Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

Ashwin Narayanan; Enrique Blanco-Carmona; Engin Demirdizen; Xueyuan Sun; Christel Herold-Mende; Matthias Schlesner; Sevin Turcan

doi:10.3791/61542

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Articolo metodologico

Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq

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DOI:

10.3791/61542

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25 agosto 2020

Ashwin Narayanan¹ , Enrique Blanco-Carmona² , Engin Demirdizen¹ , Xueyuan Sun¹^,³ , Christel Herold-Mende⁴ , Matthias Schlesner² , Sevin Turcan¹

¹Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, ²Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), ³Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), ⁴Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

In questo articolo

Sommario

L'eterogeneità intratumorale è una caratteristica intrinseca dei tumori, compresi i gliomi. Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente che utilizza una combinazione di tamponi e centrifugazione a gradiente per isolare singoli nuclei da tessuti di glioma freschi congelati per studi di sequenziamento di RNA a nucleo singolo e ATAC.

Abstract

I gliomi diffusi adulti mostrano eterogeneità inter- e intra-tumorale. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli sforzi di profilazione molecolare su larga scala si sono concentrati su approcci di massa che hanno portato alla classificazione molecolare dei tumori cerebrali. Negli ultimi cinque anni, gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno evidenziato diverse caratteristiche importanti dei gliomi. La maggior parte di questi studi ha utilizzato campioni di tumore cerebrale fresco per isolare singole cellule utilizzando la citometria a flusso o metodi di separazione basati su anticorpi. Andando avanti, l'uso di campioni di tessuto appena congelati provenienti da biobanche fornirà una maggiore flessibilità alle applicazioni a singola cellula. Inoltre, con l'avanzare del campo a singola cellula, la prossima sfida sarà quella di generare dati multi-omici da una singola cellula o dalla stessa preparazione del campione per svelare meglio la complessità del tumore. Pertanto, protocolli semplici e flessibili che consentono la generazione di dati per vari metodi come il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq) e il test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (snATAC-seq) saranno importanti per il campo.

I recenti progressi nel campo delle singole cellule, insieme a strumenti microfluidici accessibili come la piattaforma di genomica 10x, hanno facilitato le applicazioni a singola cellula nei laboratori di ricerca. Per studiare l'eterogeneità dei tumori cerebrali, abbiamo sviluppato un protocollo avanzato per l'isolamento di singoli nuclei da gliomi freschi congelati. Questo protocollo unisce i protocolli a cella singola esistenti e combina una fase di omogeneizzazione seguita dalla filtrazione e dalla centrifugazione a gradiente mediata dal buffer. I campioni risultanti sono sospensioni di nuclei singoli puri che possono essere utilizzati per generare dati sull'espressione genica del singolo nucleo e sull'accessibilità della cromatina dalla stessa preparazione dei nuclei.

Introduzione

I gliomi diffusi di grado inferiore (LGG), il tumore cerebrale primario più comune negli adulti, sono neoplasie infiltrative che spesso si presentano nell'emisfero cerebrale. Gli LCG mostrano eterogeneità sia inter- che intra-tumorale, che non è guidata solo dalla popolazione tumorale, ma anche dalle cellule non maligne coinvolte in modo complesso nello sviluppo e nella progressione del tumore^1,^2,^3,^4,^5.

Nell'ultimo decennio, c'è stata una valanga di dati genomici raccolti nel cam....