Articolo metodologico

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

DOI:

10.3791/61565

⸱

22 gennaio 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regeneron Tech Centers, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 2Regeneron Therapeutic Proteins, Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 3Immunology and Inflammation, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Studi approfonditi hanno caratterizzato lo sviluppo e la differenziazione delle cellule B murine negli organi linfoidi secondari. Gli anticorpi secreti dalle cellule B sono stati isolati e sviluppati in terapie ben consolidate. La convalida dello sviluppo delle cellule B murine, nel contesto di topi autoimmuni o in topi con sistema immunitario modificato, è una componente cruciale dello sviluppo o della sperimentazione di agenti terapeutici nei topi ed è un uso appropriato della citometria a flusso. Parametri citometrici a flusso di cellule B ben consolidati possono essere utilizzati per valutare lo sviluppo delle cellule B nel peritoneo murino, nel midollo osseo e nella milza, ma è necessario rispettare una serie di migliori pratiche. Inoltre, l'analisi citometrica a flusso dei compartimenti delle cellule B dovrebbe anche integrare ulteriori letture dello sviluppo delle cellule B. I dati generati utilizzando questa tecnica possono migliorare la nostra comprensione di modelli murini selvatici, autoimmuni e di topi umanizzati che possono essere utilizzati per generare anticorpi o molecole simili a anticorpi come terapeutici.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli anticorpi monoclonali sono diventati sempre più la terapia di scelta per molte malattie umane in quanto entrano a far parte della medicina tradizionale1,2. Abbiamo precedentemente descritto topi geneticamente modificati che producono in modo efficiente anticorpi che ospitano regioni variabili completamente umane con costanti IgH di topo3,4. Più recentemente, abbiamo descritto topi geneticamente modificati che producono molecole simili a anticorpi che hanno un legame antigene distinto5. Gli anticorpi sono secreti dalle cellule B e costituiscono la base dell'immunità umorale adattativa. Esistono due tipi distinti di cellule B, B-1 e B-2. Nei mammiferi, le cellule B-1 hanno origine nel fegato fetale e sono arricchite nei tessuti mucosi e nelle cavità pleurica e peritoneale dopo la nascita, mentre le cellule B-2 hanno origine nel fegato fetale prima della nascita e successivamente nel midollo osseo (BM). Le cellule B-2 sono arricchite negli organi linfoidi secondari tra cui la milza e il sangue6,7,8. Nel BM, i progenitori ematopoietici B-2 iniziano a differenziarsi in cellule pro-B all'inizio del riarrangiamento della catena pesante Ig mu9,10. Il riarrangiamento riuscito della catena pesante Ig e il suo assemblaggio nel recettore delle cellule pre-B (pre-BCR), insieme alla segnalazione e all'espansione proliferativa, porta alla differenziazione in cellule pre-B. Dopo che le cellule pre-B riorganizzano le loro catene leggere Ig kappa (Igκ), o se improduttive, Ig lambda (Igλ), si accoppiano con μ catena pesante, con conseguente espressione superficiale di IgM BCR. È importante sottolineare che l'espressione superficiale delle IgM è nota per essere ridotta in condizioni di autoreattività, contribuendo così all'autotolleranza nelle cellule B funzionalmente non reattive o anergiche11,12. Le cellule B immature entrano quindi in una fase di transizione, dove iniziano a co-esprimere IgD e migrano dal BM alla milza. Nella milza, l'espressione di IgD aumenta ulteriormente e le cellule maturano in un secondo stadio di cellule B di transizione, seguito dal completamento del loro stato di maturazione e dallo sviluppo in cellule della zona marginale (MZ) o follicolari (Fol)13,14,15. Nei topi adulti, in un ambiente non malato, il numero di cellule B mature rimane costante nonostante 10-20 milioni di cellule B immature vengano generate quotidianamente nel BM. Di questi, solo il tre per cento entra nel pool di cellule B mature. La dimensione del compartimento periferico delle cellule B è limitata dalla morte cellulare, dovuta in parte a diversi fattori tra cui l'auto-reattività e la maturazione incompleta16,17,18. L'analisi citometrica a flusso è stata ampiamente utilizzata per caratterizzare ed enumerare molti sottocompartimenti delle cellule immunitarie negli esseri umani e nei topi. Mentre ci sono alcune somiglianze tra compartimenti di cellule B umane e murine, questo protocollo si applica solo all'analisi delle cellule B murine. Questo protocollo è stato sviluppato con lo scopo di fenotipizzare topi geneticamente modificati, per determinare se la manipolazione genetica avrebbe alterato lo sviluppo delle cellule B. La citometria a flusso è stata anche molto popolare in molte applicazioni aggiuntive, tra cui la misurazione dell'attivazione cellulare, della funzione, della proliferazione, dell'analisi del ciclo, dell'analisi del contenuto del DNA, dell'apoptosi e dello smistamento cellulare 19,20.

