Un modello di loop emodinamico in vitro per indagare l'emocitocompatibilità e l'attivazione delle cellule ospiti dei dispositivi medici vascolari

Il test di emocompatibilità dei dispositivi medici è un passo cruciale nello sviluppo di nuovi dispositivi come stent vascolari o tubi perfusione per l'ossigenazione extracorporea della membrana. Fino ad oggi, i modelli animali sono considerati strumenti standard per finalizzare la procedura per testare i dispositivi medici prima della sua implementazione nell'uomo. D'ora in poi, è necessario trovare modelli alternativi in vitro che aiutino ulteriormente a ridurre al minimo le indagini sugli animali. In questo studio, quindi, abbiamo esplorato un modello di loop emodinamico in vitro in miniatura. L'obiettivo di questo metodo presentato è quello di testare la compatibilità del sangue in vitro dei dispositivi medici in conformità con lo standard ISO 10993-4.

Lo standard ISO 10993-4 descrive serie standardizzate di parametri clinici da esaminare sul campione di sangue¹. In breve, si tratta di trombosi (aggregazione piastrinica e conteggio), coagulazione (fibrinopeptide A, FPA), analisi ematologica (numero di globuli interi), indice di emolisi (emoglobina plasmatica libera) e sistema di complemento (complesso di complementi terminali, sC5b9). Tuttavia, ulteriori marcatori, come l'elastasi polimorfonucleare neutrofila (PMN), l'interleuchina 6 (IL-6) e il fattore di necrosi tumorale - alfa (TNF) che riflette lo stato di attivazione dei leucociti possono anche essere contabilizzati per le misurazioni. Per determinare e quantificare le proteine libere dalle cellule circolanti presenti nel plasma sanguigno, il saggio immunoassorbente enzimatico sandwich (ELISA) rappresenta un metodo convenzionale e più^{affidabile 2,3}. Allo stesso modo, il fenotipo e lo stato di attivazione delle cellule ospiti (ad esempio, i leucociti) possono essere quantificati rilevando l'espressione della superficie cellulare delle molecole mediante citometria a flusso (FACS) che fornisce letture basate su sospensione a singola cellula, in cui anticorpi specifici etichettati fluorescenti si legano alle molecole di superficie cellulare mirate⁴. La microscopia elettronica a scansione (SEM) è anche raccomandata per determinare la formazione di trombo sul materiale testato dallo standard ISO 10993-4¹. Questo metodo può essere integrato con la microtomografia a raggi X (μCT), per eseguire analisi strutturali del trombo, ad esempio, il suo spessore, dimensioni e localizzazione in un'immagine renderizzata in 3D⁵.

La logica alla base dell'utilizzo di questo modello emodinamico in vitro è quella di migliorare le prestazioni e i dispositivi medici compatibili comprendendo le dinamiche fisiologiche di base dei componenti del sangue come le piastrine, che sono coinvolti nell'emostasi primaria o nei leucociti e la loro interazione con diversi tipi di dispositivi vascolari. Tali sistemi in vitro sono molto richiesti in quanto riducono la necessità di studi sugli animali.

Il modello di loop presentato qui soddisfa queste esigenze. Questo modello è stato descritto per la prima volta da A.B. Chandler nel 1958 per la produzione di trombi di sangue ed è, quindi, chiamato anche Chandler Loop modello⁶. Fino ad ora, questo modello è stato utilizzato in una serie di esperimenti e modifiche per indagare la biocompatibilità sanguigna dei dispositivi^{medici 7,8,9,10,11,12,13,14}. È costituito da tubi polimerici, che sono in parte riempiti di sangue e modellati in anelli richiudibili. Questi anelli ruotano in un bagno d'acqua a temperatura controllata per simulare le condizioni del flusso vascolare con i suoi effetti emoreologici. Metodi alternativi come modelli azionati da pompa o modelli che utilizzano valvole a sfera meccaniche all'interno dei loop per indurre un flusso sanguigno all'interno dei tubi polimerici sono già^{stati descritti 15,16}. Tuttavia, il vantaggio generale del metodo qui presentato è che la forza meccanica applicata alle cellule del sangue e alle proteine è bassa, evitando l'emolisi, e non c'è contatto tra sangue e connettori, che potrebbe portare a turbolenze del flusso e attivazione dei componenti del sangue. I principali fattori di attivazione all'interno del ciclo sono il materiale di prova stesso e l'aria che è intrappolata all'interno. Ciò aiuta a ridurre al minimo le fonti di errore di misurazione e a fornire un'elevata riproducibilità, anche se l'interfaccia sangue-aria può portare alla denaturazione^{proteica 17}. È anche possibile studiare varietà di materiali di tubi e diametri di stent senza restrizioni di lunghezza o dimensioni, consentendo così l'uso di tubi di diversa lunghezza e diametro interno. Inoltre, sono possibili anche emocompartibilità dell'ospite sulla chiusura imprecisa del loop e sull'esposizione alla superficie del tubo non rivestito. Altre applicazioni mediche simili di questo modello di loop emodinamico in vitro è che potrebbe anche essere utilizzato per studiare le interazioni tra immunoterapia (farmaci) e componenti del sangue durante lo sviluppo preclinico o lo screening individuale della sicurezza dei farmaci prima dello studio clinico di fase I del primo nell'uomo, o per la generazione di materiale trombo che può essere utilizzato in^{ulteriori esperimenti 18,19,20}.

