Articolo metodologico

Mitigazione dell'attaccamento delle cellule trasmesse dal sangue agli impianti metallici attraverso l'immobilizzazione peptidica derivata da CD47

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DOI:

10.3791/61545

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3 dicembre 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentato qui è un protocollo per l'aggiunta di peptide CD47 (pepCD47) a stent metallici usando la chimica del polibisfosfonato. La funzionalizzazione degli stent metallici utilizzando pepCD47 impedisce l'attacco e l'attivazione di cellule infiammatorie migliorando così la loro biocompatibilità.

Abstract

Le complicazioni chiave associate agli stent bare metal e agli stent di eluizione dei farmaci sono rispettivamente la restenosi in-stent e la trombosi dello stent tardivo. Pertanto, migliorare la biocompatibilità degli stent metallici rimane una sfida significativa. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere una robusta tecnica di modifica della superficie metallica da parte di peptidi biologicamente attivi per aumentare la biocompatibilità degli impianti medici che contattano il sangue, compresi gli stent endovascolari. CD47 è un marcatore immunologico specifico per specie di sé e ha proprietà antinfiammatorie. Studi hanno dimostrato che un peptide aminoacido 22 corrispondente al dominio Ig del CD47 nella regione extracellulare (pepCD47), ha proprietà antinfiammatorie come la proteina a figura intera. Studi in vivo sui ratti e studi ex vivo su sistemi sperimentali di conigli e sangue umano del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'immobilizzazione pepCD47 sui metalli migliora la loro biocompatibilità prevenendo l'attaccamento e l'attivazione delle cellule infiammatorie. Questo documento descrive il protocollo passo-passo per la funzionalizzazione delle superfici metalliche e l'attacco peptidico. Le superfici metalliche sono modificate utilizzando bisfosfato di poliallammina con gruppi tioli latenti (PABT), seguiti dalla deprotezione dei tioli e dall'amplificazione dei siti tiolo-reattivi per reazione con polietileneimina installata con gruppi piridilditio (PEI-PDT). Infine, pepCD47, incorporando residui terminali di cisteina collegati alla sequenza peptidica del nucleo attraverso un doppio distanziale 8-ammino-3,6-diossa-ottanoil, sono attaccati alla superficie metallica tramite legami disolfuro. Questa metodologia di attacco peptidico alla superficie metallica è efficiente e relativamente economica e può quindi essere applicata per migliorare la biocompatibilità di diversi biomateriali metallici.

Introduzione

L'intervento coronarica percutanea è la prima linea di terapia per il trattamento delle malattie coronarie (CAD) e comporta principalmente lo stenting delle arterie mante. Tuttavia, la restenosi in-stent (ISR) e la trombosi stent sono complicazioni comuni associate alla distribuzione stent1. L'interazione del sangue all'interfaccia sangue-stent è caratterizzata da un adsorbimento quasi immediato delle proteine plasmatiche sulla superficie metallica, seguito da attacco piastrinica e cellulare infiammatorio e attivazione2. Il rilascio delle citochine infiammatorie e delle chemiochine dalle cellule infiammatorie attivate porta alla modifica fenotipica delle cellule muscolari lisce vascolari (VSPC) nel supporto di tunica e innesca la loro migrazione centripeta al compartimento intimale. La proliferazione del VSMC attivato nell'intima si traduce in ispessimento dello strato intimale, restringimento del lume e restenosi in-stent3. Gli stent di eluizione dei farmaci (DES) sono stati sviluppati per prevenire la proliferazione vsmc; tuttavia, questi farmaci hanno un effetto citotossico fuori bersaglio sulle cellule endoteliali4,5. Pertanto, la trombosi dello stent tardivo è una complicazione comune associata al DES6,7. Gli stent fatti di polimeri biodegradabili, come il poli-L-lactide, hanno mostrato molte promesse negli esperimenti sugli animali e negli studi clinici iniziali, ma alla fine sono stati richiamati quando l'uso clinico "reale" ha dimostrato la loro inferiorità alla3a generazione DES8. Pertanto, è necessario migliorare la biocompatibilità degli stent bare metal per ottenere risultati migliori per i pazienti.