La citometria a flusso è lo strumento di scelta per caratterizzare vari compartimenti linfocitari nei topi e nell'uomo, anche in organi complessi come la milza, il BM e il sangue. Grazie ai reagenti anticorpali specifici del topo ampiamente disponibili per la citometria a flusso, questa tecnica può essere utilizzata per studiare non solo le proteine di superficie cellulare, ma anche le fosfoproteine intracellulari e le citochine, nonché le letture funzionali21. Qui dimostriamo come i reagenti per citometria a flusso possono essere utilizzati per identificare i sottoinsiemi di cellule B man mano che maturano e si differenziano negli organi linfoidi secondari. Dopo l'ottimizzazione delle condizioni di colorazione, la gestione dei campioni, la corretta configurazione dello strumento e l'acquisizione dei dati e, infine, l'analisi dei dati, è possibile utilizzare un protocollo per l'analisi citometrica a flusso completa del compartimento delle cellule B nei topi. Tale analisi completa si basa su una nomenclatura vecchia di decenni ideata da Hardy e colleghi, in cui lo sviluppo di cellule BM B-2 può essere diviso in diverse frazioni (Frazione) a seconda della loro espressione di B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e IgD22. Hardy et al., hanno dimostrato che le cellule B220+ CD43 BM B possono essere suddivise in quattro sottoinsiemi (Frazione A-C') sulla base dell'espressione DI BP-1 e CD24 (30F1), mentre le cellule B220+ CD43-(dim to neg) possono essere risolte in tre sottoinsiemi (Frazione D-F) basati sull'espressione differenziale di IgD e IgM23 di superficie. La frazione A (cellule pre-pro-B) è definita come BP-1- CD24 (30F1)-, la frazione B (prime cellule pro-B) è definita come BP-1- CD24 (30F1)+, la frazione C (cellule pro-B tardive) è definita come BP-1+ CD24 (30F1)+, e la frazione C' (prime cellule pre-B) è definita come BP-1+ e CD24high. Inoltre, la Frazione D (cellule pre-B) è definita come B220+ CD43- IgM- B, e la Frazione E (cellule B di nuova generazione, combinazione di cellule immature e transitorie) è definita come B220+ CD43- IgM+ B cells e la Frazione F (cellule B mature, a ricircolo) è definita come B220high CD43- IgM+ B cells. Al contrario, la maggior parte delle cellule B naïve presenti nella milza può essere suddivisa in cellule B mature (B220+ CD93-) e cellule transizionali (T1, T2, T3) a seconda dell'espressione di CD93, CD23 e IgM. Le cellule B mature possono essere risolte in zone marginali e sottoinsiemi follicolari basati sull'espressione di IgM e CD21/CD35, e sottoinsiemi follicolari possono essere ulteriormente suddivisi in sottoinsiemi follicolari maturi di tipo I e follicolari di tipo II B a seconda del livello della loro espressione superficiale IgM e IgD24. Queste popolazioni di cellule B spleniche esprimono prevalentemente la catena leggera Igκ. Infine, in letteratura sono state descritte popolazioni di cellule B-1 B, che hanno origine nel fegato fetale e si trovano principalmente nelle cavità peritoneale e pleurica di topi adulti. Queste cellule B peritoneali possono essere distinte dalle cellule B-2 B precedentemente descritte per la loro mancanza di espressione di CD23. Sono poi ulteriormente suddivisi in popolazioni B-1a o B-1b, con la prima definita dalla presenza di CD5 e la seconda dalla sua assenza25. I progenitori delle cellule B-1 sono abbondanti nel fegato fetale, ma non si trovano nel BM adulto. Mentre le cellule B-1a e B-1b provengono da diversi progenitori, entrambe seminano le cavità peritoneale e pleurica24. A differenza delle cellule B-2, le cellule B-1 sono in grado di auto-rinnovarsi e sono responsabili della produzione di anticorpi IgM naturali.

