Articolo metodologico

Modello di guarigione delle ferite escisionali murine e analisi istologica delle ferite morfometriche

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DOI:

10.3791/61616

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21 agosto 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come generare ferite escisionali bilaterali a pieno spessore nei topi e come monitorare, raccogliere e preparare successivamente le ferite per l'analisi morfometrica. È inclusa una descrizione approfondita di come utilizzare sezioni istologiche seriali per definire, quantificare e rilevare con precisione i difetti morfometrici.

Abstract

Il modello di ferita escisionale murina è stato ampiamente utilizzato per studiare ciascuna delle fasi sequenzialmente sovrapposte della guarigione delle ferite: infiammazione, proliferazione e rimodellamento. Le ferite murine hanno un letto di ferita istologicamente ben definito e facilmente riconoscibile su cui sono misurabili queste diverse fasi del processo di guarigione. All'interno del campo, è comune usare un "mezzo" arbitrariamente definito della ferita per analisi istologiche. Tuttavia, le ferite sono un'entità tridimensionale e spesso non istologicamente simmetriche, supportando la necessità di un metodo di quantificazione ben definito e robusto per rilevare difetti morfometrici con una piccola dimensione dell'effetto. In questo protocollo, descriviamo la procedura per la creazione di ferite adicisionali bilaterali a pieno spessore nei topi, nonché un'istruzione dettagliata su come misurare i parametri morfometrici utilizzando un programma di elaborazione delle immagini su sezioni seriali selezionate. Le misurazioni a due dimensioni della lunghezza della ferita, della lunghezza epidermica, dell'area epidermica e dell'area della ferita sono utilizzate in combinazione con la distanza nota tra le sezioni per estrapolare l'area epidermica a tre dimensioni che copre la ferita, l'area complessiva della ferita, il volume epidermico e il volume della ferita. Sebbene questa dettagliata analisi istologica sia più dispendiosa in termini di tempo e risorse rispetto alle analisi convenzionali, il suo rigore aumenta la probabilità di rilevare nuovi fenotipi in un processo di guarigione delle ferite intrinsecamente complesso.

Introduzione

La guarigione cutanea delle ferite è un processo biologico complesso con fasi di sovrapposizione sequenziale. Richiede la coordinazione di processi cellulari e molecolari che sono regolati in modo temporale e spaziale al fine di ripristinare la funzione barriera dell'epitelio danneggiato. Nella prima fase, infiammazione, neutrofili e macrofagi migrano nella ferita, mobilitando difese locali e sistemiche1. Seguire e sovrapporre la fase infiammatoria è la fase di proliferazione. I fibroblasti iniziano rapidamente a prolifere e migrare nel tessuto di granulazione. I cheratinociti lontano dal bordo d'attacco proliferano direzionale verso la ferita mentre i cheratinociti differenziati nel bordo anteriore migrano per er epitelializzare laferita 2. Infine, inizia la fase di rimodellamento e maturazione, durante la quale i fibroblasti nel tessuto di granulazione iniziano a sintetizzare e depositare collagene. Il rimodellamento e l'organizzazione della nuova matrice possono durare fino a 1 anno dopo l'infortunio3. A causa della complessità degli eventi sovrapposti che coinvolgono il cross-talk tra più tipi di cellule, e nonostante anni di ricerca, molti dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della guarigione delle ferite rimangono poco compresi.

Il modello di topo è il modello di mammifero predominante per lo studio dei meccanismi di guarigione delle ferite a causa della loro facilità d'uso, costo relativamente basso e manipolabilità genetica1,4,5. Sebbene diversi tipi di ferite siano stati descritti nel modello murino, il più comune è una ferita adicisionale (pugno bilaterale o biopsia a pugno diretto), seguita da modelli di ferita incisiva4. Il modello di ferita adicizionale ha un netto vantaggio rispetto al modello incisivo in quanto genera intrinsecamente tessuto di controllo che non ha subito il processo di guarigione. Il tessuto di biopsia del punzone che viene asportato come parte del protocollo chirurgico può essere elaborato allo stesso modo del tessuto ferito e utilizzato per stabilire le condizioni omeostatiche per un criterio desiderato. Il tessuto di controllo delle accise può anche essere utile se si valutano gli effetti di un pretrattamento cutaneo o si conferma un'alterazione genica riuscita al momento dellalesione 4.