CD47 è una proteina transmembrana espressa onnipresente che inibisce la risposta immunitaria innata quando è legata al suo recettore imparentato Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. Il recettore SIRPα ha un dominio ITIM (Immune Cell Tyrosine Inhibitory Motif) e gli eventi di segnalazione sull'interazione SIRPα - CD47 alla fine si traducono nella downregolazione dell'attivazione cellulareinfiammatoria 10,,11,,12,,13. La ricerca nel nostro laboratorio ha dimostrato che il CD47 ricombinante o la sua derivata peptidica, corrispondente al dominio Ig aminoacido 22 della regione extracellulare di CD47 (pepCD47), può ridurre la risposta immunitaria dell'ospite a una gamma di biomateriali clinicamenterilevanti 14,,15,,16. Recentemente, abbiamo dimostrato che pepCD47 può essere immobilizzato su superfici stent in acciaio inossidabile e ridurre significativamente la risposta fisiopatofitica associata alla restenosi. Si noti che le superfici modificate pepCD47 sono adattabili alle condizioni di utilizzo rilevanti come lo stoccaggio a lungo termine e la sterilizzazione dell'ossido dietilene 17. A tal fine, pepCD47 può essere un utile bersaglio terapeutico per affrontare i limiti clinici degli stent endovascolari.

La strategia per l'attacco covalente di pepCD47 a una superficie metallica comporta una serie di nuove modifiche chimiche della superficie metallica. Le superfici metalliche sono rivestite per la prima volta con bisfosfonato di poliallammina con gruppi tioli latenti (PABT), seguiti dalla deprotezione dei tioli e dall'attacco della polietileneimina (PEI) con gruppi piridilditio installati (PDT). I gruppi PDT di PEI non consumati nella reazione con tioli PABT deprotetti vengono quindi reagiti con pepCD47 incorporando tioli nei residui terminali di cisteina, con conseguente legame del pepCD47 alla superficie metallica attraverso un legame disolfuro14,,17,18. Abbiamo usato un pepCD47 coniugato al fluoroforo (TAMRA-pepCD47) per determinare la concentrazione di ingresso del peptide che si traduce nella massima immobilizzazione superficiale del peptide. Infine, abbiamo valutato la capacità antinfiammatoria acuta e cronica delle superfici metalliche rivestite in pepCD47, ex vivo, utilizzando rispettivamente l'apparato ad anello Chandler e il test di attacco monocito / espansione del macrofago.

Questo documento fornisce un protocollo sistematico per l'attacco di peptidi tiolati alla superficie metallica; determinare la massima densità di immobilizzazione del peptide; e valutare le proprietà antinfiammatorie delle superfici metalliche rivestite in pepCD47 esposte al sangue intero e ai monociti isolati.

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Protocollo

Tutti i campioni umani per questo esperimento sono stati ottenuti in conformità con l'IRB del Children's Hospital di Filadelfia. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti previa approvazione da parte della IACUC del Children's Hospital di Filadelfia.