Difetti nello sviluppo delle cellule B possono insorgere in molti casi, tra cui carenze nei componenti del BCR26,27, perturbazioni di molecole di segnalazione che influenzano la potenza di segnalazione BCR14,28,29, o interruzione delle citochine che modulano la sopravvivenza delle cellule B30,31 . L'analisi citometrica a flusso dei compartimenti linfoidi ha contribuito alla caratterizzazione dei blocchi di sviluppo delle cellule B in questi topi e in molti altri. Un vantaggio dell'analisi citometrica a flusso dei compartimenti linfoidi è che offre la possibilità di effettuare misurazioni su singole cellule ottenute da tessuto dissociato vivo. La disponibilità di reagenti in una gamma sempre più ampia di fluorofori consente l'analisi simultanea di più parametri e consente la valutazione dell'eterogeneità delle cellule B. Inoltre, l'enumerazione delle cellule B mediante analisi citometrica a flusso integra altri saggi immunologici come i metodi immunoistochimici che visualizzano la localizzazione cellulare all'interno degli organi linfoidi, il rilevamento dei livelli di anticorpi circolanti come misura dell'immunità umorale, nonché due microscopi a fotoni per misurare le risposte delle cellule B nello spazio e nel tempo reali32.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli studi sui topi sono stati supervisionati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Regeneron. L'esperimento è stato condotto su tessuti di tre topi femmina C57BL / 6J (17 settimane di età) dei Jackson Laboratories. Titolare tutti gli anticorpi prima di iniziare l'esperimento per determinare la concentrazione ideale. Quando si utilizzano perline di compensazione per la compensazione monocolore, assicurarsi che siano brillanti o più luminose dei campioni. Mantenere tutti i tamponi, gli anticorpi e le cellule sul ghiaccio o a 4 °C. Dopo l'aggiunta del colorante di vitalità, eseguire tutte le fasi e le incubazioni a 4 ° C in condizioni di scarsa illuminazione o al buio.

1. Raccolta delle cellule peritoneali e isolamento delle singole cellule

  1. Eutanasia del mouse utilizzando CO2 o secondo protocollo approvato.
  2. Appoggiare il mouse sulla schiena, spruzzare con etanolo al 70% e tagliare la pelle addominale esterna con le forbici, facendo attenzione a non tagliare il peritoneo.
  3. Iniettare 3 mL di tampone di lavaggio ghiacciato (0,5% di albumina sierica bovina (BSA) in DPBS [vol/vol]) nella cavità peritoneale con una siringa da 3 mL dotata di ago calibro 25.
  4. Massaggiare delicatamente il peritoneo con la punta delle dita.
  5. Ripetere i passaggi 1.3 e 1.4.
  6. Inserire una siringa da 3 ml dotata di un ago da 18 G attraverso il peritoneo, facendo attenzione ad evitare organi e grasso.
  7. Estrarre il tampone di lavaggio, ora contenente cellule peritoneali, e trasferire in tubo conico da 15 ml su ghiaccio.
  8. Ripetere i passaggi 1.3 e 1.4.
  9. Tagliare un piccolo foro nel peritoneo mentre si tiene in piedi con una pinzetta.
  10. Inserire una pipetta di trasferimento usa e getta nel foro e raccogliere il tampone di lavaggio rimanente, evitando ancora una volta grasso e organi.
  11. Trasferire le cellule peritoneali rimanenti raccolte nel tubo conico da 15 ml sul ghiaccio.
    NOTA: Scartare il campione se la contaminazione del sangue è evidente.
  12. Incubare le cellule sul ghiaccio fino al completamento dell'estrazione della milza e dell'osso.
  13. Centrifugare le celle a 300 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare il surnatante.
  14. Risospendare il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lavaggio.
  15. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μM in un tubo conico pulito da 15 ml su ghiaccio.
  16. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando uno strumento contatore cellulare o un emocitometro.

2. Raccolta della milza e isolamento monocellulare

  1. Appoggia il mouse sulla pancia e taglia il peritoneo sul retro sinistro usando le forbici pulite. Tagliare la milza, rimuovendo il grasso e il tessuto connettivo.
  2. Trasferire la milza in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di tampone di lavaggio su ghiaccio.
  3. Incubare la milza sul ghiaccio fino al completamento dell'estrazione ossea.
  4. Spostare la milza in un tubo di dissociazione automatizzato con 5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi. Posizionare il tubo sullo strumento di dissociatore tissutale e dissociarsi per 60 s per creare una sospensione a singola cellula.
    NOTA: È anche consentito utilizzare altri metodi di routine per ottenere sospensioni di milza a singola cellula come la frantumazione tra vetrini smerigliati nel tampone di lavaggio. Se viene utilizzato un altro metodo di dissociazione, seguire la dissociazione con centrifugazione, aspirazione e quindi risospensione in 5 ml di tampone di lisi dei globuli rossi prima di continuare con il passaggio 2.5.
  5. Incubare le celle a temperatura ambiente per 3 min.
  6. Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio a 4 °C contenente 2mM EDTA.
  7. Trasferire in un tubo conico pulito da 15 ml.
  8. Centrifugare le celle a 300 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare il surnatante.
  9. Risospesare il pellet cellulare in 5 mL di tampone di lavaggio a 4 °C.
  10. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μM in un tubo conico pulito da 15 ml su ghiaccio.
  11. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando uno strumento contatore cellulare o un emocitometro.

