Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo

Un'adeguata regolazione coronarica del flusso di pressione assicura un apporto di sangue sufficiente al cuore per soddisfare le sue esigenze^{metaboliche 1}. Tuttavia, solo di recente è diventato chiaro come il flusso di pressione coronarica sia regolato dinamicamente nel cuore, nonostante studi approfonditi che sono stati eseguiti in vivo e in vitro negli ultimi decenni. Uno dei motivi è la difficoltà di stabilire un modello di lavoro fisiologico per tali studi a causa del costante battito del cuore. Indipendentemente da ciò, è stata stabilita una varietà di metodi per l'osservazione dei micro-vasi coronari nei tessuti viventi o negli animali, ma nessuno di questi metodi è stato in grado di ottenere una messa a fuoco costante / stabile e le misurazioni della pressione, del flusso e del diametro microvascolare^{allo stesso tempo 2,3}. La visualizzazione diretta dei micro-vasi arteriosi coronari nel cuore pulsante è stata introdotta^{decenni fa 4,3}, ma le misurazioni del diametro in piccoli vasi erano impegnative e le funzioni specifiche dei molti tipi di cellule specializzate associate al microcircolo erano ugualmente vessatorie. Anche il metodo stroboscopico e il sistema obiettivo flottante non sono stati in grado di fornire le informazioni di cui sopra^{contemporaneamente 5}. Tuttavia, è stata ottenuta una quantità significativa di informazioni preziose utilizzando le suddette tecnologie, che ci hanno aiutato a capire di più sulla regolazione del flusso sanguigno coronarica⁶. Il metodo che stiamo descrivendo in questo documento aiuterà a indagare e comprendere in dettaglio come i componenti delle arterie coronarie, delle arteriole e della microvascolarizzazione rispondono in modo diverso alle stimolazioni e alle richieste metaboliche.

Il modello di lavoro che abbiamo stabilito per proseguire questi studi è stato costruito sul precedente lavoro di Westerhof et^al. A seguito della cannulazione dell'arteria settale del cuore del topo, è stata utilizzata una fisiologica soluzione salina per perfondere quell'arteria per mantenere nutriti i miociti e altri componenti del tessuto cardiaco. La pressione arteriosa perfusione, il flusso e il diametro vascolare sono stati monitorati tra le altre funzioni fisiologiche utilizzando opportuni indicatori fluorescenti. Questo metodo ci consente di visualizzare il letto microvascolare coronarico sotto pressione fisiologica nel tessuto vivente e studiare per la prima volta i meccanismi cellulari alla base della regolazione del microcircolo.

Tutta la cura degli animali era conforme alle linee guida dell'Università del Maryland baltimora e il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali ha approvato protocolli.

1. Preparazione delle soluzioni

NOTA: Preparare le soluzioni in anticipo. Negli esperimenti vengono utilizzati due tipi di soluzioni di base: (1) soluzioni saline fisiologiche (PSS) per il superfusato da bagno e (2) soluzioni tyrode per il perfusato di lume. È necessario un continuo_{gorgogliamento con} CO 2 per mantenere il pH della PSS. La soluzione di Tyrode tamponata da HEPES viene utilizzata nel lume al posto del PSS per evitare che bolle che entrano nei vasi, poiché le bolle danneggeranno le cellule endoteliali⁷ e occluderebbero il flusso.

1. Soluzione PSS: Vedere la formula e la composizione della soluzione PSS nella tabella 1. Preparare 10 L di^{ca 2+}-free e glucosio-free PSS soluzione di magazzino e conservare a temperatura ambiente. 1 h prima di qualsiasi procedura, esenzi 1 L della soluzione stock e bolla con il 5% di CO 2 (74% N₂ e 21% O₂₎per mantenere il pH della_soluzione a ~7,4. Aggiungere 1,8 g di glucosio e 1,8 mL CaCl₂ (1 M stock)⁸.
   NOTA: Aggiungere Ca^{2+ solo} dopo il gorgogliamento quando il pH è ~7,4, altrimenti, Ca²⁺ verrà precipitato.
2. Soluzione del tirolo: vedere la formula e la composizione della soluzione del tirolo nella tabella 1. Filtrare la soluzione (0,22 μm) e conservata a 4 °C per un uso futuro⁹.
3. Soluzione di Tirode con BDM (2,3-Butanedione monoxime): Aggiungere BDM come inibitore reversibile del miofilamento per prevenire la contrazione dei miociti¹⁰. Pesare 600 mg di BDM e aggiungere a 200 mL della soluzione di Tyrode. Mescolare la soluzione con BDM fino a quando non è completamente sciolta. Non è richiesta ulteriore filtrazione.
4. Conservare la soluzione tyrode contenente BDM a 4 °C per un uso futuro.