1. Rivestimento di superfici bare metal con PEI-PDT

  1. Lavare i tagliandi in lamina di acciaio inossidabile (1 cm x 1 cm o 0,65 cm x 1 cm) o i dischi in rete in acciaio inossidabile con 2-isopropanolo in uno shaker (60 °C, velocità di 200 giri/min) per 5 min. Eseguire questo passaggio 2x. Quindi lavare 2 volte con cloroformio (60 °C, velocità di 200 giri/min) per 10 minuti ciascuno.
  2. Posizionare i campioni di acciaio inossidabile puliti in un forno a 220 °C per 30 minuti.
  3. Preparare 5 mL dello 0,5% della soluzione PABT sciogliendo 25 mg di bisfosfonato di poliallammina con gruppi latali latenti (PABT) e 5 mg di bicarbonato di potassio (KHCO3)in 5 mL di DDW e incubare a 72 °C in uno shaker a 200 giri/min per 30 minuti.
    NOTA: Per la sintesi PABT fare riferimento alla letteratura precedentementepubblicata 18.
  4. Immergere i fogli al forno o i dischi a rete in una soluzione acquosa allo 0,5% di PABT e incubare in uno shaker (72 °C, velocità di 200 giri/min) per 1 h.
  5. Lavare i campioni modificati con PABT con acqua distillata deionizzata (DDW) per 5x, trasferire i campioni in una nuova fiala e lavare di nuovo con DDW per 5x.
  6. Preparare un totale di 5 mL di soluzione di TCEP (12 mg/mL) sciogliendo 60 mg di cloridrato di fosfina tris (2-carbossietile) (TCEP) in 5 mL di tampone acetico da 0,1 M (0,57 mL di acido acetico glaciale, 820 mg di acetato di sodio in 100 mL di DDW).
  7. Trattare i campioni modificati con PABT con TCEP per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) su uno shaker.
    NOTA: Il TCEP viene utilizzato per deproteggere i gruppi tiolo.
  8. Degas DDW in un pallone inferiore rotondo utilizzando un dispositivo di generazione del vuoto, come un liofilizzatore e lavare i fogli trattati con TCEP o dischi a rete con DDW degassato per 5x. Trasferire i campioni in una nuova fiala e lavare inoltre 5 volte con DDW degassato.
    NOTA: È fondamentale lavorare velocemente per prevenire l'ossidazione dei tioli sulla superficie metallica da parte dell'ossigeno atmosferico.
  9. Preparare 5 mL di soluzione PEI-PDT all'1% di diluizione di 212,5 μL di PEI-PDT stock e 125 μL di acetato di sodio 0,4 M in DDW degassato. Eseguire il passaggio 1.9 contemporaneamente al passaggio 1.8 per ridurre al minimo l'esposizione dei campioni all'aria atmosferica.
    NOTA: La sintesi di PEI-PDT è descritta nella letteratura precedentemente pubblicata18.
  10. Incubare i provini in acciaio inossidabile lavati con l'1% di PEI-PDT. Sostituire l'aria con gas argon, sigillare i flaconcini ermetici e mescolare su uno shaker a RT per 1 h. Procedere immediatamente con la coniugazione peptidica o conservare a 4 °C fino a 1 settimana.

2. Attaccamento e valutazione qualitativa/quantitativa della ritenzione di pepCD47 coniugata al fluoroforo sulla superficie metallica mediante microscopia a fluorescenza e fluorimetria