Questo studio descrive un protocollo dettagliato per testare le emocompatibilità dei tubi perfusione e/o degli stent. Qui, il confronto tra tubi in PVC non rivestiti e rivestiti (epPVC: rivestimento di eparina, poliPVC: rivestimento con polimero bioattivo). L'attivazione delle piastrine è stata abbassata, ma è stata riscontrata una maggiore attivazione del sistema di coagulazione (FPA) per entrambi i tubi rivestiti rispetto ai tubi non rivestiti. I tubi hepPVC qui utilizzati vengono modificati con eparina legata covalentemente per renderli tromboresitanti^{21 e} sono già stati utilizzati in un modello ad anello per ottimizzare e caratterizzare diversi parametri^22. I tubi poliPVC utilizzati in questo studio sono tubi disponibili in commercio utilizzati in contesti clinici di perfusione ematica extracorporea e sono rivestiti con un polimero eparina per ridurne la trombogenicità^23. A volte, nelle applicazioni cliniche vengono utilizzati anche tubi in PVC non rivestiti. Pertanto, abbiamo incluso i tubi in lattice come gruppo di controllo positivo che ha mostrato un'eccessiva attivazione di piastrine, sistema di coagulazione e fattori solubili come IL-6, TNF e PMN elastasi. La formazione di trombo è stata notata quando è stata simulata una chiusura imprecisa del loop. Ciò ha portato all'attivazione del sistema di coagulazione e complemento, nonché di leucociti e piastrine rispetto alle condizioni di base. Inoltre, il contatto sanguigno con il materiale stent qui usato (stent nitinolo di metallo nudo, coperto con politetrafluoroetilene espanso impregnato di carbonio) ha portato a una maggiore attivazione piastrinica e leucocitaria in termini di elastasi PMN. Nel complesso, il modello presentato non ha indotto l'emolisi in nessuno dei dispositivi vascolari testati in quanto erano paragonabili alle condizioni basali o statiche, ad eccezione dei tubi di lattice, dove l'emolisi dei globuli rossi (RBC) era ovvia. Inoltre, questi tubi perfusione possono essere esaminati mediante imaging o istologia. Sebbene le valutazioni istologiche possano essere fattibili, ci siamo concentrati principalmente sull'ELISA e sulla citometria del flusso per eseguire questi esperimenti e quindi consentire la fattibilità di condurre esperimenti sulla base del modello qui presentato per molti laboratori. Pertanto, questo metodo rappresenta un metodo fattibile per testare la biocompatibilità ematica dei dispositivi medici vascolari in conformità con le raccomandazioni dello standard ISO 10993-4. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato ogni volta che un'interazione tra sangue e materiali deve essere testata in condizioni di flusso, imitando le condizioni in vivo.

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della facoltà di medicina dell'Ospedale Universitario di Magdeburgo (numero di domanda 88/18) e le materie hanno fornito il consenso informato scritto prima della procedura di prelievo del sangue.

1. Preparazione del patrimonio eparina e prelievo del sangue

1. Calcola la quantità di sangue necessaria per l'intero esperimento.
   NOTA: Quasi, 5 mL di sangue eparinato sono necessari per ogni dispositivo vascolare in duplicati (anelli). Allo stesso modo, sono necessari 5 mL di sangue per ogni condizione basale e statica che viene tenuta da parte a temperatura ambiente.
2. Preparare una soluzione di cedimento di eparina alla concentrazione di 100 UI/mL diluire l'eparina non fratturata (ad esempio Rotexmedia) in acqua deionizzata. Utilizzare 150 μL di questa soluzione per l'eparinazione di 10 mL di sangue fresco.
3. Calcola la quantità di sangue e plasma necessaria per il conteggio delle cellule del sangue intero, i test ELISA e FACS.
   NOTA: Le misurazioni rappresentate in questo studio sono ottenute da due anelli che corrono in parallelo (uno come duplicato) con un volume totale di sangue di 10 mL.
4. In base alla quantità richiesta di sangue, riempire le siringhe da 10 ml con 150 μL di soluzione di stock di eparina per prevenire la coagulazione del sangue con una concentrazione finale di eparina di 1,5 UI/ml di sangue.
5. Ereere sangue usando una farfalla (dimensione: 21 G). Riempire le siringhe molto delicatamente per evitare l'emolisi o l'attivazione cellulare a causa di un vuoto eccessivo.
   NOTA: L'autorizzazione del comitato etico locale deve essere ottenuta prima dell'inizio degli esperimenti. Ottenere il consenso informato di ogni donatore di sangue umano. Assicurarsi che il donatore di sangue sia sano e non prenda alcun farmaco, in particolare nessun agente antipiastrine o farmaci antinfiammatori non steroidei per almeno 10 giorni prima degli esperimenti. Si noti che lo stesso donatore è preferito quando si confrontano diversi tipi di dispositivi vascolari per la prima volta come presentato in questo manoscritto. Per valutare ulteriormente le differenze inter-individuali, il protocollo può essere ripetuto con diversi donatori.
6. Raccogliere il sangue in un bicchiere, evitare un'eccessiva agitazione.