2. Preparazione della camera

1. Rivestire in anticipo sia la camera di sezionatura che la camera sperimentale con polidimetilsilossano (PDMS) seguendo le istruzioni fornite dal produttore.
2. Riempire la camera di sezionatura con la soluzione tyrode contenente BDM.
3. Accendere il refrigeratore 1 h prima della procedura. Impostare la temperatura a 4 °C.

3. Preparazione della cannula

1. Accendere l'estrattore di micropipette. Selezionare le impostazioni in base alle istruzioni del produttore.
2. Prendere un tubo di vetro borosilicato pulito (il diametro esterno e interno dei tubi di vetro utilizzati era rispettivamente di 1,2 mm e 0,69 mm).
3. Inserire un tubo di vetro nei morsetti scanalati di un estrattore di pipetta Sutter con un filamento riscaldante in platino a forma di U.
4. Attivare l'estrattore per produrre due cannulae, ognuna con una punta lunga e sottile.
5. Tagliare la punta di ogni cannula usando un bel paio di forbici sotto un microscopio sezionante per fare il diametro finale della punta intorno a 100-150 μm.
6. Lucidare la punta della cannula tagliata per arrotondare leggermente i bordi affilati.
7. Piegare la cannula lungo l'albero utilizzando un filo di platino (riscaldato con controllo fine) posizionato sul lato dell'albero a circa 2 mm dalla punta. L'angolo della curva nella cannula dovrebbe essere di circa 45°.
8. Inserire l'estremità aperta della cannula nel supporto della camera del miografo a pressione e stringere il raccordo. Collegare una siringa da 5 ml riempita con la soluzione di Tyrode all'altro lato del raccordo. Collegare la cannula a un micromanipolatore montato sulla camera (vedere figura 1 e figura 2).
9. Riempire la cannula con la soluzione di Tyrode utilizzando la siringa (5 ml), lavarla, il tubo e il connettore delle bolle d'aria.
10. Prima della procedura di cannula, misurare la pressione di perfusione all'interno della cannula su un determinato intervallo di flusso (da 50 a 300 μL/min, Figura 3). Farlo solo quando viene utilizzata una nuova cannula.
    NOTA: La pressione di perfusione all'interno della cannula è proporzionale al flusso ed è lineare(Figura 3).

4. Estrazione del cuore di topo

1. Mettere un mouse C57BL/6 (entrambi i sessi, 8-16 settimane) nella scatola di anestesia collegata ai serbatoi di isoflurane e ossigeno.
2. Accendere il serbatoio dell'ossigeno e iniziare il flusso di isoflurane. Attendere ~ 5 minuti fino a quando il mouse non è completamente anestetizzato.
3. Dopo aver stabilito l'anestesia, espellere il mouse dalla scatola dell'anestesia e iniettare IP di eparina (nella cavità peritoneale, 360 unità, 0,5 mL / topo) per evitare la formazione di coaguli di sangue nella vascucolatura. Quindi rimettere il mouse nella scatola dell'anestesia.
4. 10 minuti dopo che l'eparina è stata iniettata, spostare il mouse sul letto riscaldato in posizione supina e stabilizzare le zampe usando il nastro adesivo. Tenere il topo in anestesia completa con isoflurane usando un cono nasale.
5. Sollevare la pelle addominale del topo sopra il diaframma con le forcep e utilizzare forbici chirurgiche per tagliare ed esporre il diaframma.
6. Tagliare il diaframma e lo sterno. Apri il petto.
7. Sezionare il cuore dalla cavità toracica, tagliando il più vicino possibile alla parete toracica dorsale.
8. Posizionare il cuore nella soluzione tyrode ghiacciata contenente 30 mM BDM.
9. Pulire il cuore per rimuovere i tessuti connettivi come il polmone.
10. Trasferire il cuore nella camera di sezionatura pre-refrigerata riempita con la soluzione di Tyrode contenente 30 mM di BDM.