  1. Lavare i tagliandi foil o i dischi a rete preparati come descritto nella sezione 1, passaggi 1.1-1.10 precedenti con DDW 5x. Trasferire i campioni su un nuovo flaconcino e lavare con DDW per ulteriori 5x. Infine lavare 2x con etanolo degassato e 2x con dimetil formamide degassata (DMF).
  2. Preparare la soluzione stock di pepCD47 coniugata con tetrametillrhodamina (TAMRA) sciogliendo la polvere pepCD47 coniugata tamra nella dimetilformamide degassata (DMF) a una concentrazione finale di 1 mg/mL. Aliquota la soluzione stock in assegnazioni da 1 mL. Conservare in tubi ben sigillati in atmosfera argon a -20 °C.
  3. Diluire 1 mg/mL della soluzione stock di pepCD47 coniugato con TAMRA utilizzando DMF degassato per preparare le seguenti concentrazioni di pepCD47 coniugato al fluoroforo - 10, 30, 100 e 200 μg/mL.
    NOTA: Se il pepCD47 coniugato da TAMRA sembra precipitato, ridurre la soluzione pepCD47 coniugata da TAMRA in magazzino utilizzando perline TCEP nel rapporto 1:1, a RT per 20 minuti. Si noti che prima di aggiungere il pepCD47 coniugato TAMRA alle perline TCEP, ruotare la soluzione di perline TCEP, rimuovere il supernatante e quindi procedere con l'aggiunta del pepCD47 coniugato TAMRA.
  4. Incubare i tagliandi in foil modificati PEI-PDT con 10, 30, 100 o 200 μg/mL di pepCD47 coniugato DA TAMRA in triplicati per ogni condizione su uno shaker a RT in atmosfera argon per 1 ora. Incubare dischi mesh modificati PEI-PDT, così come il disco mesh non modificato oltre il passaggio 1.2 (controlli bare metal) con 100 μg/mL di pepCD47 coniugato TAMRA in triplicati a RT in atmosfera argon su uno shaker per 1 h.
    NOTA: Da questo passaggio in poi, le fiale sono avvolte in un foglio di alluminio per proteggere il contenuto dalla luce.
  5. Lavare le superfici rivestite di pepCD47 coniugate al fluoroforo per rimuovere il peptide non covalentemente attaccato nel seguente ordine: DMF (3x), DMF/DDW a 1:1, DDW (3x), 0,3% SDS in 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 min ciascuno a 70 °C su uno shaker), DDW (3x), cambiare flaconcini e un lavaggio DDW finale.
  6. Posizionare il controllo e i dischi a rete coniugati covalentemente su un vetro del microscopio, aggiungere 50 μL di PBS e posizionare una coverlip. Dischi a rete di immagini che utilizzano un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un set di filtri romammina. Scatta immagini rappresentative con ingrandimento 100x.
  7. Preparare 15 mL di soluzione TCEP da 12 mg/mL sciogliendo 180 mg di TCEP in miscela 1:1 v/v di metanolo e tampone acetico da 0,1 M.
  8. Incubare ogni foglio lavato con 1 mL di soluzione TCEP su uno shaker a RT per 15 minuti.
  9. Preparare i seguenti standard diluire in serie lo stock di pepCD47 coniugato tamra (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,01 μg/mL. Utilizzare la soluzione TCEP come diluente.
  10. Analizzare il pepCD47 coniugato TAMRA rilasciato dalla superficie metallica rispetto alla curva di calibrazione generata utilizzando gli standard della fluorimetria a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione a 544/590 nm.

3. Fissaggio di pepCD47 umano a superfici modificate PEI-PDT

  1. Lavare i campioni rivestiti in PEI-PDT formulati come descritto nella sezione 1, passaggi 1.1-1.10 precedenti, con DDW 5x degassato, cambiare il flaconcino e lavare con DDW 5x degassato.
  2. Preparare la soluzione di brodo pepCD47 umano (1 mg/mL) sciogliendo la polvere di pepCD47 umano in acido acetico degassato al 50% per ottenere una concentrazione di 1 mg/mL.
  3. Preparare la concentrazione di lavoro del pepCD47 umano (100 μg/mL) sciogliendo 500 μL dello stock di pepCD47 umano in 4.500 μL di saline tamponata con fosfato degassato (PBS).
  4. Incubare i campioni rivestiti in PEI-PDT lavati con 100 μg/mL di pepCD47 a RT con scuotimento per 1 h.
  5. Lavare i campioni rivestiti con pepCD47 umano per rimuovere il peptide in eccesso nel seguente ordine PBS (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min ciascuno), DDW (3x), cambiare flaconcini e lavaggio DDW finale.
    NOTA: Le superfici rivestite in pepCD47 umano possono essere conservate asciutte a 4 °C per un massimo di 6 mesi.

4. Rivestire le superfici modificate PEI-PDT con sequenza strapazzata (Scr)

  1. Sciogliere la polvere di sequenza strapazzata in acido acetico degassato dello 0,1% per preparare una soluzione stock di 1 mg/mL.
  2. Preparare una soluzione di 100 μg/mL di peptide strapazzato sciogliendo 500 μL di acido acetico in 4.500 μL di acido acetico degassato allo 0,1%.
  3. Rivestire i campioni di PEI-PDT lavati con 100 μg/mL di peptide strapazzato a RT con scuotimento per 1 h.
  4. Per rimuovere il peptide strapazzato non attaccato, lavare le superfici nel seguente ordine 0,01% acido acetico (3x), DDW (3x), 0,2% Tween-20 (3x, 5 min), DDW (3x), cambiare flaconcini e un lavaggio DDW.