2. Assemblaggio di loop emodinamici in vitro

1. Riempire il bagno d'acqua fino a quando il livello dell'acqua raggiunge il centro dell'unità di rotazione. Impostare la temperatura dell'acqua a 37 °C.
2. Assemblaggio loop per testare diversi materiali di tubi (poliPVC, hepPVC, PVC e lattice)
   1. Tagliare due pezzi lunghi 50 cm di ogni materiale del tubo (diametro interno 5 mm) con la fresa a tubo. Assicurarsi che la superficie di taglio sia piatta, in quanto ciò è particolarmente importante per una chiusura perfetta per gli anelli con piccoli diametri in modo che il sangue fluisca senza alcuna distorsione sul bordo del raccordo.
      NOTA: L'intero protocollo utilizza i tubi con un diametro interno di 5 mm.
   2. Per facilitare la movimentazione ed evitare ritardi di elaborazione post-campionamento dopo la rotazione, eseguire solo quattro anelli (2 materiali in duplicati) in parallelo.
   3. Per generare una forma ad anello, collegare le terminazioni aperte dei tubi in un breve pezzo di tubo di silicio che si adatta al diametro esterno del tubo investigativo.
   4. Utilizzare le bande di tensione in policarbonato per garantire una corretta chiusura dei loop. Quando viene utilizzato per la prima volta, regolare la lunghezza delle bande per adattarsi al diametro esterno dell'anello tagliando la fascia di tensione con le forbici nelle lunghezze richieste e fissarla con una chiave di coppia di 3 mm.
   5. Stringere con cura la vite di bloccaggio del connettore della banda di tensione sotto ispezione delle terminazioni del tubo. Regolare la forza di chiusura in modo che non rimanga spazio tra le terminazioni del tubo. Se la vite di bloccaggio è totalmente stretta e la tensione della banda in policarbonato sembra troppo bassa per colmare lo spazio tra le terminazioni del tubo, aprire il bloccaggio del sistema e tagliare alcuni mm della banda di tensione. Ripetere questa situazione, fino a ottenere una chiusura accurata del ciclo (Figura 1A).
   6. Se il materiale del tubo è molto morbido e tende a scivolare all'interno delle bande di tensione, fissare l'anello con nastro elettrico alla banda di tensione(Figura 1B,C).
   7. Preparare un ciclo aggiuntivo di PVC per il controllo della temperatura con le stesse dimensioni dei cicli di prova.
   8. Fissare gli anelli nella culla ad anello dell'unità di rotazione all'esterno del bagno d'acqua. Successivamente, attaccare la culla ad anello all'unità di rotazione all'interno del bagno d'acqua( Figura 1E).
   9. Smontare la banda di tensione in parte dai loop e scollegare un'estremità di ogni tubo per aprire il loop.
   10. Riempire delicatamente ogni anello con 5 mL di sangue con una pipetta sierologica da 5 mL. Mescolare delicatamente il sangue due volte nel becher di vetro tubazioni lentamente su e giù prima di caricarlo nei loop.
   11. Prendi il termometro monouso e posizionalo all'interno del ciclo di controllo della temperatura. Se il termometro è troppo grande, tagliarlo con le forbici per adattarsi a tubi più piccoli. Riempire l'anello con 5 mL di acqua deionizzata a temperatura ambiente.
   12. Chiudere i loop e assicurarsi che i loop, le bande di tensione e il rack siano correttamente montati.
   13. Impostare la velocità di rotazione su 30 colpi al minuto (giri/min) e ruotare per 3 ore.
3. Assemblaggio loop per testare l'impatto della chiusura impropria del loop (gap)
   1. Preparare quattro anelli (polyPVC) come descritto al punto 2.2.
   2. Chiudere correttamente due anelli con le bande di tensione ed evitare qualsiasi spazio tra le terminazioni del tubo.
   3. Per gli altri due anelli collegare le terminazioni aperte nel tubo più grande come descritto al punto 2.2.3, ma lasciare uno spazio di 1-2 mm tra le terminazioni del loop. Non utilizzare le bande di tensione per questi cicli (Figura 1D).
   4. Preparare un ciclo di controllo della temperatura come descritto nei punti 2.2.7 e 2.2.11.
   5. Riempire tutti i cicli di sangue come descritto al 2.2.10.
   6. Impostare la velocità di rotazione su 30 giri/min e ruotare per 3 ore.
4. Assemblaggio loop per test stent
   1. Preparare quattro cicli come descritto nella 2.2 e seguenti.
      NOTA: Per valutare la biocompatibilità ematica degli stent, il materiale del tubo stesso deve essere testato per essere biocompatibile al fine di prevenire il mascheramento dell'attivazione cellulare. Se non esistono dati, il materiale del tubo stesso può essere testato come descritto al 2.2. Inoltre, l'intervallo di diametro all'interno dello stent può essere applicato (vedi istruzioni del produttore) e deve adattarsi al diametro interno del materiale del tubo.
   2. Aprire due anelli e togliere il tubo dal sistema di bande di tensione.
   3. Inserire lo stent al centro del tubo secondo le istruzioni del produttore.
   4. Utilizzare gli altri due cicli senza stent come controllo. Riempire tutti i cicli di sangue come descritto al 2.2.10.
   5. Impostare la velocità di rotazione su 30 giri/min e ruotare per 3 ore.
5. Controllo della temperatura
   1. In qualsiasi momento durante la durata e quando la rotazione viene interrotta, la temperatura del sangue all'interno dei loop è indicata dal termometro all'interno del ciclo di controllo della temperatura. Per leggere la temperatura, interrompere la rotazione e leggere immediatamente la temperatura indicata dal termometro.