5. Preparazione e cannula dell'arteria settosa

1. Accendere la servopompa. Impostare la servopompa sulla modalità "flusso". Lasciare correre ad alta velocità fino a quando il tubo non viene riempito con la soluzione del Tirolo che verrà utilizzata per perfondere il lume vascolare. Assicurati che non ci siano bolle nei tubi. Quindi abbassare la velocità.
2. Inchiodare il cuore al PDMS, evitando danni alla zona centrale del cuore.
3. Rimuovere sia gli atri destro che sinistro. Aprire il ventricolo destro e rimuovere la parete libera ventricolare destra utilizzando un microscopio sezionato.
4. Esporre e identificare l'arteria del setto. Posizionare un filo di nylon (30 μm di diametro) sotto l'arteria del setto e legare un nodo sciolto per un uso futuro.
   NOTA: L'arteria del setto può essere facilmente identificata utilizzando un microscopio sezionante. L'arteria settosa è un'arteria maggiore sul setto originata dall'arteria coronarica destra nella maggior parte dei casi.
5. Rimuovere la parete libera ventricolare sinistra usando forbici fini.
6. Trasferire la preparazione del muscolo papillare nella camera sperimentale in cui è stata posizionata la cannula. La camera è riempita con la soluzione di Tyrode contenente BDM. Il fondo di questa camera è rivestito con uno strato sottile (~ 2 mm) di PDMS.
7. Regolare la posizione della cannula (utilizzando il micromanipolatore) per consentire la cannula dell'arteria settosa. Stringi il nodo.
8. Fissare il muscolo papillare usando piccoli perni al pavimento della camera in modo che l'obiettivo del microscopio abbia una visione chiara della vascucolatura. Prestare attenzione all'angolo e alla posizione della cannula e assicurarsi che la punta della cannula sia parallela alla parete arteriosa.
9. Testare la cannula espellendo gradualmente la soluzione dalla siringa attraverso la cannula. Se tutti gli elementi funzionano correttamente, il sangue residuo nel muscolo papillare uscirà dal tessuto all'inizio di questo processo e solo la soluzione di Tiroide sarà vista in seguito.

6. Stabilizzazione del preparato

1. Accendere la pompa peristaltica che fornirà la soluzione di superfusione. Quindi potenziare costantemente la preparazione nella vasca da bagno con PSS pre-gassato alla velocità di 3-4 mL / min.
2. Accendere il regolatore di temperatura per la soluzione di superfusione. Regolare la temperatura del superfusato del bagno a ~35-37 °C.
3. Collegare la cannula alla servopompa. Leggere la pressione visualizzata sul servore controller di pressione.
4. Monitorare il flusso e la pressione. Il flusso (μL/min) e la pressione arteriosa perfusionale (mm Hg) vengono digitalizzati utilizzando il digitalizzatore e registrati utilizzando un software associato (Figura 2).
5. Regolare il flusso per impostare la pressione ~10 mmHg e lasciarla funzionare per ~ 10 min.
6. Aumentare il flusso della soluzione luminare per fare la pressione dell'arteria ~ 60 mmHg. Ottenere la pressione di perfusione finale dell'arteriola stessa sottraendo la caduta di pressione della cannula (Figura 3).
   NOTA: Se è selezionata la modalità "pressione" sul servoretore di pressione, la pressione luminare è impostata ~60 mmHg per questi esperimenti. Quindi monitorare il cambiamento del flusso.
7. Lasciare che il campione si stabilizzi per ~ 30-60 minuti monitorando i livelli di flusso e / o pressione. Un graduale aumento della pressione arteriosa si osserva normalmente all'inizio della perfusione dopo la cannulazione. Un nuovo stato stazionario si stabilirà da solo in circa 30 minuti(figura 4).
8. Avviare un esperimento dopo che la pressione di perfusione è stata stabilizzata (a flusso costante).

