Articolo metodologico
A seguito di infezione virale, il rene ospita un numero relativamente elevato di cellule CD8+ T e offre l'opportunità di studiare le cellule T RM nonmucose. Qui descriviamo un protocollo per isolare i linfociti renali del topo per l'analisi della citometria del flusso.
La cellula T di memoria residente nei tessuti (TRM)è un campo in rapida espansione della ricerca immunologica. Isolare le cellule T da vari tessuti non linfoidi è uno dei passaggi chiave per indagare leT RM. Ci sono lievi variazioni nei protocolli di isolamento dei linfociti per diversi organi. Il rene è un organo non linfoide essenziale con numerose infiltrazioni delle cellule immunitarie soprattutto dopo l'esposizione agli agenti patogeni o l'attivazione autoimmune. Negli ultimi anni, diversi laboratori tra cui il nostro hanno iniziato a caratterizzare cellule CD8+ T residenti nei reni in vari contesti fisiologici e patologici sia nel topo che nell'uomo. A causa dell'abbondanza di linfociti T, il rene rappresenta un organo modello attraente per studiare le TRMnei tessuti non mucosi o non barriera. Qui, descriveremo un protocollo comunemente usato nei laboratori focalizzati su TRMper isolare le cellule CD8+ T dai reni del topo a seguito di infezione virale sistemica. In breve, utilizzando un modello di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV) nei topi C57BL/6, dimostriamo l'etichettatura intravascolare delle cellule CD8+ T, la digestione enzimatica e la centrifugazione del gradiente di densità per isolare e arricchire i linfociti dai reni del topo per preparare i campioni per la successiva analisi citometrica del flusso.
Le cellule T di memoria residente nei tessuti (TRM)rappresentano una delle popolazioni di cellule T più abbondanti nei topi adulti umani e infetti. Le cellule TRM forniscono la prima linea di difesa immunitaria e sono coinvolte criticamente in vari processi fisiologici epatologici 1,2,3,4,5. Confrontandosi con le cellule T circolanti, le celle TRM trasportano marcatori di superficie distinti con programmi di trascrizioneunivoci 6,
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Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti a seguito di questo protocollo devono essere approvati dal rispettivo Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). Tutte le procedure qui descritte sono state approvate da IACUC UT Health San Antonio.
1. Trasferimento adottivo di cellule P14 T in destinatari C57BL/6 e infezione da LCMV
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Il protocollo qui descritto è riassunto in un diagramma di flusso (Figura 1A). Al giorno 30 dopo l'infezione da LCMV, abbiamo eseguito l'etichettatura intravascolare delle cellule CD8+ T. 5 minuti dopo, entrambi i reni dell'animale sono stati sezionati, tritati e sottoposti a digestione della collagenasi. I linfociti sono stati ulteriormente purificati dai campioni digeriti tramite centrifugazione Percoll e analizzati per citometria a flusso. Come mostrato nella
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Poiché l'immunità specifica dei tessuti è un'area di ricerca in rapida espansione, l'accumulo di prove suggerisce che le cellule immunitarie, in particolare la popolazione di linfociti, possono essere identificate in quasi tutti gli organi di topi adulti umani o infetti o immunizzati. Il modello di infezione da topo LCMV è un modello consolidato per studiare la differenziazione cellulare T specifica dell'antigene, dell'effettore e della memoria, compresa la biologia TRM su più tessuti. Qui, abbiamo descritto u.......
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Gli autori non hanno informazioni finanziarie pertinenti.
Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH AI125701 e AI139721, dal programma CLIP del Cancer Research Institute e dalla sovvenzione RSG-18-222-01-LIB alla N.Z. Ringraziamo Karla Gorena e Sebastian Montagnino di Flow Cytometry Facility. I dati generati nel Flow Cytometry Shared Resource Facility sono stati supportati dall'University of Texas Health Science Center di San Antonio (UTHSCSA), dalla sovvenzione NIH/NCI P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] presso UTHSCSA) e ul1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| Provette coniche da 15 ml | Corning | 431470 | |
| Siringa da 3 ml | Incubatore BD | 309657 | |
| 37C | Anticorpo VWR | ||
| Biotina a-CD8a (Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Siero di vitello | GE Healthcare Life Scienze | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Pipette monouso a trasferimento graduato | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Siringa da insulina | BD | 329424 | |
| Forbici a molla per micro dissezione | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naï ve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| lampada termica a soffitto | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Mouse in ottone massiccio Refrattario | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Centrifuga a secchio oscillante con frigorifero | Thermofisher | ||
| Piastra a 6 pozzetti per colture tissutali | Corning | 3516 |
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