3. Raccolta BM e isolamento a singola cellula

  1. Rimuovere la pelle dalla metà inferiore del corpo del mouse. Tagliare il muscolo in eccesso dalla gamba. Rimuovere l'intera gamba con le forbici, facendo attenzione a non tagliare il femore. Pulire il femore e la tibia rimuovendo i muscoli, il grasso e i piedi rimanenti.
  2. Trasferire le ossa in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di tampone di lavaggio su ghiaccio.
  3. Perforare il fondo di un tubo microcentrifuga da 0,5 ml, lasciando un foro abbastanza piccolo da non sporgere le ossa delle gambe. Inserire il tubo da 0,5 mL in un tubo microcentrifuga pulito da 1,5 mL. Tagliare l'estremità del femore e della tibia prossimale al ginocchio e posizionare le estremità tagliate rivolte verso il basso nel tubo da 0,5 ml.
  4. Centrifugare le celle a 6.780 x g per 2 min a 4 °C.
  5. Risospendare il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi e trasferirlo in un tubo conico da 15 mL contenente ulteriori 3 mL di tampone di lisi dei globuli rossi.
  6. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
  7. Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio a 4 °C contenente 2mM EDTA.
  8. Centrifugare le celle a 300 x g per 8 min a 4 °C. Aspirare il surnatante.
  9. Risospendare il pellet di cella in 3 mL di tampone di lavaggio a 4 °C.
  10. Filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 70 μM in un tubo conico pulito da 15 ml su ghiaccio.
  11. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando uno strumento contatore cellulare o un emocitometro.

