Presentato qui è un protocollo per studiare il microcircolo coronarico nel tessuto cardiaco murino vivente monitorando ex vivo la pressione e il flusso di perfusione arteriosa che mantiene la pressione, così come i componenti dell'albero vascolare tra cui i letti capillari e i periciti, poiché l'arteria settale è cannulata e pressurizzata.
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Articolo metodologico
Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tono arterioso coronario insieme all'apertura o alla chiusura dei capillari determinano in gran parte il flusso sanguigno ai cardiomiociti a pressione perfusionale costante. Tuttavia, è difficile monitorare i cambiamenti dinamici delle arteriole coronarie e dei capillari in tutto il cuore, principalmente a causa del suo movimento e del battito non-stop. Qui descriviamo un metodo che consente il monitoraggio della velocità di perfusione arteriosa, della pressione e dei cambiamenti di diametro delle arteriole e dei capillari nei muscoli papillari ventricolari destro del topo. L'arteria del setto di topo viene cannulata e perfusa a un flusso o pressione costante con l'altra misurata dinamicamente. Dopo la perfusione con una lectina etichettata fluorescentmente (ad esempio, Alexa Fluor-488 o -633 etichettata Wheat-Germ Agglutinin, WGA), le arteriole e i capillari (e altri vasi) nel muscolo papillare ventricolo destro e nel setto potrebbero essere facilmente immagini. I cambiamenti del diametro del vaso potrebbero quindi essere misurati in presenza o assenza di contrazioni cardiache. Quando sono state espresse proteine fluorescenti geneticamente codificate, è stato possibile monitorare caratteristiche specifiche. Ad esempio, i periciti sono stati visualizzati nei cuori dei topi che esprimevano NG2-DsRed. Questo metodo ha fornito una piattaforma utile per studiare le funzioni fisiologiche dei periciti capillari nel cuore. È adatto anche per studiare l'effetto dei reagenti sul flusso sanguigno nel cuore misurando contemporaneamente il diametro vascolare/capillare e la pressione luminare arteriosa. Questa preparazione, combinata con un sistema di imaging ottico all'avanguardia, consente di studiare il flusso sanguigno e il suo controllo a livello cellulare e molecolare nel cuore in condizioni quasi fisiologiche.
Introduzione
Un'adeguata regolazione coronarica del flusso di pressione assicura un apporto di sangue sufficiente al cuore per soddisfare le sue esigenzemetaboliche 1. Tuttavia, solo di recente è diventato chiaro come il flusso di pressione coronarica sia regolato dinamicamente nel cuore, nonostante studi approfonditi che sono stati eseguiti in vivo e in vitro negli ultimi decenni. Uno dei motivi è la difficoltà di stabilire un modello di lavoro fisiologico per tali studi a causa del costante battito del cuore. Indipendentemente da ciò, è stata stabilita una varietà di metodi per l'osservazione dei micro-vasi coronari nei tessuti viventi o negli animali, ma....
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Protocollo
Tutta la cura degli animali era conforme alle linee guida dell'Università del Maryland baltimora e il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali ha approvato protocolli.
1. Preparazione delle soluzioni
NOTA: Preparare le soluzioni in anticipo. Negli esperimenti vengono utilizzati due tipi di soluzioni di base: (1) soluzioni saline fisiologiche (PSS) per il superfusato da bagno e (2) soluzioni tyrode per il perfusato di lume. È necessario un continuogorgogliamento con CO 2 per mantenere il pH della PSS. La soluzione di Tyrode tamponata da HEPES viene utilizzata nel lume al posto del PSS per ....
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Risultati
Quando un marcatore vascolare a fluorescenza viene perfuso in lume vascolare (qui WGA coniugato con Alexa Fluor-488), è possibile visualizzare interi alberi vascolari come mostrato nella figura 5 (pannello sinistro) utilizzando il microscopio confocale ad alta velocità. Un ulteriore ingrandimento consente l'imaging capillare in dettaglio(Figura 5, Pannello destro). Poiché il sistema pressurizzato supporta un monitoraggio costante della pressione luminare, questa.......
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Discussione
Nel presente lavoro, abbiamo introdotto un metodo ex vivo straordinariamente semplice ma altamente pratico per studiare il microcircolo coronarica nel cuore in condizioni fisiologiche. Questo metodo è stato modificato da indagini meccaniche utilizzando ratti2. L'aggiunta impegnativa è stata la tecnologia di imaging ad alta velocità e alta risoluzione ottica. Abbiamo quindi potuto usufruire dei sistemi avanzati di imaging ottico ora disponibili in commercio. Con un'attenta dissezione e posizionamen.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Centro per l'Ingegneria e la Tecnologia Biomedica (BioMET); NIH (1U01HL116321) e (1R01HL142290) e l'American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 M soluzione di CaCl2 | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M soluzione di MgCl2 | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| Software AxoScope | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Refrigeratore/incubatore ad acqua | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Tubo di vetro personalizzato | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Microscopio da dissezione | Olympus, Giappone | SZX12 | |
| Endotelina-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Pinze | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Eparina sodica Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Soluzione in linea Riscaldatore | Warner Struments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | ||
| Supporto per micropipette/cannule | Warner Struments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC topo transgenico | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Filo di nylon per legare i vasi sanguigni | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polidimetilsilossano) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Pompa peristaltica | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Forbici | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servopompa Living | Systems Strumentazione, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Regolatore di temperatura | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Agglutinina di germe di grano, Alexa Fluor 488 Coniugato | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
Riferimenti
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N.
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Ristampe e permessi