3. Elaborazione del campione di sangue

1. Dopo la rotazione, lasciare riposare i loop nel rack per 2 minuti in posizione verso l'alto per lasciare che il sangue si accumuli nella parte inferiore dei loop, evitando qualsiasi fuoriuscita mentre si aprono i loop.
2. Ispezionare il sangue lasciato per le condizioni statiche: se questo sangue è coagulato, alla fine si sospetta un'eparinazione impropria. In questo caso, ripetere l'esperimento preferibilmente anche con un altro donatore di sangue.
3. Togliere con cura i loop dal rack. Aprire i connettori e lasciare fluire il sangue in un bicchiere da 10 mL.
4. Mettere in comune il sangue dai tubi che vengono eseguiti in duplicati.
5. Eleva sangue fresco per l'analisi di base dallo stesso donatore descritto nei punti 1.5 e 1.6.
6. Raccolta di sangue di citrato di sodio
   1. Per la raccolta del sangue di citrato di sodio, riempire quattro tubi da 1,5 ml, ciascuno con soluzione di citrato di sodio da 111 μL raccolta da tubi di citrato di sodio, per generare una concentrazione finale del 3,2% di citrato di sodio.
   2. Riempire ogni tubo con 1 ml di sangue dai becher di vetro come descritto ai punti 1.6 e 3.3.
   3. Conservare il sangue a temperatura ambiente e utilizzare questo sangue per le analisi FACS come descritto al punto 12.
      NOTA: Per modificare la lunghezza dei loop per diverse configurazioni sperimentali, pianificare correttamente le aliquote in base alla quantità di misurazioni da effettuare. Può essere necessario stabilire tutte le misurazioni richieste con sangue fresco prima dei veri esperimenti per garantire che il volume di sangue nei loop sia sufficiente per tutte le misurazioni.
7. Raccolta di campioni di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) nel sangue e nel plasma.
   1. Da ogni bicchiere di vetro con sangue (vedi 1.6 e 3.3) trasferire 4,5 ml di sangue in un tubo EDTA da 5 ml. Riempire con sangue due tubi EDTA da ogni bicchiere da 10 ml.
   2. Mescolare delicatamente il sangue e tenerlo sul ghiaccio.
   3. Trasferire 2 ml di sangue in un tubo di centrifugazione bloccante da 2 ml e utilizzare questo sangue per il conteggio delle cellule del sangue e la misurazione libera dell'emoglobina come descritto al punto 5. E 6.
   4. Centrifugare il sangue rimanente a 3.500 x g per 20 minuti.
   5. Raccogliere con cura il plasma nel supernatante in aliquote da 500 μL e congelare immediatamente a -80 °C.