4. Macchiare le cellule e preparare la compensazione

  1. Aliquot 106 cellule di ogni tipo di cellula da ogni animale a una piastra inferiore a 96 pozzetti U.
    1. Assicurati di includere abbastanza pozzetti per tutti i campioni e i controlli, tra cui la colorazione completa, la fluorescenza meno uno (FMO), non macchiata e infine la compensazione monocolore opzionale per ogni fluoroforo utilizzato.
    2. Per il pannello di maturazione BM e il pannello di maturazione della milza, cellule aliquote in 2 pozzetti, 106 cellule per pozzetto, per ogni campione di macchia completo. Per i controlli di vitalità della compensazione a colore singolo, aggiungere 2 x 106 celle di ciascun tipo di cella ai singoli pozzetti.
  2. Centrifugare la piastra a 845 x g per 2 min a 4 °C. Decantare il surnatante invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino, facendo attenzione a non contaminare i pozzi.
  3. Risospesare le cellule in 200 μL di DPBS (senza BSA o FBS). Questo passaggio è importante per rimuovere le proteine prima di colorare con colorante di vitalità amminico-reattivo.
  4. Ripetere i passaggi 4.2 e 4.3.
  5. Ripetere il passaggio 4.2.
  6. Risospesso le cellule in un colorante di vitalità da 100 μL diluito 1:1.000 in DPBS.
    NOTA: se si utilizzano celle per la compensazione di un solo colore, non aggiungere colorante di vitalità a tali pozzetti.
    1. Per ogni set di macchie, lasciare diversi pozzetti non macchiati per un campione completamente non macchiato e qualsiasi altro controllo di cui potresti aver bisogno.
    2. Per ogni set di macchie, lasciare un ulteriore pozzo non macchiato per il controllo FMO di viabilità.
    3. Per i controlli di compensazione della vitalità monocolore: risospesso le 2 x 106 celle, aliquotate nello stadio 4.1, in 200 μL di colorante di vitalità diluito. Trasferire 100 μL di cellule in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, celle termiche per 5 minuti a 65 °C e trasferire i 100 μL di cellule uccise termicamente al pozzo originale con i 100 μL rimanenti cellule vive.
  7. Incubare le cellule a 4 °C, al riparo dalla luce, per 30 min.
  8. Centrifugare la piastra a 845 x g per 2 min a 4 °C. Decantare il surnatante invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino, facendo attenzione a non contaminare i pozzi.
  9. Risospesare le cellule in 200 μL di DPBS (senza BSA o FBS).
  10. Ripetere i passaggi 4.8 e 4.9.
  11. Ripetere il passaggio 4.8.
  12. Risospesare le cellule in 50 μL di blocco Fc diluito 1:50 (concentrazione finale= 10 μg/mL) in tampone colorante (0,5% BSA in DPBS [vol/vol]).
    1. Per le cellule peritoneali - aggiungere anche 5 μL di bloccante monocitario per ridurre la colorazione non specifica.
  13. Incubare le cellule a 4 °C, al riparo dalla luce, per 15 min.
  14. Preparare miscele complete di stain master e FMO in stain buffer per un volume finale di 100 μl per 106 celle. Fare riferimento alla Tabella 1-Tabella 4 per gli elenchi degli anticorpi.
    NOTA: gli FMO sono realizzati includendo tutti gli anticorpi in un set di macchie tranne uno. Preparare un FMO per ogni anticorpo in un set di macchie. Quando un set di macchie contiene più coloranti brillanti, sostituire 50 μL di tampone di macchia brillante per tampone di macchia per campione
  15. Senza rimuovere il blocco Fc, aggiungere 100 μL di miscele di macchie complete e FMO ai pozzetti selezionati.
  16. Preparare controlli di compensazione monocolore per ogni anticorpo in un set di macchie.
    1. Se si utilizzano perline di compensazione, seguire le istruzioni per l'uso del produttore.
    2. Se si utilizzano cellule, aggiungere anticorpi titolati a 106 cellule, riservate in precedenza nel passaggio 4.6.1 senza colorante di vitalità, in tampone di colorazione da 100 μL. Se tutte le cellule del campione sono positive per un particolare marcatore, mettere da parte le cellule non macchiate da utilizzare per acquisire i dati di compensazione sul citometro a flusso.
  17. Incubare le cellule e le perline a 4 °C, al riparo dalla luce, per 30 min.
  18. Centrifugare la piastra a 845 x g per 2 min a 4 °C. Decantare il surnatante invertendo rapidamente e facendo scorrere la piastra su un lavandino, facendo attenzione a non contaminare i pozzi.
  19. Risospendare le cellule e le perline in 200 μL di tampone antimacchia.
  20. Ripetere i passaggi 4.18 e 4.19 due volte.
  21. Ripetere il passaggio 4.18.
  22. Per fissare i campioni per l'analisi entro 48 ore, risospese le cellule e le perline in 200 μL di paraformaldeide al 2% in DPBS.
    ATTENZIONE: La parafomaldeide è un grave pericolo per la salute e infiammabile. Fare riferimento alla scheda tecnica di Safty prima dell'uso.
  23. Incubare le cellule e le perline a 4 °C, al riparo dalla luce, per 30 min.
  24. Ripetere i passaggi 4.18 e 4.19 due volte.
  25. Posizionare una piastra filtrante su una piastra a U pulita da 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta multipla, trasferire ogni campione in un pozzetto della piastra filtrante.
  26. Centrifugare la piastra filtrante-96 pozzo U-bottom piastra impostata a 845 x g per 2 min a 4 °C. Rimuovere la piastra filtrante e decantare il surnatante invertendo e facendo scorrere rapidamente la piastra su un lavandino, facendo attenzione a non contaminare i pozzi.
  27. Per i pannelli di maturazione bm e milza, sospendere le cellule completamente colorate in 100 μL di tampone antimacchia. Unire i 2 pozzetti per ogni animale in 1 pozzo. Sospendere i pannelli, gli FMO e i controlli rimanenti in 200 μL di tampone antimacchia.
  28. Incubare cellule fisse e perline a 4 °C, al riparo dalla luce, durante la notte.