I parametri di guarigione possono essere valutati con molte tecniche diverse, tra cui planimetria o istologia. Tuttavia, la planimetria può solo valutare le caratteristiche visibili della ferita, e a causa della presenza di una crosta, spesso non è correlata a misurazioni di guarigione che vengono visualizzate dall'istologia, rendendo così l'istologia il "gold standard" dell'analisi4. Nonostante l'analisi istologica sia il gold standard, viene spesso eseguita su un sottoinsieme arbitrario della ferita6,7. Ad esempio, tagliare la ferita a "metà" prima di incorporare e sessare la ferita è attualmente una pratica comune per ridurre il tempo e le risorse spesi per sezionamento dei materiali e analisi dei dati. Il metodo di analisi morfometrica descritto in questo protocollo è stato sviluppato per comprendere l'intero tessuto della ferita, per riflettere accuratamente le caratteristiche morfologiche della ferita e per aumentare la probabilità di rilevare difetti di guarigione delle ferite con una piccola dimensione dell'effetto. In questo protocollo, dettagliamo un metodo chirurgico per generare la ferita murina più comunemente studiata, la ferita incisiva bilaterale a pieno spessore, nonché un metodo dettagliato e rigoroso per l'analisi istologica che viene usato raramente sul campo.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità con le normative federali e la politica e le procedure dell'Università dell'Iowa sono state approvate dalla IACUC dell'Università dell'Iowa.

1. Animali e allevamento

  1. Usa topi adulti della linea del mouse desiderata a 8-10 settimane di età quando lo stadio del follicolo pilifero è in telogen.
  2. Il giorno dell'intervento chirurgico, separare i topi in gabbie pulite e alloggiare individualmente per ridurre al minimo l'interruzione della ferita.

2. Chirurgia

NOTA: Non è necessario mantenere condizioni chirurgiche sterili. Mentre si dovrebbe fare attenzione a mantenere la sterilità tra gli animali, la biopsia del pugno stesso viene eseguita su una superficie pulita, ma nonsterile. La durata dell'intervento chirurgico per animale è compresa tra 10 e 15 minuti.

  1. Anestesizzazione
    1. Anestetizzare l'animale per 1-2 minuti in una camera di induzione con il vaporizzatore di isoflurane impostato su una portata del 4-5% e il misuratore di flusso di ossigeno impostato a 1 litro al minuto. Vedere Discussione per le opzioni alternative di anestesia.
    2. Confermare l'anestesia corretta prima di iniziare la procedura. La profondità dell'anestesia può essere confermata da un dito fermo.
    3. Trasferire il topo dal contenitore di induzione a un cono nasale e ridurre la portata dell'isoflurane all'1,5% e il misuratore di flusso di ossigeno a 0,5 L/min.
    4. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi poiché la procedura supera i 5 minuti.
    5. Mantenere la normale temperatura corporea utilizzando un cuscinetto termico.
  2. Preparazione del sito della ferita
    1. Utilizzare un clipper rasoio elettrico in un movimento rostrale caudale per rimuovere la pelliccia sul retro del mouse a livello della spalla. Rimuovere i capelli più in basso sulla schiena se necessario se si eseguono più di due ferite.
    2. Rimuovere i capelli rimanenti utilizzando una lama di rasoio in un movimento caudale rostrale tenuto a 20° dalla parte posteriore del mouse per radere da vicino l'area ritagliata (Figura 1A).
    3. Pulire l'area rasata con un tampone povidone-iodio.
    4. Pulire la pelle con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol isopropile al 70% per ridurre la potenziale irritazione cutanea dal tampone di iodio.
  3. Ferendo
    1. Pizzicare la pelle tra le scapole lungo la linea mediana dorsale e allontanare la piega della pelle sandwich dal corpo (Figura 1B).
    2. Posizionare il mouse su un lato con lo skinfold su una superficie piana drappeggiata con un asciugamano pulito a base di carta o equivalente. Utilizzare un foglio di cera dentale sotto l'asciugamano per proteggere la superficie sottostante dai danni (Figura 1C).
    3. Posizionare il punzone di biopsia della dimensione desiderata il più vicino possibile al corpo e lasciare che la pelle si rilassi. Non allungare la pelle o la dimensione della ferita sarà maggiore della dimensione del punzone designata (Figura 1D).
    4. Perforare la pelle premendo verso il basso, è possibile utilizzare un movimento a dondolo per garantire che tutti gli strati della pelle su entrambi i lati siano penetrati (Figura 1E). Usa un nuovo punzone di biopsia per ogni animale.
    5. Rimuovere le biopsie del punzone dalle ferite(Figura 1F). Se ci sono ancora siti di attaccamento utilizzare forbici sterili e pinzette per liberare il pugno dalla pelle circostante. Elaborare il tessuto di controllo della biopsia del punzone come richiesto in base ai piani a valle per le analisi di guarigione delle ferite (vedere Discussione per suggerimenti).
    6. Scatta fotografie macroscopiche da una distanza uguale dai siti della ferita o con un righello nel telaio per misurare l'area iniziale della ferita ed eliminare gli outlier dall'analisi.
    7. Somministrare l'analgesia per un minimo di 24 ore in conformità con un protocollo animale approvato. Ad esempio: Buprenorfina SR-LAB, iniettata come singola dose per via sottocutanea a 0,5-2 mg/kg per 48 ore di sollievo dal dolore (vedere Discussione per suggerimenti e considerazioni alternative).
    8. Monitorare il mouse mentre esce dall'anestesia fino a quando non mantiene una postura eretta e cammina normalmente intorno alla gabbia.