4. Microscopia elettronica a scansione e immagini μCT

1. Dopo l'elaborazione del campione di sangue, sciacquare gli anelli svuotati preparati come descritto al punto 2.3 con 10 mL di soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) ciascuno.
2. Tagliare con cura un campione lungo 1 cm da ogni estremità di ogni tubo con un bisturi.
3. Incubare il campione durante la notte a 4 °C in una soluzione di glutaraldeide al 2%.
   ATTENZIONE: L'inalazione di vapori di aldeide può causare sintomi nasali come un naso che cola o soffocamento persistente e irritazione delle vie aeree e il contatto con la pelle causa dermatite. Le aldeidi devono essere maneggiate in un cappuccio aspirante mentre indossano guanti, un abito protettivo e occhiali di sicurezza.
4. Risciacquare il campione (3 volte) con PBS.
5. Preparare una soluzione all'1% di tetrossido di osmio (OsO₄₎in acqua deionizzata e incubare il campione per 15 minuti a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: OsO₄ è un forte agente ossidante, può essere ridotto dall'esposizione alla luce. Per evitare la riduzione durante la preparazione, conservare OsO₄ in una bottiglia di vetro marrone. OsO_{4 è} estremamente volatile, i suoi fumi sono tossici per occhi, naso e gola. Lavorare sempre sotto un cappuccio dei fumi e utilizzare guanti e proteggere gli indumenti, assicurando che nessuna parte del corpo sia esposta a OsO₄. Contattare le linee guida dell'istituto in materia di gestione dello smaltimento e dello stoccaggio dei rifiuti. In generale, OsO₄ è conservabile per diversi mesi, ma ha bisogno di speciali bottiglie di vetro con rivestimento in Teflon e un essiccatore, perché OsO₄ può scolorire le superfici interne e il contenuto del frigorifero in presenza di fumi che perdono.
6. Prelevare campioni, trasferirli in nuovi tubi di centrifuga da 15 ml e risciacquare i campioni 3 volte con PBS.
7. Preparare una serie di etanolo con concentrazioni variabili (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
8. Campioni disidratati in etanolo: incubare per 20 minuti ciascuno nel 25%, 50%, 75% e 90% e 30 min nel 100%.
9. Prelevare campioni dal 100% di etanolo e lasciarlo asciugare all'aria durante la notte a temperatura ambiente.
10. Esaminare i campioni nel microscopio elettronico a scansione ad una tensione di accelerazione di 5 kV e con lo scanner μCT a raggi X.

5. Numero di cellule del sangue

1. Assumere 2 mL del sangue EDTA ottenuto come descritto al 3.7.3
2. Inserire il tubo nell'analizzatore di ematologia automatizzato e seguire le istruzioni del produttore.

6. Misurazione dell'emoglobina libera (fHb) nel plasma

1. Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5. Conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
   NOTA: Scongelare sempre campioni di plasma congelato in un bagno d'acqua a 37 °C e trasferirli immediatamente sul ghiaccio, contenente un po 'd'acqua, per abbassare la temperatura. Questo è importante per evitare l'attivazione dei componenti del sangue durante lo scongelamento.
2. Utilizzare il reagente fHb e seguire le istruzioni del produttore. Evitare la contaminazione dopo l'apertura e proteggere il reagente dalla luce diretta (sole, luce UV).
3. Utilizzare uno schema di pipettazione (vedere le istruzioni del produttore) con diluizione 1:5.
4. Aggiungere 1000 μL del reagente dell'emoglobina in una cuvetta semi-micro da 1,6 mL. Utilizzare questa cuvetta per determinare il valore vuoto.
5. Aggiungere 1000 μL del reagente dell'emoglobina e 250 μL del campione di plasma in un'altra cuvetta semi-micro.
6. Mescolare il contenuto in entrambe le cuvette lavando accuratamente la pipetta riempiendo ripetutamente con miscela di reazione e incubare almeno 3 minuti a temperatura ambiente.
7. Determinare l'estinzione (E) del campione rispetto al reagente fHb come reagente vuoto. Calcolare la concentrazione di fHb (mmol/l) del campione: E₅₄₀-E₆₈₀ x 0,452.

7. Misurazione dell'FPA

1. Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5 e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
2. Utilizzare il kit FPA Elisa e seguire le istruzioni del produttore.

8. Misurazione di sC5b9

1. Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5 e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
2. Utilizzare il kit ELISA sC5b-9 e seguire le istruzioni del produttore.

9. Misurazione della PMN

1. Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5 e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
2. Utilizzare il kit PMN-Elastase ELISA e seguire le istruzioni del produttore.

10. Misurazione del TNF

1. Le micropiatte devono essere rivestite un giorno prima di eseguire l'ELISA. Per il rivestimento, aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale di cattura a tutti i pozzi, sigillare la piastra e incubare durante la notte a 2 °C-8 °C.
2. Scongelare un campione di plasma per ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5. Conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
3. Utilizzare il kit TNF ELISA e seguire le istruzioni del produttore.

11. Misurazione dell'IL-6

1. Le micropiatte devono essere rivestite con anticorpi di cattura un giorno prima dell'esperimento. Per il rivestimento, aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale di cattura a tutti i pozzi della micropiastra fornita con il set, la piastra di tenuta e incubare durante la notte a 4 °C
2. Scongelare un campione di plasma da ciascuna condizione ottenuta come descritto al punto 3.7.5. e conservare sul ghiaccio dopo lo scongelamento.
3. Utilizzare il kit IL-6 ELISA e seguire le istruzioni del produttore..

