Visualizzazione della dinamica di diffusione dei nanorodi d'oro sulla membrana cellulare utilizzando la microscopia a campo scuro a nanoparticella singola

Summary

Qui, mostriamo l'uso della tradizionale microscopia a campo scuro per monitorare la dinamica delle nanorodi d'oro (AuNR) sulla membrana cellulare. La posizione e l'orientamento dei singoli AuR vengono rilevati utilizzando ImageJ e MATLAB, e gli stati diffusivi degli AuR sono caratterizzati da un'analisi di tracciamento di singole particelle.

Abstract

L'analisi della dinamica di diffusione delle nanoparticelle sulla membrana cellulare gioca un ruolo significativo nella migliore comprensione del processo di assorbimento cellulare e fornisce una base teorica per la progettazione razionale della somministrazione di nano-medicina. L'analisi del single particle tracking (SPT) potrebbe sondare la posizione e l'orientamento delle singole nanoparticelle sulla membrana cellulare, e rivelare i loro stati traslazionali e rotazionali. Qui, mostriamo come usare la tradizionale microscopia a campo scuro per monitorare la dinamica delle nanorodi d'oro (AuNR) sulla membrana cellulare viva. Mostriamo anche come estrarre la posizione e l'orientamento degli AuNAR utilizzando ImageJ e MATLAB e come caratterizzare gli stati diffusivi degli AuNR. L'analisi statistica di centinaia di particelle mostra che i singoli AuRS eseguono il moto browniano sulla superficie della membrana cellulare U87 MG. Tuttavia, l'analisi individuale a traiettoria lunga mostra che gli AuRS hanno due tipi distintamente diversi di stati di movimento sulla membrana, vale a dire il trasporto a lungo raggio e il confinamento ad area limitata. I nostri metodi SPT possono essere potenzialmente utilizzati per studiare la diffusione della superficie o delle particelle intracellulari in diverse cellule biologiche e possono diventare un potente strumento per le indagini su meccanismi cellulari complessi.

Introduction

La dinamica delle nanoparticelle (NP) sulla membrana è strettamente associata al processo di assorbimento cellulare, che è essenziale per la comprensione delle funzioni cellulari, delle infezioni virali o batteriche e dello sviluppo di sistemi artificiali di somministrazione nanomedicale^1,2. La tecnica di single particle tracking (SPT) è uno strumento robusto per caratterizzare i comportamenti eterogenei dei PNP^3,4. In generale, la membrana cellulare è fluidica, il che significa che i componenti come proteine e lipidi possono muoversi lateralmente nel ....

Protocol

1. Coltura cellulare

1. Preparare il mezzo completo per le cellule U87 MG aggiungendo siero bovino fetale (concentrazione finale 10%) e penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%) al mezzo essenziale minimo (MEM). Utilizzare il piatto di coltura cellulare in plastica per la sottocoltura delle cellule.
2. Celle di passaggio da 2 a 3 volte a settimana.
   1. Rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare lo strato cellulare con la salina tamponata dal fosfato di Dulbecco (D-PBS) 2~3 volte quando è confluente (80%~90%).
   2. Aggiungere da 1,0 a 2,0 mL di soluzione di tripside-EDTA al piatto di coltura cellulare e osservare le cellule al microsc....

Results

Nel protocollo sono stati utilizzati i CTAB-AuNR non modificati da 40 x 85 nm. Come mostrato nella figura 2B, il suo massimo plasmonico longitudinale a è di ~ 650 nm (regione rossa) e la risonanza trasversale è a 520 nm (regione verde). Letterature precedenti hanno rivelato che le proprietà ottiche (come l'intensità LSPR) degli AuNR plasmonici cambieranno significativamente con il loro^{diametro 20,22}. Nella figura.......

Discussion

Il protocollo presentato viene utilizzato per studiare la dinamica degli AuNR sulla membrana cellulare. Il protocollo è composto da quattro parti, tra cui l'imaging microscopico, l'estrazione dei dati, il calcolo dei parametri dinamici e i metodi di analisi dei dati, e ogni parte è flessibile e universale. Pertanto, ci sono molte possibili applicazioni future, ad esempio, studiando il movimento delle molecole di membrana legate all'NP sulla membrana, la dinamica dell'endocitosi dei recettori etichettati NP, l'analisi din.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanobarre d'oro rivestite CTAB (CTAB-AuNRs)	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm * 40 nm
Fotocamera CMOS a colori	Olympus	DP74	Giappone
Vetrini	coprioggetti Citoglas	z10212222C	22*22 mm
	Microscopia verticale Nikon		80i
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10099141
Fiji	National Institutes of Health	2.0.0-rc-69/1.52 p	a distribuzione di ImageJ
Slitta in vetro scanalato	Marca di vele	7103	Immagine singola concava
J	National Institutes of Health	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB Codice			https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Terreno essenziale minimo (MEM)	Gibco	10-010-CVR	con rosso fenolo
Terreno essenziale minimo (MEM)	Gibco	51200038	senza rosso fenolo
Origine OriginLab		Origin Pro 2018C
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140122
Piastre per colture cellulari in plastica	Falcon	353002
Coltura cellulare in plastica piatti	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG cell	American Type Culture Collection	ATCC HTB-14	una linea cellulare di glioblastoma primario umano