3. Monitoraggio post ferita

  1. Monitorare quotidianamente i topi alla ricerca di endpoint sperimentali come determinato dallo sperimentatore e in conformità e conformità con i protocolli istituzionali. Esempi includono: infezione, perdita di peso visibile o postura intuizioneta.
  2. Scatta fotografie macroscopiche quotidiane in modo controllato come è stato fatto dopo l'intervento chirurgico iniziale.

4. Raccogliere le ferite

  1. Eutanasia dei topi nel momento desiderato dopo il mento in conformità con un protocollo animale approvato.
  2. Scattare fotografie macroscopiche dei siti della ferita in modo controllato coerente con la precedente acquisizione di fotografie(Figura 2A,C).
  3. Tagliare un ampio rettangolo attorno ai siti della ferita utilizzando un bisturi( Figura 2D,E).
  4. Liberare il pezzo rettangolare di tessuto usando forbici e pinzette per sbucciare e tagliare la pelle lontano dal tessuto sottostante(Figura 2F). Mettere in una piastra di Petri(Figura 2G).
  5. Raccogli le ferite. Tagliare fino a 2 mm di tessuto non avvolto che circonda tutti i lati della ferita in forma rettangolare (Figura 2H,I). Vedi Discussione per opzioni alternative per raccogliere la ferita.
  6. Elaborare le ferite come richiesto per studi successivi. Riservare almeno una ferita per topo per l'incorporamento di paraffina e l'analisi istologica.

5. Fissazione e incorporamento delle ferite

  1. Fissare la ferita
    1. Fissare il tessuto della ferita in una soluzione di paraformaldeide al 4% preparata almomento 8 per 3 ore a temperatura ambiente, quindi trasferire a 4 °C durante la notte. La paraformaldeide di grado EM (Electron Microscopy) e la filtrazione della soluzione non sono necessarie.
    2. Lavare le ferite due volte per 30 minuti in 1x PBS.
    3. Sostituire PBS con 70% ETOH e conservare a 4 °C fino all'incorporamento. Elaborare i tessuti entro 24-48 ore per evitare la perdita di antigene o entro 1-2 settimane se si valutano solo le caratteristiche istologiche.
  2. Elaborare e incorporare la ferita
    1. Trasferire ogni ferita in una cassetta di incorporamento. Etichettare l'incorporamento delle cassette a matita in quanto il processo rimuoverà gli inchiostri.
    2. Elaborare il tessuto manualmente o utilizzando un processore automatizzato disidratando il tessuto con percentuali di etanolo crescenti, cancellando con xilene e quindi infiltrandosi nel tessuto con cera di paraffina(tabella 1).
    3. Incorporare la ferita di 90° ("in piedi") dalla superficie orizzontale dello stampo di incorporamento (Figura 3A,B).