5. Ciclo Chandler per l'analisi dell'attacco cellulare alle superfici metalliche

  1. Rivestire le lamine metalliche (0,65 cm x 1 cm) con pepCD47 umano o peptide strapazzato secondo la descrizione della sezione 1 seguita da 3 o 4.
  2. Tagliare tubi in PVC da 1/4" in tre pezzi lunghi 38 cm.
  3. Inserire fino a 8 fogli metallici modificati peptidici o pepCD47 non modificati in tre tubi diversi.
  4. Raccogliere 30 mL di sangue da donatori umani sani senza farmaci anti-piastrinica secondo il protocollo istituzionale IRB. Precaricare la siringa con 1 ml di citrato di sodio al 4% per prevenire la coagulazione del sangue raccolto.
  5. Mettere 10 ml di sangue in ogni tubo utilizzando una siringa da 10 ml e collegare le estremità con adattatori metallici. Posizionare i tubi pieni di sangue sulle ruote dell'apparato ad anello Chandler.
  6. Passare il sangue lungo le lamine metalliche per rotazione della ruota a 37 °C alla velocità calcolata per produrre la cesoia di 25 dyns/ cm2 per 4 ore.
  7. Scolare il sangue dai tubi e smaltire il sangue secondo i requisiti IRB.
  8. Tagliare i tubi usando il bisturi per recuperare le pellicole da ogni tubo.
  9. Preparare la soluzione di glutaraldeide al 2% diluire i 10 ml di soluzione di glutaraldeide al 4% utilizzando 10 ml di tampone di cacodilato di sodio con cloruro di sodio da 0,1 M.
  10. Incubare i fogli in soluzione di glutaraldeide al 2% per 15 minuti e conservare a 4 °C durante la notte. Prima di analizzare, lavare le pellicole metalliche 3 volte con PBS.

6. Analisi dell'attacco cellulare alle superfici metalliche utilizzando il colorante CFDA

  1. Caldo 8 ml di PBS in tubo da 15 mL in un bagno d'acqua impostato su 37 °C.
  2. Preparare la soluzione di colorante CFDA (carbossi-fluoresceina diacetato, estere succinimidilico) come segue - aggiungere 90 μL di DMSO a una fiala colorante CFDA per ottenere una concentrazione di scorte di 10 mM. Successivamente, preparare la concentrazione di lavoro di 93,75 μM aggiungendo 75 μL del CFDA stock a 8 mL di PBS caldo. Mescolare invertendo i tubi un paio di volte e coprire il tubo con un foglio di alluminio.
    NOTA: Si consiglia di preparare al momento il colorante CFDA prima di ogni utilizzo.
  3. Incubare ogni foglio con 1 mL di colorante CFDA in una piastra da 24 pozza. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare la piastra a 37 °C per 15 minuti.
  4. Lavare i fogli metallici 3x con PBS per rimuovere il colorante in eccesso. Immagine che utilizza il microscopio a fluorescenza invertita.