5. Acquisizione dati citometrici a flusso

  1. Inizializzare e qc il citometro a flusso secondo le istruzioni del produttore.
  2. Carica il modello specifico per ogni pannello.
  3. Prima di registrare i dati, assicurarsi che tutti gli eventi per ciascun campione siano in scala e visibili sui dot plot.
  4. Registrare i controlli di compensazione per ciascun pannello di macchia utilizzando compensazioni di macchia singola preparate nel passaggio 4.16. Impostare porte positive e negative per ciascun campione. Chiedi al software di calcolare la matrice di compensazione.
  5. Inizia ad acquisire il primo campione e assicurati che i cancelli siano impostati in modo appropriato.
  6. Impostare la macchina in modo da registrare almeno 50.000 eventi di cellule B per il pannello cellulare B peritoneale e il pannello della milza Igκ e Igλ; 150.000 eventi di cellule B per il pannello di maturazione BM; e 300.000 eventi di cellule B per il pannello di maturazione della milza.
  7. Per ogni pannello di macchia, eseguire e registrare i campioni completamente macchiati per ogni animale, un campione non macchiato e gli FMO.

6. Analizza i dati

  1. Procedere con l'analisi dei dati utilizzando il software di analisi della citometria a flusso. Seguire le strategie di gating descritte in Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4. 

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo la strategia di gating per caratterizzare lo sviluppo delle cellule B nel peritoneo di topo, nel BM e nella milza. La base dell'analisi si forma attorno al concetto di colorazione con colorante di vitalità, quindi estraendo doppietti basati su Forward-Scatter-Area (FSC-A) e Forward-Scatter-Height (FSC-H), e infine estraendo i detriti selezionando le celle in base alle loro caratteristiche FSC-A e Side-Scatter-Area (SSC-A), qui indicate come size gate, che riflettono la dim...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi citometrica a flusso di tessuti linfoidi e non linfoidi ha permesso l'identificazione simultanea e l'enumerazione delle sottopopolazioni di cellule B nei topi e negli esseri umani dal 1980. È stato usato come misura dell'immunità umorale e può essere applicato ulteriormente per valutare la funzionalità delle cellule B. Questo metodo sfrutta la disponibilità di reagenti per valutare le diverse fasi della maturazione delle cellule B nei topi e nell'uomo, attraverso l'analisi simultanea di più parametri che consen...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori sono dipendenti e azionisti di Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Matthew Sleeman per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche i dipartimenti Vivarium Operations e Flow Cytometry Core di Regeneron per aver supportato questa ricerca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette Eppendorf da 0,5 mL con chiusura di sicurezzaEppendorf 22363611provetta per microcentrifuga da 0,5 mL
Provette Eppendorf da 1,5 mLEppendorf 22364111provetta per microcentrifuga da 1,5 mL
Provette Falcon da 15 mLCorning 352097provetta conica da 15 mL
ago calibro 18BD305196
ago calibro 25BD 
siringa da 3 mLBD309657
70 mM MACS SmartStrainer Miltenyi Biotec 130-110-916 Filtro cellulare da 70 mM
Piastra inferiore a 96 pozzetti U VWR10861-564
tampone di lisi ACK GIBCO tampone perlisi dei globuli rossi
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate PallCorporation8027filtrante
B220eBiosciences17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κBD552843perline di compensazione
BD CompBead Anti-Rat Ig/κBD552844perline di compensazione
Siero Bovino AlbuminaSigma-Aldrich A8577BSA
BP-1BD740882
Brilliant Stain BufferBD566349Brilliant Stain Buffer
C-KitBD564011
CD11bBD563168
CD11bBioLegend101222
CD19BD560143
CD21/35BD
CD23 BD740216
CD24 (HSA)BioLegend138504
CD3BD561388
CD3BioLegend100214
CD43BD553270
CD43BioLegend121206
CD5BD563194
CD93BD740750
CD93BioLegend136504
DPBS (1x)ThermoFisher14190-144DPBS
eBioscience Colorante di vitalità fissabile eFluor 506ThermoFisher65-0866-14colorante di vitalità Pipetta
di trasferimento a punta fine estesa Pipetta di trasferimentomonousoSamco233
FACSimmoniale Citometro a flusso A3BDordine personalizzatocitometro a flusso
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)BD553142Fc block
FlowJoFlowjosoftware di analisi del citometro a flusso
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334tubo di dissociazione automatizzato 
gentleMACS Dissociatore Octo con riscaldatori Miltenyi Biotec 130-095-937strumento dissociatore tissutale
GR1 (Ly6C/6G)BioLegend108422
IgDBioLegend405710
IgMeBiosciences25-5790-82
KappaBD550003
LambdaBioLegend407308
paraformaldeide, soluzione al 32%di elettrone Scienze della microscopia15714
Ter119BioLegend116220
True-Stain Monocyte BlockerBioLegend426103bloccante dei monociti
UltraPure EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575038EDTA
Vi-CELL XRBeckman Coulter731050strumento contatore di cellule 
305124A1049201 piastra 562756

Riferimenti

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