L'eterogeneità intratumorale è una caratteristica intrinseca dei tumori, compresi i gliomi. Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza una combinazione di tamponi e centrifugazione a gradiente per isolare singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati per studi di sequenziamento di RNA a nucleo singolo e ATAC.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq
In questo articolo
Sommario
Abstract
I gliomi diffusi adulti mostrano eterogeneità inter- e intra-tumorale. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli sforzi di profilazione molecolare su larga scala si sono concentrati su approcci di massa che hanno portato alla classificazione molecolare dei tumori cerebrali. Negli ultimi cinque anni, gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno evidenziato diverse caratteristiche importanti dei gliomi. La maggior parte di questi studi ha utilizzato campioni di tumore cerebrale fresco per isolare singole cellule utilizzando la citometria a flusso o metodi di separazione basati su anticorpi. Andando avanti, l'uso di campioni di tessuto appena congelati provenienti da biobanche fornirà una maggiore flessibilità alle applicazioni a singola cellula. Inoltre, con l'avanzare del campo a singola cellula, la prossima sfida sarà quella di generare dati multi-omici da una singola cellula o dalla stessa preparazione del campione per svelare meglio la complessità del tumore. Pertanto, protocolli semplici e flessibili che consentono la generazione di dati per vari metodi come il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) e il test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (snATAC-seq) saranno importanti per il campo.
I recenti progressi nel campo delle singole cellule, insieme a strumenti microfluidici accessibili come la piattaforma di genomica 10x, hanno facilitato le applicazioni a singola cellula nei laboratori di ricerca. Per studiare l'eterogeneità dei tumori cerebrali, abbiamo sviluppato un protocollo avanzato per l'isolamento di singoli nuclei da gliomi freschi congelati. Questo protocollo unisce i protocolli a cella singola esistenti e combina una fase di omogeneizzazione seguita dalla filtrazione e dalla centrifugazione a gradiente mediata dal buffer. I campioni risultanti sono sospensioni di nuclei singoli puri che possono essere utilizzati per generare dati sull'espressione genica del singolo nucleo e sull'accessibilità della cromatina dalla stessa preparazione dei nuclei.
Introduzione
I gliomi diffusi di grado inferiore (LGG), il tumore cerebrale primario più comune negli adulti, sono neoplasie infiltrative che spesso si presentano nell'emisfero cerebrale. Gli LCG mostrano eterogeneità sia inter- che intra-tumorale, che non è guidata solo dalla popolazione tumorale, ma anche dalle cellule non maligne coinvolte in modo complesso nello sviluppo e nella progressione del tumore1,2,3,4,5.
Nell'ultimo decennio, c'è stata una valanga di dati genomici raccolti nel campo dei gliomi. Questi dati provengono principalmente da studi di sequenziamento dei tumori di massa e hanno contribuito immensamente alla caratterizzazione molecolare e all'attuale classificazione dei tumori cerebrali5,6,7,8,9,10,11. Tuttavia, anche se questi studi hanno rivelato l'ampio panorama molecolare associato ai gliomi, c'è ancora una deludente mancanza di progressi per quanto riguarda l'intervento terapeutico. Uno degli ostacoli alla resistenza al trattamento nei tumori cerebrali è l'eterogeneità intratumorale. Per affrontare questo problema, vari studi si sono concentrati sull'eterogeneità genomica, trascrittomica, proteomica ed epigenetica presente all'interno di un tumore a livello di singola cellula12,13,14,15,16,17.
Sebbene ci siano stati notevoli progressi tecnologici nel campo delle singole cellule negli ultimi due anni, uno dei principali fattori limitanti è la disponibilità di campioni freschi necessari per isolare le cellule ed eseguire questi esperimenti. Per superare questa limitazione, ci sono stati diversi tentativi riusciti di eseguire saggi, come snRNA-seq e snATAC-seq da tessuti congelati, utilizzando nuclei piuttosto che cellule18,19. La maggior parte di questi metodi si basa su strategie di selezione cellulare attivate dalla fluorescenza (FACS) o di filtrazione. Sia gli approcci a singola cellula che a singolo nucleo hanno i loro punti di forza e svantaggi. Gli approcci a singola cellula mantengono i trascritti mitocondriali, che sebbene possano essere informativi, possono anche ridurre la copertura del trascrittoma a causa della loro elevata abbondanza. Gli approcci di isolamento dei singoli nuclei eliminano un'alta percentuale della frazione mitocondriale, consentendo così una copertura più approfondita dei trascritti nucleari20.