6. Analisi dell'area ferita del giorno 0

  1. Scarica il software libero NIH-Image J o NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. Apri un file con una fotografia delle ferite del giorno 0.
  3. Selezionare la casella "Area" in Analizza | Impostare le misure.
  4. Selezionare "Imposta scala" in Analizza. Immettere la distanza in pixel, la distanza corrispondente nota e l'unità della distanza (= unità di lunghezza) se le misurazioni macroscopiche fanno parte dello studio o saltare questo passaggio se sono necessarie solo misurazioni relative.
  5. Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
  6. Delineare il perimetro della ferita.
  7. Fare clic su Misura in Analizza.
  8. Creare un foglio di calcolo per tenere traccia delle misurazioni per animale per ferita.
  9. Copiare la misurazione dell'area della ferita nel foglio di calcolo.
  10. Calcolare l'area media e la deviazione standard di tutte le ferite per un determinato esperimento.
  11. Escludere dall'analisi istologica eventuali ferite al di fuori di due deviazioni standard della media.

7. Sessatura seriale

  1. Raffreddare i blocchi di ferita incorporati nella paraffina a 4 °C durante la notte.
  2. Inserire il blocco di paraffina sul supporto del blocco del microtomo e orientarlo in modo che la lama tagli direttamente sul blocco. Orientare il blocco in modo che il tessuto "si erge" a 90° consentendo la sessatura simultanea dell'epidermide e del derma (Figura 3C,D).
  3. Fare 2-4 nastri di 20-30 sezioni di paraffina di 7 μm ciascuna.
  4. Utilizzare un pennello asciutto e un ago da presa in giro per la dissezione per trasferire ogni nastro su una superficie ferma ma manipolabile come un foglio di plastica nero sodo.
  5. Staccare la sezione superiore di ogni nastro con una lama di rasoio e posizionarlo su uno scivolo al microscopio.
  6. Osservare le sezioni non macchiate al microscopio a campo luminoso per determinare quali contengono tessuto ferito, che può essere identificato dall'assenza di follicolo pilifero, cambiamenti nell'aspetto del tessuto connettivo o dell'epidermide e / o la presenza di una crosta (Figura 4A,B).
  7. Scartare sezioni non arrotondate fino a 20 sezioni prima dell'inizio della ferita.
  8. Se sezione attraverso la ferita ripetendo i passaggi 7.3 e 7.4 fino a quando non viene rilevata alcuna ferita in sezioni non macchiate.

8. Montaggio di sezioni di paraffina

  1. Separare le sezioni di paraffina ogni 5 sezioni con una lama di rasoio, a partire dal primo nastro (Figura 3E).
  2. Il microscopio a etichette scorre sia con il numero di diapositiva che con tutti i numeri di sezione.
  3. Afferrare il gruppo di 5 sezioni con un pennello bagnato e galleggiarle sulla superficie dell'acqua di un bagno d'acqua calda (40-45 °C) per appiattirle.
  4. Selezionare il gruppo di 5 sezioni dal bagno d'acqua utilizzando uno dei vetrini del microscopio etichettati (Figura 3F) e posizionarlo su uno scaldascivolo impostato a 37 °C per un massimo di 24 ore.
  5. Archiviare le diapositive in posizione verticale in una casella di diapositive.

9. Colorazione istologica

  1. Trasferire ogni8° vetrino del microscopio (equivalente a ogni 40th sezione di paraffina) in un rack di colorazione e macchiare con ematossilina ed eosina.

10. Imaging microscopico

  1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di un obiettivo 4x e capacità di acquisizione digitale. Registrare la scala in cui viene scattata l'immagine.
  2. Immagini l'intera ferita della sezione superiore di ogni diapositiva macchiata e assicurati di includere del tessuto non avvolto su entrambi i lati. Scatta più foto sovrapposte se la ferita è più grande della cornice di una singola immagine.
  3. Salvate il file, incluso il numero di sezione per l'analisi morfometrica. Utilizzare il numero di sezione seguito da a, b, c, ecc. per sovrapporre immagini della stessa ferita.

