Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari

Sommario

Presentato qui è un protocollo per l'imaging a cellule vive a super-risoluzione nel tessuto intatto. Abbiamo standardizzato le condizioni per l'imaging di una popolazione di cellule staminali adulte altamente sensibile nel suo ambiente di tessuti nativi. Questa tecnica prevede il bilanciamento della risoluzione temporale e spaziale per consentire l'osservazione diretta dei fenomeni biologici nei tessuti vivi.

Abstract

Da tempo c'è stato un compromesso cruciale tra risoluzione spaziale e temporale nell'imaging. L'imaging oltre il limite di diffrazione della luce è stato tradizionalmente limitato per essere utilizzato solo su campioni fissi o cellule vive al di fuori del tessuto etichettate con un forte segnale fluorescente. Le attuali tecniche di imaging a celle vive a super-risoluzione richiedono l'uso di speciali sonde a fluorescenza, alta illuminazione, acquisizioni di immagini multiple con elaborazione post-acquisizione o spesso una combinazione di questi processi. Questi prerequisiti limitano significativamente i campioni biologici e i contesti a cui questa tecnica può essere applicata.

Qui descriviamo un metodo per eseguire l'imaging a celle vive a fluorescenza a super risoluzione (~140 nm XY-resolution) in situ. Questa tecnica è anche compatibile con la bassa intensità fluorescente, ad esempio, EGFP o mCherry etichettati endogenamente con geni a bassa espressa. Come prova di principio, abbiamo usato questo metodo per visualizzare più strutture subcellulari nel testicolo drosofila. Durante la preparazione dei tessuti, sia la struttura cellulare che la morfologia dei tessuti vengono mantenute all'interno del testicolo sezionato. Qui, usiamo questa tecnica per immaginiamo la dinamica dei microtubuli, le interazioni tra i microtubuli e la membrana nucleare, così come l'attacco dei microtubuli ai centromeri.

Questa tecnica richiede procedure speciali nella preparazione del campione, nel montaggio del campione e nell'immobilizzazione dei campioni. Inoltre, i campioni devono essere mantenuti per diverse ore dopo la dissezione senza compromettere la funzione e l'attività cellulare. Mentre abbiamo ottimizzato le condizioni per l'imaging vivo a super risoluzione specificamente nelle cellule staminali germinali maschili drosophila (GSC) e nelle cellule germinali progenitrici nel tessuto testicolo sezionato, questa tecnica è ampiamente applicabile a una varietà di diversi tipi di cellule. La capacità di osservare le cellule nelle loro condizioni fisiologiche senza sacrificare la risoluzione spaziale o temporale servirà come strumento inestimabile per i ricercatori che cercano di affrontare questioni cruciali nella biologia cellulare.

Introduzione

Visualizzare le strutture subcellulari e la dinamica proteica nelle cellule vive con risoluzione oltre il limite di diffrazione della luce è in genere molto^{impegnativo 1-3}. Mentre sono state sviluppate molteplici tecniche di super-risoluzione come Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy (STORM), Photo-Activated-Localization-Microscopy (PALM) e Stimulated-Emission-Depletion (STED)^4,5,6 microscopia, complicazioni nella preparazione del campione e la necessità di mantenere la vitalità e l'attività ex vivo, limitare l'uso della microscopia ....

Protocollo

1. Preparazione di cocktail di imaging cellulare vivo (media cellulari vivi)

1. Integrare il mezzo Drosophila di Schneider con il 15% di siero bovino fetale (FBS) e 0,6x penicillina/streptomicina. Regolare il pH a circa 7,0.
2. Poco prima di utilizzare il mezzo, aggiungere insulina a una concentrazione finale di 200 μg/mL.
   NOTA: Questo supporto è fondamentale per mantenere la normale divisione cellulare e lo sviluppo del testicolo drosophila durante l'imaging time-lapse^10,14.

2. Preparazione del piatto di coltura della cella inferiore in vetro<....

Risultati

L'imaging cellulare vivo oltre il limite di diffrazione nel tessuto Drosophila, specialmente per i GSC, offre l'opportunità di indagare la dinamica degli eventi subcellulari nel contesto della progressione del ciclo cellulare. Recentemente, uno studio che utilizza questo protocollo ha dimostrato che le attività dei microtubuli al centrosoma madre rispetto al centrosoma della figlia sono temporaneamente asimmetriche nei GSC¹⁰. Il centrosoma madre emana microtubuli circa 4 ore prima dell'in.......

Discussione

I metodi di microscopia a super risoluzione forniscono una risoluzione spaziale fino a 10 di nanometri^4,5,6. I metodi di microscopia STORM e PALM consentono una risoluzione fino a 20-50 nm (risoluzione XY), mentre la microscopia STED offre una risoluzione da 20 a 100 nm (risoluzione XY). La risoluzione spaziale della microscopia SIM è limitata a 100-130 nm¹⁵. Tuttavia, a causa della sua alta densità di fotoni e del lu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adobe Illustrator CS6 (software per la creazione di figure)	Adobe	N/A
Membrana per dialisi	Spectra/Por 1-4 Standard RC Membrana per dialisi	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. n. 26140079	15% (V/V)
Fiji (software di analisi)	NIH	N/A	Quantificazione dell'intensità della fluorescenza dell'immagine
Piastre per colture cellulari con fondo in vetro (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (software per la ricostruzione delle immagini)	Bitplane	N/A	Ricostruzione delle immagini 3D
Olio Imerssion	Zeiss	Immersol 518F/30 ° C
Insulina	Sigma	Cat. n. 15550	200 &; g/ml
Penicillina/streptomicina	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0,6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Microscopio confocale a disco rotante	Zeiss	N/A	dotato di una fotocamera evolve (fotometria), che utilizza un obiettivo Zeiss 63x (1,4 NA).
Carta velina	Kimwipe	N/A
Microscopio confocale LSM 800 a camera umida a umido con modulo di super-risoluzione AiryScan	Zeiss	N/A	dotato di rivelatori GaAsP (fosfuro di arseniuro di gallio) altamente sensibili che utilizzano un obiettivo Zeiss 63x (1.4 NA)
ZEN (software di imaging)	Zeiss	N/A