Esistono varie piattaforme disponibili in commercio che sono state utilizzate negli ultimi anni per saggiare i dati di genomica a singola cellula, tra cui RNA-seq e ATAC-seq. Una delle piattaforme più importanti è la piattaforma 10x Genomics Chromium per l'espressione genica a singola cellula e la profilazione ATAC a singola cellula. Poiché la piattaforma funziona con l'aiuto di camere microfluidiche, eventuali detriti o aggregati possono ostruire il sistema portando alla perdita di dati, reagenti e preziosi campioni clinici. Pertanto, il successo degli studi su singole cellule dipende in gran parte dall'accurato isolamento di singole cellule / nuclei.
Il protocollo che dimostreremo qui è una combinazione leggermente modificata dei protocolli DroNc-seq e Omni-ATAC-seq e utilizza un approccio simile a studi recenti che utilizzano snRNA-seq per comprendere disturbi neurologici e tipi di cellule neuronali nel cervello umano18,19,21,22,23,24. Il protocollo utilizza una combinazione di dissociazione enzimatica/meccanica di campioni congelati seguita da filtrazione e centrifugazione a gradiente e consente un isolamento rapido e accurato di singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo per generare dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione dei nuclei da campioni di tumore al cervello.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Campioni di glioma freschi congelati sono stati ottenuti dalla banca dei tessuti del National Center for Tumor diseases (NCT) di Heidelberg, in Germania. L'uso del materiale del paziente è stato approvato dall'Institutional Review Board presso la Facoltà di Medicina di Heidelberg e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti inclusi nello studio.
1. Preparazione sperimentale
- Eseguire tutti i passaggi sul ghiaccio o a 4 °C.
- Tubi pre-raffreddamento, piatti, lamette da rasoio, Douncers e pestelli a 4 °C.
- Preparare tutti i buffer in anticipo. Questi tamponi sono stabili a temperatura ambiente. Si raccomanda la filtrazione sterile, soprattutto per il saccarosio. I preparati di riserva sono modificati da Corces et al.19. Cfr. tabelle 1-7.
- Rimuovere i campioni dall'azoto liquido o dal congelatore a -80 °C e conservare con ghiaccio secco fino al punto 2.1.
2. Dissezione e dissociazione dei tessuti
- Trasferire un campione di tessuto fresco congelato (10-60 mg) in una capsula di Petri pre-refrigerata. Tritare / tritare il tessuto fresco congelato con una lama di rasoio a piccoli pezzi sul ghiaccio.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lisi dei nuclei refrigerati a un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml. Posizionare i pezzi di tessuto nel tubo da 1,5 ml contenente il tampone di lisi dei nuclei e trasferirli in un Douncer (Tabella dei materiali).
NOTA: Esistono due pestelli omogeneizzatori Dounce: pestello "sciolto" o "A" per la riduzione iniziale del campione e pestello "stretto" o "B" per l'omogeneizzazione completa del campione. - Dounce i pezzi di tessuto con il pestello "sciolto" per circa 20 colpi, fino a quando l'attrito non si riduce. Se sono presenti detriti, il campione può essere pre-eliminato mediante filtrazione con un filtro da 100 mm.
- Dounce con il pestello "stretto" per 20 colpi per ottenere l'omogeneizzazione completa dei tessuti.
- Trasferire l'omogeneo (circa 500 μL) in un tubo pre-refrigerato da 2 mL. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi refrigerato. Mescolare delicatamente e incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Mescolare delicatamente con una punta di pipetta a foro largo e ripetere 1-2 volte durante l'incubazione.
- Filtrare l'intero omogeneo utilizzando una rete filtrante da 30 μm, raccoglierne in un tubo Falcon da 15 ml e trasferirlo nuovamente in un nuovo tubo pre-refrigerato da 2 ml. Un singolo colino è in genere sufficiente per l'intero omogeneo.
- Controllare al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare. I nuclei devono essere rotondi e la membrana nucleare non deve essere distorta. Se sono presenti detriti, i nuclei possono essere rifiltrati.
- Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4 °C su una centrifuga da banco. Rimuovere il surnatante, lasciando circa 50 μL con pellet contenente i nuclei. Risuscisciare delicatamente il pellet in un altro 1 mL di tampone di lisi dei nuclei e incubare per 5 minuti sul ghiaccio.
- Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4°C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet, aggiungere 500 mL di 1x tampone di omogeneizzazione (HB)(Tabella 4)e incubare per 5 minuti senza sosuscire. Quindi, risuscisci i nuclei in altri 1,0 mL di 1x HB.
- Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere il surnatante e riaspentare delicatamente i nuclei in 200 μL di 1x HB in un nuovo tubo da 2,0 mL.
3. Centrifugazione a gradiente
- Aggiungere 200 μL di soluzione di iodixanolo al 50% (Tabella 5) per dare una concentrazione finale di iodixanolo al 25%. Mescolare bene 10 volte con pipetta impostata su 300 ml.