7. Caricamento del preparato con agglutinina di germe di grano con tag fluorescente (WGA)

1. Preparare la soluzione di Tyrode contenente WGA coniugata Alexa-Fluor-488 aggiungendo 100 μg di WGA coniugato in 5 mL della soluzione di Tyrode.
2. Passare con cura il perfusato dalla normale soluzione tyrode a una contenente WGA con tag fluorescente. È importante cambiare attentamente il perfusato in modo che non siano introdotte bolle.
3. Dopo ~ 30 minuti di perfusione WGA o quando la soluzione WGA sta per esaurirsi, modificare il perfuso di nuovo nella normale soluzione di Tyrode.

8. Imaging confocale di arteriole e capillari

1. Accendere il sistema di microscopio confocale del disco di Nipkow.
2. Utilizzare il microscopio per localizzare l'arteria del setto utilizzando un obiettivo a bassa potenza (4x) in modalità luce trasmessa.
   NOTA: L'arteria setta può essere posizionata seguendo la posizione della cannula.
3. Inizia l'imaging confocale con il confocale del disco rotante e scegli il laser di eccitazione a 488 nm, l'ingrandimento obiettivo 40x e regola l'intensità del laser e la frequenza di campionamento (10 - 500 ms per immagine).
4. Impostare le posizioni di imaging superiore e inferiore per il microscopio confocale per definire l'intervallo di imaging e immettere i parametri per l'imaging z-stack.
5. Impostare la dimensione del passaggio come consigliato per il sistema utilizzato o impostare le dimensioni del passaggio come desiderato.
6. Scegliere l'impostazione z-stack e/o le impostazioni delle serie temporali.
7. Selezionare o impostare una nuova cartella per archiviare la nuova immagine.
8. Fare clic su "Esegui" per avviare la registrazione dell'imaging per l'analisifutura ( Figura 5).

9. Esempio di esperimento vasodilatatore: vasodilatazione indotta da pinacidil (Video 1).

1. Preparare la soluzione di materiale pinacidile (100 mM in DMSO) e conservarla a 4 °C.
2. Preparare 10 mL della soluzione di Tyrode. Aggiungere 10 μL di soluzione di titolo pinacidile per effettuare la concentrazione finale di pinacidil 100 μM.
3. Immagine del muscolo papillare a basso ingrandimento (obiettivo 4x) per includere l'arteria settica e le arteriole del ramo.
4. Passare la soluzione luminale alla soluzione contenente pinacidil.

10. Esempi di esperimenti di controllo del flusso sanguigno: aumento della pressione arteriosa indotta da vasocostrittore a flusso costante (Figura 6)

1. Preparare la soluzione stock di endotelina-1 (ET-1) (10 μM) e conservarla a -20 °C.
2. Preparare 10 mL della soluzione di Tyrode. Aggiungere 10 μL di soluzione stock ET-1 (10 μM) per effettuare la concentrazione finale di ET-1 10 nM.
3. Registrare la pressione luminare con flusso costante e l'immagine del muscolo papillare.
4. Passare la soluzione luminale alla soluzione contenente ET-1.

11. Immagini di esempio di capillare con periciti (Figura 7)

1. Sacrificare un mouse transgenico NG2DsRedBAC come descritto nella sezione 4 di questo protocollo.
2. Estrarre il cuore, cannulate l'arteria settosa e caricare il campione con Alexa-Fluor-488 coniugato WGA seguendo i protocolli 5-7.
3. Immagina il muscolo papillare a 488 nm e 560 nm di eccitazione e 510-525 nm, emissione di 575-625 nm usando confocale. La pressione dell'arteriola sarà di circa 40 mmHg.

