L'infezione di topi neonatale con bioluminescente E. coli O1:K1:H7 provoca un'infezione settica con significativa infiammazione polmonare e patologia polmonare. Qui descriviamo le procedure per modellare e studiare ulteriormente la sepsi neonatale utilizzando l'imaging intravitale longitudinale in parallelo con l'enumerazione dei fardelli batterici sistemici, la profilazione infiammatoria e l'istopatologia polmonare.
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Articolo metodologico
Un modello di imaging neonatale di sepsi batterica gram-negativa
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neonati sono a maggior rischio di sepsi batterica a causa del profilo immunitario unico che mostrano nei primi mesi di vita. Abbiamo stabilito un protocollo per lo studio della patogenesi di E. coli O1:K1:H7, un sierotipo responsabile degli alti tassi di mortalità nei neonati. Il nostro metodo utilizza l'imaging intravitale dei cuccioli neonatale in diversi punti di tempo durante la progressione dell'infezione. Questa imaging, parallela alla misurazione dei batteri nel sangue, al profilo infiammatorio e all'istopatologia tissutale, significa un approccio rigoroso alla comprensione della dinamica dell'infezione durante la sepsi. Nell'attuale relazione, modelliamo due inoculi infettivi per il confronto dei fardelli batterici e della gravità della malattia. Scopriamo che l'infezione subscapulare porta alla diffusione dell'infezione da 10 h dopo l'infezione. A 24 ore, l'infezione da E. coli luminescente era abbondante nel sangue, nei polmoni e in altri tessuti periferici. L'espressione delle citochine infiammatorie nei polmoni è significativa a 24 ore, e questo è seguito da infiltrazioni cellulari e prove di danni ai tessuti che aumentano con la dose infettiva. L'imaging intravitale ha alcune limitazioni. Ciò include una soglia del segnale luminescente e alcune complicazioni che possono insorgere con i neonati durante l'anestesia. Nonostante alcune limitazioni, scopriamo che il nostro modello di infezione offre una visione per comprendere la dinamica dell'infezione longitudinale durante la sepsi murina neonatale, che non è stata esaminata a fondo fino ad oggi. Ci aspettiamo che questo modello possa anche essere adattato per studiare altre infezioni batteriche critiche durante la prima infanzia.
Introduzione
La sepsi batterica è una preoccupazione significativa per i neonati che mostrano un profilo immunitario unico nei primi giorni di vita che non fornisce un'adeguata protezione dall'infezione1. La sepsi neonatale continua ad essere un problema sanitario significativo negli Stati Uniti, rappresentando oltre 75.000 casi all'anno solo negli StatiUniti 2. Per studiare queste infezioni in profondità, sono necessari nuovi modelli animali che ricapitolano aspetti della malattia umana. Abbiamo stabilito un modello di infezione neonatale del topo utilizzando Escherichia coli, O1:K1:H73
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali della Virginia Occidentale e condotte in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio da parte del Consiglio Nazionale delleRicerche 18.
1. Preparazione dell'inoculo batterico
- Striare una piastra di agar di soia triptica (TSA) con un anello inoculato per l'isolamento di una singola colonia da uno stock congelatore di E. coli O1:K1:H7-lux che esprime stabilmente luciferasi e porta resistenza alla kanamicina3. Incubare ....
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Risultati
Questo protocollo ha indotto la sepsi batterica nei topi neonatale e abbiamo usato l'imaging intravitale longitudinale, l'enumerazione dei batteri nel sangue, le valutazioni istologiche della patologia e i profili di espressione della citochina infiammatoria per studiare il decorso della malattia. Segni di morbilità sono stati osservati nei cuccioli neonatale infettati sia da inoculi bassi (~2 x10 6 CFU) che alti (~7 x10 6 CFU) di E.coli nel tempo. I cuccioli che hanno ricevuto il maggiore .......
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Discussione
Il nostro modello di infezione subscapulare per indurre sepsi batterica nei topi neonatale è un nuovo metodo per studiare la diffusione longitudinale degli agenti patogeni batterici in tempo reale. L'imaging intravitale offre l'opportunità di esplorare la diffusione batterica in tempo reale nei neonati. Questo è fondamentale per comprendere la cinetica della diffusione batterica e per studiare ulteriormente la risposta e il danno dell'ospite nella fase appropriata della malattia. Ai cuccioli di topo viene somministrata u.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi istituzionali a C.M.R.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da insulina da 1 ml | Coviden | 1188128012 | Inoculo o iniezione di PBS |
| 10% Formalina tamponata neutra | VWR | 89370-094 | Istopatologia |
| ACK Lisi Tampone | Gibco | LSA1049201 | Test di eliminazione batterica |
| Pasta per tatuaggi animali | Ketchum | KI1482039 | Identificazione degli animali |
| Inchiostro per tatuaggi animali Pasta verde | Ketchum | KI1471039 | Identificazione animale |
| Anti-Ly-6B.2 Microsfere | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Isolamento cellulare |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (esprime luciferasi) | N/A | N/A | Costruito internamente presso WVU |
| Kit di RNA per estrazione totale E.Z.N.A. HP | Omega Bio-tek | R6812 | Estrazione di RNA |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Crescita batterica |
| IL-1 beta Primer/Sonda (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Espressione di citochine qPCR |
| IL-6 Primer/Sonda (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific 4331182 | Espressione delle citochine qPCR | |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | PCR quantitativa in tempo reale |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | sintesi del cDNA |
| Tampone di isolamento | Miltenyi Biotec | N/A | Test di clearance batterica |
| IVIS Spectrum CT e Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Imaging intravitale |
| : LB Brodo, Lennox | Fisher, BioReagenti | BP1427-500 | Crescita batterica |
| EASYstrainer (cestello in nylon) | Greiner, Bio-one | 542 040 | Filtro cellulare |
| SpectraMax, iD3 | Dispositivi molecolari | N/A | Lettore di piastre |
| Pellet, Pestello, Motore | Grainger | 6HAZ6 | Omogeneizzazione tissutale |
| Pellet di polipropilene Pestles | Grainger | 6HAY5 | Omogeneizzazione tissutale |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | Sintesi di cDNA |
| TNF-alfa Primer/Sonda (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Espressione di citochine qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Centro di ricerca molecolare | TR 118 | Estrazione di RNA |
Riferimenti
- Qazi, S. A., Stoll, B. J. Neonatal sepsis: a major global public health challenge. Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).
- Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. Early-onset neonatal sepsis. Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014). <....
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Ristampe e permessi