12. Analisi FACS

1. Preparare 500 mL di tampone FACS aggiungendo 10 mL di siero fetale di vitello e 2 mL di soluzione EDTA (0,5 M) a 488 mL di 1x PBS. Il tampone FACS può essere conservato per 4 settimane a 4°C.
2. Utilizzare 100 μL del sangue di citrato di sodio (vedere 3.6.3) per ogni procedura di colorazione (aggregati piastrine monociti (MPA), attivazione piastrinica (PA), integrine leucocite (LI)).
3. Pipetta 100 μL di sangue da ogni campione in un tubo FACS da 5 ml. Da ogni campione, preparare 3 tubi per la colorazione degli anticorpi ed etichettare con pannello MPA (aggregati piastrini monociti), pannello PA (aggregati piastrine) e pannello LI (integrina leucocitaria).
4. Mescolare il resto dei 4 campioni in un tubo FACS da 5 ml. Utilizzare questa combinazione per controlli non macchiati e fluorescenza meno uno (FMO).
5. Preparare 6 tubi FACS pipettando 100 μL del sangue campione misto in ogni tubo. Etichettare 3 tubi come non macchiati e 3 tubi come FMO-CD41, FMO-CD62P e FMO-CD162.
6. Aggiungere 100 μL di soluzione di paraformaldeide al 4% e incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica per la pelle e gli occhi. Può causare gravi irritazioni polmonari quando inalato e può portare a danni polmonari dopo un'esposizione prolungata. Inoltre, è classificato come cancerogeno e tossina riproduttiva. Indossare sempre guanti e occhiali di sicurezza e lavorare sotto il cofano dei fumi.
7. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio a ciascun tubo e centrifugare a 287 x g per 5 min. Scartare il supernatante e ripetere il passaggio di lavaggio due volte.
8. Per la lisi dei globuli rossi (RBC), aggiungere 1 mL di tampone 1x tampone RBC lysis buffer (diluire 10x RBC lysis buffer in acqua deionizzata), mescolare pipettando lentamente su e giù e incubare per 5 minuti a RT al buio.
9. Preparare perline di compensazione per singole macchie. A 1 mL di tampone FACS aggiungere 4 gocce di ogni perline positiva e negativa. Vortice approfondito e aggiungere 100 μL di soluzione di perline a un tubo FACS da 5 ml.
10. Preparare 4 tubi con perline ed etichetta come CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC e CD62P-PE. Aggiungere 1 ml di tampone FACS a ciascun tubo e centrifugare a 287 x g per 5 min. Scartare il supernatante e tenere sul ghiaccio.
11. Dopo la lisi RBC, aggiungere 1 ml di tampone FACS a ciascun tubo e lavare come descritto al punto 12.7. Scartare il supernatante.
12. Preparare cocktail anticorpali:
    1. Pannello MPA: Aggiungere 4 μL di CD45-APC, 4 μL di CD14-FITC e 4 μL di CD41-BV421 a 388 μL di buffer FACS.
    2. Pannello PA: Aggiungere 1,6 μL di CD41-BV421 e 12 μL di CD62P-PE a 386,4 μL di buffer FACS.
    3. Pannello LI: Aggiungere 4 μL di CD45-APC e 8 μL di CD162-BV421 a 388 μL di buffer FACS. Tieniti sul ghiaccio.
13. Preparare singole macchie: aggiungere da 0,5 μL a 499,5 μL di tampone FACS ciascuno per CD14-FITC, CD41-BV421 e CD45-APC. Per CD62P-PE aggiungere 0,3 μL a 499,7 μL di tampone FACS. Tieniti sul ghiaccio.
14. Preparare i controlli FMO: (i) pannello MPA (FMO-CD41): Aggiungere 1 μL CD14-FITC anticorpo e 1 μL di anticorpo CD45-APC a 98 μL tampone FACS. (ii) Pannello PA (FMO-CD62P): aggiungere 0,4 μL di CD41-BV421 a 99,6 μL di tampone FACS. (iii) Pannello LI (FMO-CD162): aggiungere 1 μL di CD45-APC a 99 μL di tampone FACS. Mantenere i controlli FMO sul ghiaccio.
15. Cocktail di anticorpi vortici e aggiungere 100 μL di ogni cocktail anticorpale preparato in 12.12 a ciascuno dei rispettivi tubi etichettati (pannello MPA, PA e LI) come descritto al punto 12.3 e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Tieni RT al buio.
16. Diluizioni di anticorpi a macchia singola vortice e aggiungere 100 μL delle diluizioni dei singoli anticorpi di macchia come preparato in 12.13. a ciascuno dei rispettivi tubi etichettati con perline come descritto al punto 12.7 e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Tieni RT al buio.
17. Vortex FMO cocktail anticorpali e aggiungere 100 μL di ogni cocktail anticorpale FMO-1 come preparato in 12.14. a ciascuno dei rispettivi tubi etichettati (controlli FMO) come descritto al punto 12.5. e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Tieniti a RT al buio.
18. Incubare tutti i tubi con colorazione anticorpale per 30 minuti a RT al buio.
19. Prendere i tre tubi per il controllo non macchiato (vedi 12.4) e resuspend pellet in 250 μL di tampone FACS. Tieniti sul ghiaccio.
20. Dopo il tempo di incubazione, lavare tutti i tubi tranne i controlli non contaminati una volta con tampone FACS come descritto al punto 12.7. Resuspend pellet in 250 μL di tampone FACS e acquisire dati sul citometro di flusso.
21. Utilizzare celle non macchiate per impostazioni negative e compensare le perline del mouse per le impostazioni positive nel software FACS. Inoltre, utilizzare FMO per controllare la strategia di gating, dove FMO-CD41 viene utilizzato nel pannello MPA, FMO-CD62P viene utilizzato nel pannello PA e FMO-CD162 viene utilizzato nel pannello LI.
22. Acquisire quasi 0,5 x 10⁶ - 0,25 x 10⁶ eventi per tubo per FACS. Salvare i dati e analizzare con un software di analisi (versione 9.9.6).

