
Software Columbus (software di analisi delle immagini 2)	Perkin Elmer	Columbus	Strumento di analisi delle immagini
App qPCR basata su cloud	Thermo Fisher Scientific	Themo Software	analisi cloud Fisher per dati qRT-PCR
Venere software	Hamilton Robotics	VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 Software	Software di controllo per il sistema automatizzato

Lettore di a Gruppo per PCR in tempo realeProvette, 188271 , , < di