Le persone con mutazioni BRCA1 hanno un rischio più elevato di sviluppare il cancro, il che giustifica una valutazione accurata della funzione delle varianti BRCA1. Nel presente documento, abbiamo descritto un protocollo per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base citosina mediati da CRISPR che consentono la conversione da C:G a T:A mirata nelle celle viventi.
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Articolo metodologico
Valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base mediati da CRISPR
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studi recenti hanno studiato i rischi associati alle mutazioni geniche BRCA1 utilizzando vari metodi di valutazione funzionale come test fluorescenti dei reporter, test di vitalità delle cellule staminali embrionali e test terapeutici di sensibilità a base di farmaci. Sebbene abbiano chiarito molte varianti brca1, questi test che coinvolgono l'uso di varianti BRCA1 espresse esogenamente sono associati a problemi di sovraespressione e non possono essere applicati alla regolamentazione post-trascrizionale. Per risolvere queste limitazioni, abbiamo precedentemente segnalato un metodo per l'analisi funzionale delle varianti BRCA1 tramite l'editor di base di citosina mediato da CRISPR che induce una sostituzione mirata dei nucleotidi nelle cellule viventi. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato varianti le cui funzioni rimangono ambigue, tra cui c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T e c.4986+5G>A, e abbiamo confermato che gli editor di base mediati da CRISPR sono strumenti utili per riclassificare le varianti di significato incerto in BRCA1. Qui, descriviamo un protocollo per l'analisi funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando l'editor di base citosina basato su CRISPR. Questo protocollo fornisce linee guida per la selezione dei siti di destinazione, l'analisi funzionale e la valutazione delle varianti BRCA1.
Introduzione
Il gene della suscettibilità al cancro al seno di tipo 1(BRCA1)è un gene soppressore tumorale ampiamente noto. Poiché il gene BRCA1 è correlato alla riparazione del danno al DNA, le mutazioni in questo gene porterebbero a un maggiore rischio di sviluppo del cancro in unindividuo 1. I tumori al seno, alle ovaie, alla prostata e al pancreas sono legati a mutazioni ereditarie della perdita di funzione (LOF) del gene BRCA1 2. La valutazione funzionale e l'identificazione delle varianti BRCA1 possono aiutare a prevenire e diagnosticare le varie malattie. Per affrontare la funzione delle var....
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Protocollo
NOTA: il metodo 1 (generazione di linee cellulari HAP1-BE3) è facoltativo. Invece di costruire una linea cellulare che esprime BE3, il DNA plasmide codificante BE3 può essere co-trasfetto con DNA plasmide codificante con gRNA. Altre varianti di editor di base citosina, come BE4max, possono anche essere utilizzate per l'editing di base altamente efficiente.
1. Generazione di linee cellulari HAP1-BE3
- Costruzione di DNA plasmide
- Per costruire il DNA plasmide lentiBE3-blast per la produzione di lentivirus, amplificare le sequenze di codifica BE3 in pCMV-BE3(Table of Materials)da PCR utilizzando polimerasi ad a....
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Risultati
Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la valutazione funzionale delle varianti endogene BRCA1 generate dagli editor di base citosina basati su CRISPR. Per selezionare linee cellulari appropriate per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1, i ricercatori dovrebbero confermare che BRCA1 è un gene essenziale nelle linee cellulari mirate. Ad esempio, abbiamo prima trasfetto Cas9 e gRNA in linee cellulari HAP1 per interrompere BRCA1 e analizzato le frequ.......
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Discussione
Questo protocollo descrive un metodo semplice per le valutazioni funzionali delle varianti BRCA1 utilizzando l'editor di base citosina meditato da CRISPR. Il protocollo descrive i metodi per la progettazione di gRNA al locus bersaglio e la costruzione dei DNA plasmidici da cui sono espressi. Gli editor di base citosina inducono la conversione nucleotidica in una finestra attiva (nel caso di BE3, nucleotidi 4-8 nell'estremità pam-distale delle sequenze bersaglio del gRNA). Il ricercatore dovrebbe scegliere attent.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea (sovvenzioni 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 e 2018R1A5A2020732 a Y.K.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BamHI | NEB | R3136 | Enzima di restrizione |
| Blasticidina | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Farmaco per la selezione di cellule trasdotte |
| BsaI | NEB | R0535 | Enzima di restrizione |
| DNeasy Blood & Kit Tessuto | Qiagen | 69504 | Kit di preparazione DNA genomico |
| Dulbecco' s Eagle modificato' s medium | Gibco | 11965092 | Medium per HEK293T/17 cellule |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000036 | Supplemetal per colture cellulari |
| FuGENE HD Reagente di trasfezione | Promega | E2311 | Reagente di trasfezione |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Kit di montaggio Gibson |
| Iscove' s modificato Dulbecco' s medium | Gibco | 12440046 | Medium per cellule HAP1 |
| lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmidi DNA per clonazione lentiBE3 |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Reagente di trasfezione |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Materiali di trasfezione |
| pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmidi DNA per lentiBE3 Clonaggio |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140 | Supplemetal per colture cellulari |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | NEB | M0530SQ | Polimerasi ad alta fedeltà |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmidi DNA per la preparazione del virus. |
| pRG2 | Addgene | 104174 | vettore di clonaggio del gRNA |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | DNA dei plasmidi per la preparazione del virus. |
| Kit QIAprep Spin Miniprep | Qiagen | 27106 | Kit di preparazione del DNA plasmidico |
| QIAquick Kit di estrazione del gel | Qiagen | 28704 | Kit di estrazione del gel |
| QIAquick Kit di purificazione PCR | Qiagen | 28104 | Kit di preparazione del prodotto PCR |
| Kit di legatura rapida | NEB | M2200 | Ligasi per clonazione di gRNA |
| Endonucleasi T7 I | NEB | M0302 | Materiali per test T7E1 |
| XbaI | NEB | R0145 | Enzima di restrizione |
Riferimenti
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Bre....
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Ristampe e permessi