Tutti i dati presentati, ad eccezione dei grafici FACS, sono stati analizzati con un software di statistica. I grafici FACS sono stati analizzati utilizzando il software di citometria a flusso.

L'analisi del numero di globuli interi non ha mostrato differenze significative per quanto riguarda gli etrociti tra tutte le condizioni testate (Figura 2). Ma piastrine e leucociti sono stati drasticamente ridotti nel gruppo del lattice, indicando una biocompatibilità molto scarsa del lattice. Ciò è ulteriormente sottolineato dall'aumento dei livelli di emoglobina libera nel gruppo del lattice, il che indica il fatto che, ad eccezione del gruppo del lattice, nessuno degli altri dispositivi o condizioni vascolari ha portato a un'emolisi estesa (Figura 2). Inoltre, i tubi rivestiti in PVC, il poliPVC e l'hepPVC, così come lo stent testato, non hanno portato alla trombosi per mezzo della perdita di piastrine e leucociti, mentre il lattice ha mostrato la più alta perdita di piastrine e leucociti, seguita da tubi in PVC non rivestiti che hanno mostrato una tendenza ridotta.

Mentre tutti i dispositivi vascolari testati hanno portato a una maggiore attivazione del sistema di coagulazione (FPA) e del componente del complemento (sC5b-9), i loop hepPVC hanno mostrato una tendenza alla diminuzione dei livelli di FPA e sC5b-9 rispetto specificamente ai loop poliPVC(Figura 3). È interessante notare che i loop IN PVC e Gap non rivestiti mostravano livelli più bassi di FPA rispetto al poliPVC, anche se non raggiungevano il livello di significatività statistica. Tuttavia, i loop in lattice hanno mostrato livelli significativamente aumentati di FPA rispetto alle condizioni di base e statiche.

In conformità con il numero di globuli interi, gli anelli di lattice presentavano i livelli più elevati diTNF, IL-6 e PMN elastasi (Figura 4), raggiungendo il livello di significatività statistica rispetto al resto dei gruppi in termini di TNF e IL-6 (Figura 4A,B), mentre alle condizioni statiche e di base in termini di PMN elastasi (Figura 4C). Questi risultati indicano la potente attivazione dei leucociti da parte del lattice. I livelli di base dei marcatori di attivazione erano sempre paragonabili alle condizioni statiche, indicando una corretta eparinizzazione del sangue.

È interessante notare che il numero di piastrine e leucociti per i loop indotti dal gap è stato solo leggermente ridotto con un'attivazione moderata del sistema coagulatorio (FPA) e dei leucociti (Elastasi PMN), anche se una chiusura impropria del loop con conseguenti turbolenze del flusso e il contatto sanguigno con la superficie di taglio grezza non patinato ha portato a coaguli macroscopicamente visibili alla giunzione(Figura 1F). I coaguli e la sua distribuzione su tutta la superficie delle giunzione erano evidenti con immagini μCT e SEM, mentre non è stato trovato coagulo quando i loop sono stati chiusi con il dispositivo di chiusura esterno senza lasciare spazio tra le terminazioni del loop (Figura 5).

L'analisi citometrica del flusso delle cellule del sangue ospiti che sono state macchiate con marcatori specifici piastrinica, CD41 e marcatore di attivazione piastrinica CD62P, sono mostrate nella figura 6A,B. Qui, i tubi in lattice mostravano un'intensità di fluorescenza mediana estremamente elevata (IFM) per CD62P sulle piastrine del sangue, seguiti da stent, mentre i tubi in poliPVC rivestiti di eparina mostravano un'attivazione minima di piastrine raffiguranti proprietà anti-trombogeniche dei tubi poliPVC. Inoltre, i leucociti sono stati classificati in base alla granularità basata su CD45 e SSC (side scatter) in (i) granulociti; ii monociti e iii linfociti (figura 7) e l'espressione di CD162+ integrina è stata rilevata su ciascuna sottopopolazione di leucociti noti per interagire con il CD62P sulle piastrine24. È stato notato che le espressioni di integrina sono state drasticamente ridotte su granulociti e linfociti negli anelli di lattice. Questo risultato è stato in linea con i livelli abbassati delle frequenze totali dei leucociti negli anelli di lattice (Figura 2). In generale, i livelli di integrina erano più alti tra i monociti rispetto ai granulociti e ai linfociti, indicando la probabilità per l'interazione dei monociti con piastrine attivate. A questo proposito, gli aggregati piastrini monociti sono stati valutati anche macchiando le cellule del sangue con CD14 (come marcatore monocita) e CD41 (come marcatore piastrinica) e, in ultima analisi, identificando doppie cellule positive, ad esempio CD14+CD41+MPA (Figura 8). Qui, abbiamo notato che il gruppo stent mostrava i più alti livelli di espressione CD41 sull'MPA, seguito dal gruppo del lattice, indicando una maggiore tendenza a formare MPA, nonostante la ridotta frequenza del monocita (<1 %) nei loop in lattice.