7. Attacco monocito ed espansione del macrofago sulle superfici pepCD47 modificate e bare metal

  1. Raccogliere 10 mL di sangue periferico attraverso l'accesso vena cava durante il sacrificio di un topo Sprague-Dawley maschio da 400-450 g. Mescolare immediatamente con 1.000 UI di eparina di sodio per prevenire la coagulazione.
  2. Pipetta 10 mL di mezzo gradiente di densità in un tubo conico da 50 ml. Mescolare il sangue con 5 mL di PBS e sovrapporre accuratamente il sangue diluito sul mezzo gradiente di densità utilizzando una pipetta Pasteur. Centrifuga in un rotore a benna oscillante a 800 x g e 18-25 °C per 20 minuti con impostazioni minime di accelerazione e decelerazione.
  3. Utilizzando una pipetta Pasteur, raccogliere uno strato opaco di cappotto buffy sull'interfaccia tra plasma e Ficoll. Diluire il mantello buffy 1:3 con PBS e centrifuga a 550 x g e 4 °C per 10 min per le cellule del mantello buffy.
  4. Sospendere di nuovo le cellule del mantello di buffy in 3 mL di tampone di lysis ACK per lizzare gli eriociti contaminanti. Incubare sul ghiaccio per 4 minuti. Aggiungere 12 mL di buffer di separazione cellulare (CSB; 0,5% BSA, 0,5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
  5. Centrifuga a 550 x g e 4 °C per 10 min. Sospendere di nuovo il pellet in 10 mL di CSB.
  6. Centrifuga a 200 x g e 4 °C per 10 minuti per eliminare le piastrine. Ripeti due volte.
  7. Sospendere di nuovo il pellet in 500 μL di CSB. Aggiungere 10 μg di ciascuno dei seguenti anticorpi anti-ratto del mouse: CD8a (clone OX-8), anti-CD5 (clone OX-19), anti-CD45RA (clone OX-33) e anti-CD6 (clone OX-52).
  8. Incubare a 4 °C su un rotatore verticale del tubo per 1 h. Aggiungere 9,5 mL di CSB. Centrifuga a 300 x g e 4 °C per 10 min. Scartare il supernatante, sospendere di nuovo il pellet in 10 mL di CSB e ripetere la centrifugazione.
  9. Sospendere di nuovo il pellet in 500 μL di CSB. Aggiungere 150 μL di microperline IgG di capra anti-topo. Incubare a 4 °C su un rotatore verticale del tubo per 20 min. Centrifuga a 300 x g e 4 °C per 10 min.
  10. Scartare il supernatante. Sospendere di nuovo il pellet in 1 mL di CSB.
  11. Posizionare una colonna LS in un separatore magnetico.  Innescare la colonna LS con 3 mL di CSB. Eliminare la velocità effettiva della colonna. Aggiungere 1 mL di pellet di cella ri-sospeso dal passo 7.10. Inizia a raccogliere la velocità effettiva. Dopo l'interruzione del flusso, aggiungere 5 mL di CSB e continuare a raccogliere la velocità effettiva della colonna fino all'interruzione del flusso.
  12. Centrifugare la velocità effettiva della colonna (6 mL) contenente monociti selezionati negativamente a 300 x g e 4 °C per 10 min. Sospendere nuovamente il piccolo pellet risultante in 2 mL di mezzo RPMI-1640 integrato con 10% FCS, 1% penna/streptocondo e 100 ng/mL ratto macrofago colonia fattore stimolante (M-CSF).
  13. Conta i monociti usando l'emocitometro. Regolare la concentrazione di monociti a 5 x 105 celle/mL.
  14. Aggiungere 1 mL di volumi di sospensione monocitare ai singoli pozzi di una piastra da 12 pozzali con i campioni di lamina di acciaio inossidabile nudo (N=3) o campioni di acciaio inossidabile modificati con pepCD47 di ratto (N=3) come da 1.1-1.10 e 3.1-3.6.
  15. Cambiare il mezzo nei giorni 3 e 5 dopo la semina. Il giorno 6 dopo la semina lavare le cellule con PBS e fissare con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 min. Lavare due volte con PBS per 5 minuti.
  16. Rimuovere le lamine in acciaio inossidabile e posizionarle singolarmente in una nuova piastra da 12 pozza. Non capovolgere i fogli.
  17. Incubare in 0,5% Tween-20/PBS per 15 minuti per permeabilizzare le cellule. Lavare due volte con PBS per 5 minuti.
  18. Blocca nel siero di capra al 10% / PBS per 20 minuti. Aspirare il siero. Non lavare. Aggiungere l'anticorpo CD68 anti-ratto del topo (diluito 1:100 in 1%BSA/PBS). Incubare a temperatura ambiente per 1 h. Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
  19. Aggiungere capra anti-mouse IgG Alexa Fluor 546 (diluito 1:200 in 1% BSA/PBS). Incubare al buio a temperatura ambiente per 45 minuti. Lavare in PBS per 5 minuti. Controsostenibile con colorante Hoechst 33342 da 1 μg/mL al buio a temperatura ambiente per 10 min. Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti ciascuno.
  20. Capovolgere le pellicole e l'immagine utilizzando un microscopio fluorescente con l'ottica invertita. Acquisisci immagini con ingrandimento 200x con impostazioni del filtro blu e rosso.
  21. Contare i monociti allegati nelle singole immagini e calcolare le medie di gruppo e le deviazioni standard.