- Aggiungere 300 μL di soluzione di iodixanolo al 29% (Tabella 6) sotto la miscela al 25%. Utilizzare una punta fine P1000 per evitare la miscela degli strati.
- Aggiungere 300 μl di soluzione di iodixanolo al 35% (Tabella 7) sotto la miscela al 29%. Utilizzare una punta fine P1000 per evitare la miscela degli strati.
Attenzione: questo passaggio richiede la rimozione graduale della punta della pipetta durante il pipettaggio per evitare un eccessivo spostamento del volume. - Posizionare i campioni in una centrifuga a secchio oscillante, girare per 20 minuti a 3.500 x g a 4 °C con il freno spento.
- Rimuovere delicatamente i campioni senza agitare e osservare sotto la luce. Una banda bianca chiara di nuclei puri al 95% dovrebbe essere visibile tra il secondo e il terzo strato (Figura 1).
4. Isolamento dei nuclei
- Aspirare gli strati superiori fino alla banda dei nuclei bianchi all'interfase del 29%-35%.
- Raccogliere la banda dei nuclei in un volume di 200 ml, trasferirla in un tubo fresco e filtrare con un filtro da 20 μm (Tabella dei materiali).
NOTA: i nuclei non devono essere risuscisi prima della filtrazione. - Controllare al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare. I nuclei devono essere rotondi e la membrana nucleare non deve essere distorta.
- Conta i nuclei usando la colorazione blu di Trypan su un emocitometro e i nuclei aliquoti per snRNA-seq/snATAC-seq.
5. Nuclei singoli RNA e ATAC seq
- Elaborare immediatamente i nuclei utilizzando l'espressione genica monocellulare e i kit di reagenti ATAC a singola cellula (Tabella dei materiali).
NOTA: Le concentrazioni di campioni di nuclei per il sistema di genomica 10x sono 1500-3000 nuclei per μL per snRNA-seq e 3500-7000 nuclei per m μL per snATAC-seq. I nuclei possono essere diluiti utilizzando 1x PBS. - Sequenziare le librerie risultanti presso la Genomics Core Facility.
- Eseguire l'analisi del controllo qualità dei dati. I nuclei sono inclusi per ulteriori analisi se contengono identificatore molecolare univoco (UMI) >1000, numero di geni >500 e percentuale di geni mitocondriali <5% e sono all'interno della media + tre deviazioni standard delle IMI e dei geni.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La genomica a nucleo singolo è un campo in evoluzione con dati e protocolli limitati. Un fattore critico che influenza l'esito dei test dei singoli nuclei è l'isolamento dei nuclei puri e intatti. Abbiamo combinato due protocolli pubblicati (protocolli DroNc-seq e Omni-ATAC-seq) per isolare nuclei puri e di alta qualità da blocchi di tessuto di glioma congelato fresco in un tempo relativamente breve, mantenendo così la stabilità dei trascritti (Figura 1).
L'uso di...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il campo dell'eterogeneità intratumorale è in una fase entusiasmante, con nuovi saggi e piattaforme in fase di sviluppo per sfidare ed espandere le conoscenze esistenti. L'eterogeneità intratumorale è un fattore cruciale che contribuisce alla progressione della malattia e alla resistenza alle attuali modalità di trattamento nei gliomi28. Recenti studi sui tumori cerebrali si sono concentrati su questo importante aspetto utilizzando saggi trascrittomici ed epigenomici monocellulari per caratterizza...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Single Cell Open Lab (scOpenLab) presso il German Cancer Center (DKFZ) per le discussioni utili. Questa ricerca è stata supportata dal German Cancer Aid, Max-Eder Program grant number 70111964 (S.T.).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-100ML | |
| Omogeneizzatore a Boccia Motivo | attivo | 40401 | |
| EDTA (0,5 M) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL Provette da centrifuga coniche | Fisher Scientific | 352096 | |
| Iodixanol (aka Optiprep) | Stem cell technologies | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 &; micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma | 63052-100ML | |
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Kit di isolamento dei nuclei: Nuclei EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| (20 &; micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Provette con blocco sicuro 1,5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Provette con blocco sicuro 2,0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| ATAC a cellula singola | 10x Genomica Espressione | ||
| genica a cellula singola | 10x Genomica Saccarosio | ||
| Sigma | S0389 | ||
| Puntali per pipette a foro largo (1000 & micro; L) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Puntali per pipette a foro largo (200 &; micro; L) | Themo Fisher Scientific | 2069GPK |
Riferimenti
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
- Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
- Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
- Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
- Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
- Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
- Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
- Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
- Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
- Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
- Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
- Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