Figura 1: Panoramica del modello ad anello emodinamico in vitro e delle sue modifiche. (A) Ciclo per l'esperimento gap con sistema di chiusura del loop esterno, senza lasciare spazio alla giunzione. (B) Anello in tubo in PVC rivestito in poliPVC e stent all'interno (freccia). (C) Anello in tubo di lattice. (D) Ciclo per l'esperimento gap senza che il sistema di chiusura del loop esterno lasci uno spazio tra le terminazioni del tubo (freccia). (E) Anelli posti nella culla ad anello all'interno del bagno d'acqua e riempiti di sangue. (F) Trombo risultante in uno spazio alla giunzione (freccia) dopo la rotazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati per la conta delle cellule del sangue e l'emoglobina plasmatica. (A) Contano gli erytrociti. (B) Le piastrine contano. (F) Contano i leucociti. (D)Emoglobina al plasma libera. I risultati indicano la scarsa biocompatibilità del lattice, portando a un'eccessiva emolisi. I dati sono presentati come valore medio; le barre di errore indicano SEM. n=1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati per l'attivazione del sistema di coagulazione e complemento. (A) Attivazione del sistema di coagulazione, misurata in base ai livelli di fibrinopeptide A (FPA) (B) Attivazione del sistema di complemento, misurata in base ai livelli di sC5b-9. Mentre i tubi in lattice evocavano livelli elevati significativi dell'FPA, l'attivazione del complemento era forte per tutti i materiali testati. I dati vengono presentati come valore medio, le barre di errore indicano SEM. *p<0.05, n=1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Marcatori di attivazione dei leucociti. (A) Fattore di necrosi tumorale alfa (TNF). (B) Interleuchina 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. I risultati indicano una maggiore attivazione dei leucociti a causa degli elevati livelli dei marcatori analizzati, seguita da cicli stent, che hanno portato solo ad un aumento dei livelli per la PMN Elastase ma non per il TNF o l'IL-6. I dati vengono presentati come valore medio, le barre di errore indicano SEM. *p<0.5; **p<0,01, n=1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Imaging delle giunzione dei loop. (A) μ tomografia computerizzata (μCT) di loop con chiusura impropria (gap). Le aree rosse indicano materiale trombo. (B) Rendering del lato luminare del tubo. La selezione rettangolare indica l'area per la microscopia elettronica a scansione (SEM) (C). (D) μCT di loop con dispositivo di chiusura ad anello esterno e nessun gap alla giunzione, e (E) rendering e vista della superficie luminare. Non è stato trovato materiale trombo. (F) Immagine SEM della selezione rettangolare in (E). Nessun materiale trombo è stato trovato sulla superficie di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Grafico FACS per l'attivazione piastrinica (CD62P). (A) Posto rappresentante FACS (condizione di base) che mostra il SANGUE CD41+ piastrine. (B) Grafico che mostra lo stato di attivazione piastrinica riflesso dall'intensità media di fluorescenza (IFM) dei diversi tipi di dispositivi vascolari rispetto alla RT statica e alle condizioni di base. Le barre dei dati presentano i dati di singole misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Grafico FACS per l'integrina leucocitarie (CD162). (A) Grafico rappresentativo FACS (condizione di base) che mostra il sangue CD45+ leucociti e sottogruppi (B) Grafico che mostra il leucocita CD162+ intensità media di fluorescenza (IFM) dei diversi tipi di dispositivi vascolari rispetto alle condizioni statiche e di base. Le barre dei dati presentano i dati di singole misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Grafico FACS per aggregati di monociti piastrinica (CD41/CD14). (A) Grafico rappresentante FACS (condizione di base) che mostra la gating per monociti del sangue (CD45+/CD14+), piastrine (CD41+) e aggregati piastrinica monociti (CD41+/CD14+) ( B )Graficoche mostra l'intensità di fluorescenza media (IFM) cd41+ media sugli aggregati piastrine monociti per i vari dispositivi vascolari rispetto alle condizioni statiche e di base. Le barre dei dati presentano i dati di singole misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il finanziatore [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Germania] fornì un sostegno finanziario sotto forma di materiali di consumo e tasse di pubblicazione all'autore di questo manoscritto [Max Wacker]. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo aggiuntivo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o preparare il manoscritto.