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Risultati

Le superfici metalliche sono rese tiolo-reattive per l'attacco peptidico attraverso una serie di modifiche chimiche, come illustrato nella figura 1. L'incubazione PABT seguita dal trattamento PEI-PDT rende la superficie metallica suscettibile per l'attacco peptidico. Peptide CD47 (pepCD47) contenente residui di cisteina a C-terminale uniti alla sequenza pepCD47 del nucleo attraverso un ponte duale AEEAc flessibile è collegato covalentemente alle superfici tiolo-reattive tramite legami disolf...

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Discussione

Dimostriamo e descriviamo una strategia chimica relativamente nuova per aggiungere moieties peptidiche terapeutiche a una superficie in acciaio inossidabile con l'obiettivo generale di ridurre la reattività della superficie con cellule infiammatorie trovate nel sangue. La chimica del bisfosfonato descritta nel presente documento comporta la coordinazione della formazione di legami tra gli ossidi metallici e i gruppi bisfosfonati del PABT. Lo spessore del monostrato di polibisfosfonato formato sulla superficie metallica n...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Lo sviluppo del protocollo e gli studi presentati in questo documento sono stati supportati dai finanziamenti NIH (NBIB) R01 (# EB023921) a IF e SJS e dai finanziamenti NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) a IF e RJL.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 M Tris-HCLInvitrogen15567-027pH - 7,5
4% GlutaraldeideMicroscopia elettronica Scienze16539-07
4% Citrato di sodioSigmaS5770
ACK tampone di lisiQualità Biologici118-156-721
anti-CD45RA Ab (topo anti-ratto; clone OX-19)Biolegend202301
anti-CD5 Ab (topo anti-ratto; clone OX-19)Biolegend203501
anti-CD6 Ab (topo anti-ratto; clone OX-52)BD Biosciences550979
anti-CD68 Ab (topo anti-ratto; clone ED-1)BioRadMCA341
anti-CD8a Ab (topo anti-ratto; clone OX-8)Biolegend201701
Cloroformio certificato ACSFisher ChemicalC298-500
Dimetil Formammide (DMF)Alfa Aesar39117
Embra griglia in acciaio inossidabileMicroscopia elettronica ScienzeE200-SSrete in acciaio inossidabile dischi a rete
Ficoll HypaqueGE Healthcare17-1440-02
Acido acetico glacialeACROS organico148930025
capra anti-topo IgG Alexa FluorThermoFisherA11030
Eparina sodicaSagent Pharmaceuticals402-01
Human pepCD47Bachem4099101
IsopropanoloFisher ChemicalA426P-4
Adattatori metalliciRaccordo Leur6515INDAdattatore a 1 via 316 ss 1/4"-5/16" zappe end
MetanoloRICCA azienda chimica4829-32
MicroscopioNikon EclipseTE300
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco14190-136
Bicarbonato di pottasio (KHCO3)Fisher ChemicalP184-500
Tubi in PVCTerumo-CVS600501/4" X 1/16 8'
tampone di cacodilato di sodio con 0,1 M di cloruro di sodioElettrone Scienze della microscopia11653
Sodio dodecil solfato (SDS)laboratori Bio-Rad161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2)Alfa AesarA13184
Src peptideBachem4092599
Campioni a forma di cilindro in acciaio inossidabile (AISI 304) con un lumeMicrogroup, Medway, MA200973281 cm X 6 mm OD
Fogli di acciaio inossidabile (AISI 316L)Substrato di Goodfellow, Coraopolis, PA100 mm X 100 mm X 0,05 mm
PepCD47 coniugato con tetrametilrodamina (TAMRA-pepCD47)Substrato di Bachem4100277
TMB (3,3' ,5,5' -tetrametilbenzidina) e tris (2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP)Thermo ScientificPG82089
laboratori Tween-20Bio-Rad170-6531
Kit tracciante cellulare Vybrant CFDA SEInvitrogenV12883

Riferimenti

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