Quantificazione del DNA circolante specifico del maiale nel sangue di un modello di xenotrapianto

Sommario

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. Utilizzando primer specifici per specie, cpsDNA è stato quantificato da qPCR in modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia.

Abstract

Lo xenotrapianto è un metodo fattibile per trattare l'insufficienza d'organo. Tuttavia, come monitorare efficacemente il rifiuto immunitario dello xenotrapianto è un problema per medici e ricercatori. Questo manoscritto descrive un metodo semplice ed efficace per monitorare il rigetto immunitario nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il DNA circolante è un biomarcatore potenzialmente non invasivo per il danno agli organi. In questo studio, il DNA circolante specifico del maiale (cpsDNA) è stato monitorato durante il rigetto dello xenograft mediante PCR quantitativo in tempo reale (qPCR). In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suiini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione. I primer specifici per specie sono stati quindi utilizzati per quantificare il cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arteria da maiale a scimmia. Il valore di questo metodo suggerisce che può essere usato come metodo semplice, conveniente, a basso costo e meno invasivo per monitorare il rifiuto immunitario dello xenotrapianto.

Introduzione

L'insufficienza d'organo è una delle principali cause di^{morte 1}. Il trapianto di cellule, tessuti e organi è un modo efficace per trattare l'insufficienza^{d'organo 2}. Tuttavia, la carenza di organi donatori limita l'applicazione clinica di questo^{metodo 3,4}. Gli studi hanno dimostrato che i maiali possono essere utilizzati come potenziale fonte di organi umani per il trapianto^{clinico 5,6}. Tuttavia, il trapianto di organi tra specie deve affrontare un pericoloso rifiuto immunitario. Pertanto, è fondamentale ....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti dell'Institutional Review Board of Shenzhen Second People's Hospital, Primo ospedale affiliato dell'Università di Shenzhen.

1. Progettare primer specifici per suini

1. Eseguire l'analisi BLAST dell'intero genoma per identificare geni specifici suiini diversi da quelli di esseri umani, scimmie o topi, utilizzando il software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2. Progettare primer secondo 19 geni specifici del maiale (Tabella 1) utilizzando il software di Primer 5.

2. Isolare il DNA gen....

Risultati

In questo protocollo sono stati progettati primer specifici suini, sono stati costruiti frammenti di DNA specifici contenenti plasmidi e sono state stabilite curve standard per la quantificazione(figura 4). Le specificità delle specie dei 19 primer sono state confermate dalla PCR. I primer specifici per specie (primer #4 e primer #11) sono stati quindi utilizzati per quantificare cpsDNA da qPCR nei modelli di trapianto di cellule da maiale a topo e nei modelli di trapianto di patch per arter.......

Discussione

Quantificare il DNA circolante suina rappresenta un approccio fattibile per monitorare il rigetto immunitario dello xenotrapianto. ²⁴ hanno scoperto che il contenuto di DNA circolante derivato dal donatore (ddcfDNA) nel sangue dei pazienti con rigetto acuto era significativamente superiore a quello dei pazienti senza rifiuto. Questi studi suggeriscono che il ddcfDNA può essere un biomarcatore comune per il monitoraggio dei danni da innesto degli organi. Negli ultimi anni, qPCR è stato sempre più a.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarose	Biowest, Barcellona, Spagna	111860
BamHI-HF	New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA	R3136S
1,5 mL provetta per microcentrifuga	Axygen  Bioscienze, Union City, CA, USA	MCT-150-C
Provetta PCR da 0,2 mL	Axygen  Bioscienze, Union City, CA, USA	PCR-02-C
C57BL / 6 Topi	Animal Center della provincia del Guangdong, Cina		8 ~ 10 settimane
Centrifuga	Thermo  Pescatore Scientifico, Waltham, MA, USA	Micro 21R
2-Log DNA Ladder	New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA	N3200S	0.1– 10.0 kb
Marker I	Tiangen, Pechino, Cina	MD101-02	0.1– 0,6 kb
DNA Mini Colonna(HiBind DNA Mini Colonne)	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	DNACOL-01
DNA buffer di caricamento	Solarbio, Pechino, Cina	D1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I e E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit II	Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA	D6942
D6943
EcoR I	Takara  Biografia, Shiga, Giappone	1040S Femmina
Bama mini maialini	BGI Ark Biotechnology, Shenzhen, Cina		2 ~ 4 mesi
Kit di estrazione del DNA genomico?	Tiangen, Pechino, Cina	DP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	Toyobo, Osaka, Giappone	QPK-201
Gel Doc XR	Bio-Rad, Hercules, USA
Maschio scimmie cynomolgus	Guangdong Landau Biotechnology, Guangzhou, Cina		8 anni
Colorante acido nucleico (Gelred)	Biotium, Fremont, USA	42003
polimerasi(Premix Taq)	Takara  Bio, Shiga, Giappone	RR901A
pMD19-T plasmide	Takara  Bio, Shiga, Giappone	D102A
qPCR macchina	Applied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Kit di estrazione siero/DNA circolante	Tiangen, Pechino, Cina	DP339
TAE	sangon Biotech, Shanghai, Cina	B548101

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