Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

Yueyang Hong; Hongyuan Xu; Yiling Yang; Siru Zhou; Anting Jin; Xiangru Huang; Qinggang Dai; Lingyong Jiang

doi:10.3791/61532

Articolo metodologico

Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

DOI:

10.3791/61532

⸱

25 agosto 2020

Yueyang Hong^*¹ , Hongyuan Xu^*¹ , Yiling Yang¹ , Siru Zhou¹ , Anting Jin¹ , Xiangru Huang¹ , Qinggang Dai² , Lingyong Jiang¹

¹Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, ²The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un metodo che combina l'aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento della citometria del flusso per isolare, coltivare, smistare e identificare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo dalle mattidi di ratto.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un metodo efficace per isolare e coltivare in vitro cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare (mBMSC) per ottenere rapidamente numerose cellule di alta qualità per esigenze sperimentali. Gli mBMSC potrebbero essere ampiamente utilizzati in applicazioni terapeutiche come cellule di ingegneria tissutale in caso di malattie craniofacciali e rigenerazione cranio-maxillo-facciale in futuro grazie all'eccellente capacità di autorinnoto e al potenziale di differenziazione multi-lignaggio. Pertanto, è importante ottenere mBMSC in gran numero.

In questo studio, il midollo osseo è stato lavato dalla mattiere e i mBMSC primari sono stati isolati attraverso la coltivazione aderente al midollo osseo intero. Inoltre, CD29⁺CD90⁺CD45⁻ mBMSC sono stati purificati attraverso lo smistamento delle celle fluorescenti. La seconda generazione di mBMSC purificati è stata utilizzata per ulteriori studi e ha mostrato un potenziale nella differenziazione in osteoblasti, adipociti e condrociti. Utilizzando questo modello in vitro, si può ottenere un elevato numero di mBMSC proliferativi, che possono facilitare lo studio delle caratteristiche biologiche, la successiva reazione al microambiente e altre applicazioni degli mBMSC.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono cellule staminali non ematopoietiche derivate dal midollo osseo che manifestano una forte capacità di proliferazione e un potenziale di differenziazione multi-lignaggio^1,^2,^3,⁴. In effetti, i BMSC sono stati considerati un candidato ideale per l'ingegneria e la rigenerazione dei tessuti ossei sin dalla loro scoperta. Per anni, la cresta iliaca o ossa lunghe come la tibia e il femore sono state la fonte più comune di BMSC per la rigenerazione craniofacciale. Tuttavia, i BMSC orofa....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sperimentali sugli animali in questo documento sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali del Nono Ospedale Popolare di Shanghai, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

1. Preparazione

Usa due ratti Sprague Dawley maschi di 5 settimane per l'esperimento.
Sterilizzare tutti gli strumenti, compresi portaaghi, pinzette e forbici ad alta temperatura o immersi nel 75% di etanolo per 10 min.
NOTA: L'immersione in etanolo non deve essere troppo lunga per evitare danni alle cellule.
Preparare preventivamente i mezzi di coltura, la cui composizione è fornita nell....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizzando questo protocollo, gran parte delle cellule ha aderito alla piastra il terzo giorno dopo la coltura iniziale. In genere, dopo altri 3-4 giorni di coltura, la confluenza cellulare ha raggiunto il 70-80% (Figura 1B). Con lo smistamento delle celle fluorescenti, DAPI^-CD29⁺CD90⁺CD45⁻ mBMSC sono stati^{purificati 18}^,²², che rappresentavano circa l'81,1% nelle celle P0 (

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo per isolare i BMSC dalle mantidi di ratto in vitro combinando l'aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento delle cellule fluorescenti, che è un modo semplice e affidabile per ottenere mBMSC proliferativi con una forte capacità di differenziazione. Questo metodo potrebbe purificare preventivamente gli mBMSC mediante smistamento delle celle di flusso, ma se ci sono requisiti più elevati per l'omogeneità cellulare, possono essere necessari metodi di purificazione più precisi.

.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori affermano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo per l'assistenza del Laboratorio per la Stomatologia Digitalizzata e il Centro di Ricerca per anomalie craniofacciali dell'ospedale nono popolo di Shanghai. Il lavoro di questo manoscritto è supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, il fondo SHIPM-mu dello Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], il Progetto incentive del team di innovazione di alto livello per la Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. E L.J. è uno studioso dell'Outstanding Y....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% Tripsina-EDTA(1X)	Gibco	25200072
Piatto di coltura da 10 cm	Corning
acutenaculum
Terreno di differenziazione adipogenico	Cyagen biosciences inc.	MUBMX-90031
Alcian Blue	Beyotime Biotechnology
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Kit di sviluppo del colore della fosfatasi alcalina	Beyotime Biotechnology	C3206
alpha-Minimum terreno essenziale	GE Healthcare HyClone Cell Culture	SH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAb	Abcam	ab34712
Anticorpi contro CD16/CD32
Antifade Terreno di montaggio con DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131
APC Anticorpo CD29 anti-topo/ratto	biolegend inc	102215
Armadio di biosicurezza	Esco	AC2-4S8-CN
CD45 Anticorpo monoclonale (OX1), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Anticorpo monoclonale (HIS51), FITC, eBioscience	Invitrogen	11-0900-85
Centrifuga	cence	L500
Condrogenesi differenziazione media	cyagen biosciences inc.
Microscopio a scansione laser confocale	Zeiss	LSM880
Countess II FL Contatore di cellule automatizzato	Invitrogen	AMQAF1000
Soluzione di colorazione cristallo viola	Beyotime Biotechnology	C0121
Siero fetale bovino GE	Healthcare HyClone Cell Culture	SH30084.03
IgG anti-coniglio di capra H& L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150077
Incubatore	Esco	CCL-170B-8
Microscopio invertito	olimpo	CKX53
Reagente Magzol (reagente Trizol)	Micropipettor Magen
	Eppendorf
Oil Red O
Mezzo di differenziazione osteogenica	Cyagen Biosciences, Inc.	MUBMX-90021
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15070063
Soluzione salina tamponata con fosfato (1X)	Gibco	20012027
PrimeScript RT Master Kit	TakaRa Bio Inc	RR036A
Proteinasi K	Sigma-Aldrich	P6556
Tampone di blocco QuickBlock	Beyotime Biotechnology	P0260
			forbice
SYBR1 Premix	TakaRa Bio Inc
Blu di toluidina	Beyotime Biotechnology
Soluzione blu di tripano, 0,4%	Gibco	15250061

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
Chu, D. T., et al.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Lavaggio del midollo osseo smistamento cellulare fluorescente marcatori CD29 CD90 CD45 differenziazione osteogenica differenziazione adipogenica differenziazione condrogenica analisi mediante citometria a flusso protocollo di coltura cellulare

Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

In questo articolo

Sommario

Abstract

Introduzione

Protocollo

Risultati

Discussione

Dichiarazioni

Ringraziamenti

Materiali

Riferimenti

Ristampe e permessi

Tag

Articoli correlati