Quando un marcatore vascolare a fluorescenza viene perfuso in lume vascolare (qui WGA coniugato con Alexa Fluor-488), è possibile visualizzare interi alberi vascolari come mostrato nella figura 5 (pannello sinistro) utilizzando il microscopio confocale ad alta velocità. Un ulteriore ingrandimento consente l'imaging capillare in dettaglio(Figura 5, Pannello destro). Poiché il sistema pressurizzato supporta un monitoraggio costante della pressione luminare, questa preparazione può essere utilizzata per associare le variazioni del diametro arterioso alla pressione arteriosa. Il video 1 mostra che quando il pinacidil, un agonista K+ channel (KATP)sensibile all'ATP è stato servito dal lume, il diametro delle arteriole è stato aumentato. La figura 6 mostra che quando il vasocostrittore ET-1 è stato applicato dal lume, il diametro dell'arteriola è diminuito e la pressione luminare è stata aumentata quando il flusso è stato impostato costante.

A causa delle capacità ad alta risoluzione della microscopia confocale in combinazione con specifici marcatori cellulari, questa procedura può anche essere utilizzata per visualizzare molti altri tipi di cellule associate al microcircolo. Qui, abbiamo usato un topo (topo transgenico NG2DsRedBAC) che esprime la proteina di fluorescenza DsRed sotto un promotore specifico pericito (NG2) ed etichettato i vasi con WGA-Alexa Fluor 488. Questo ci permette di immaginiamo contemporaneamente sia il capillare (verde) che i periciti (rossi) nel muscolo papillare del topo (Figura 7) in condizioni che imitano meglio la fisiologia negli animali vivi.

Figura 1: Cannulazione dell'arteria del setto del topo.
(A) L'immagine della luce trasmessa mostra un esempio del muscolo papillare cannulato. Micromanipolatore, cannula e campione (setto con muscolo papillare ventricolo destro) sono indicati come etichette. (B) Il campione ingrandito in A mostra il muscolo papillare e l'arteria settolata cannulata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Apparecchiature utilizzate in tutto l'esperimento.
(A) I componenti principali dell'impostazione utilizzati nell'esperimento. (B) Il diagramma illustra le connessioni tra la preparazione del muscolo papillare e l'attrezzatura sperimentale di controllo fisiologico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Misurazione della pressione all'interno della cannula.
(A) Un esempio per mostrare come una resistenza alla cannula è stata determinata misurando la pressione all'interno della cannula su un intervallo di flusso (50-300 μl/min). (B) Relazione della pressione all'interno della cannula con flusso da 6 cannulae. La pressione all'interno della cannula era proporzionale al flusso ed era in forma con l'espressione Pc=0.08f-12.25, dove Pc come pressione all'interno della cannula, f come flusso. N=6 cannulae. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Variazione della pressione di perfusione durante la stabilizzazione a flusso costante.
(A) Una tipica registrazione della pressione di perfusione durante la stabilizzazione a un flusso costante (~250 μL/min). Si noti l'aumento della pressione di perfusione dopo 30 minuti di stabilizzazione. (B)Le statistiche mostrano la pressione di perfusione prima e dopo la stabilizzazione quando è stato sviluppato il tono. Il flusso medio delle arteriole per mantenere la pressione iniziale (~60 mmHg) è di 201,7 ± 8,6 μL/min (n= 45 topi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Imaging di capillari e arteriole.
(A) L'immagine mostra le arteriole e i capillari carichi di agglutinina germinale di grano (WGA). (B) Ingrandire l'area boxed in A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: ET-1 aumenta la pressione luminare e diminuisce il diametro arterioso.
(A) Il diametro arterioso è cambiato con l'applicazione di ET-1 (10 nM). (B) I profili di fluorescenza WGA che mostrano la variazione di diametro di ET-1. Il diametro dell'arteriolo era riflesso dalla distanza tra l'intensità di picco della fluorescenza sulla parete dell'arteriola. (C) La pressione luminare è aumentata in presenza di ET-1 (10 nM) a flusso costante. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Capillare con periciti del mouse NG2-DsRed.
I periciti cardiaci (rosso) e i capillari (verdi) sono stati immagini nel muscolo papillare ventricolare destro pressurizzato (40 mmHg) e perfuso. Pannello destro, le immagini ingrandite delle aree boxed nei pannelli di sinistra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Vasodilatazione indotta da Pinacidil. Il pinacidil (100 μM) è stato applicato dal lume. La vasodilatazione è stata vista nell'albero arterioso. Clicca qui per scaricare questo video.

Tabella 1: La composizione delle soluzioni.

Nessuno.