11. Analisi morfometrica

NOTA: quando la ferita si estende su più immagini, sommare le misurazioni effettuate dalle singole immagini per ottenere un valore per metrica per sezione ferita da registrare nel foglio di calcolo.

  1. In Image J, apri un file digitale di un'immagine macchiata della ferita. Non utilizzare immagini cucite per l'analisi. Esegui misurazioni su immagini sovrapposte ingrandite trovando punti di riferimento da lasciare e raccogli le misurazioni da un'immagine all'altra.
  2. Impostare la scala e le preferenze di misurazione.
    1. Selezionare "Imposta scala" in Analizza. Immettere la distanza in pixel, la distanza corrispondente nota e l'unità della distanza (= unità di lunghezza). La scala dovrebbe apparire nella finestra e dovrebbe corrispondere alla scala in cui è stata acquisita l'immagine.
    2. Selezionare la casella "Globale" per mantenere la scala uguale per ogni immagine aperta.
    3. Ripetere i passaggi da 11.2.1 a 11.2.2 ogni volta che l'immagine J viene chiusa e riaperta.
    4. Selezionare la casella "Area" in Analizza | Impostare le misure.
  3. Misurare la lunghezza della ferita
    1. Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
    2. Misurare a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altro lato della ferita (Figura 4A,B).
    3. Traccia lungo l'incrocio dermo-epidermico per raggiungere questi due punti di riferimento. Se l'epidermide non copre l'intera ferita, seguire la giunzione dermo-epidermica su un lato della ferita e dove termina la lingua migrata continua seguendo l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta fino a raggiungere la lingua migratare e infine il primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altra parte(Figura 4E,F).
    4. In Analizzafare clic su Misura. La lunghezza della misurazione apparirà nelle stesse unità impostate nella scala.
    5. Creare un foglio di calcolo per tenere traccia delle misurazioni (Tabella complementare 1).
    6. Copiare la lunghezza della ferita nel foglio di calcolo.
  4. Misurare la lunghezza epidermica
    1. Se l'epidermide copre l'intera ferita, la lunghezza epidermica è la stessa della lunghezza della ferita.
      1. Copiare la misurazione "lunghezza della ferita" nella colonna "lunghezza epidermica" nel foglio di calcolo di Excel e passare al passaggio 11.5.
    2. Se l'epidermide non copre l'intera ferita, selezionare le "selezioni a mano libera" e misurare la distanza tra ogni bordo d'attacco epidermico seguendo l'aspetto superiore del tessuto di granulazione o la giunzione tra il tessuto di granulazione e la crosta fino al primo follicolo pilifero(Figura 4C,D).
      1. In Analizzafare clic su Misura.
      2. Sottrarre questa misurazione dalla lunghezza della ferita e registrare il numero in "lunghezza epidermica" nel foglio di calcolo di Excel.
  5. Misurare l'area della ferita
    1. Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
    2. Misurare a partire dall'ultimo follicolo pilifero del tessuto illeso su un lato della ferita al primo follicolo pilifero del tessuto illeso dall'altra parte della ferita (Figura 4A, B, E,F).
    3. Tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide (non includere la crosta) o l'aspetto superiore del tessuto di granulazione se la ferita non è completamente coperta dall'epidermide.
    4. Continuare a tracciare verticalmente lungo il follicolo pilifero nel tessuto di granulazione una volta raggiunto il follicolo pilifero opposto e fino a raggiungere il tessuto adiposo o il muscolo. Seguire il bordo inferiore del tessuto di granulazione sul lato opposto della ferita e unire il punto di partenza lungo il follicolo pilifero per chiudere l'area (Figura 4E,F).
    5. In Analizzafare clic su Misura.
    6. Copiare l'area della ferita nel foglio di calcolo sotto "area ferita misurata".
  6. Misurare l'area epidermica
    1. Selezionate "Selezioni a mano libera " sullabarra degli strumenti delle Figi.
    2. Se la ferita è completamente epiteliale:
      1. Tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide fino a raggiungere il follicolo pilifero opposto e completare l'area "tornando" al punto di partenza seguendo la giunzione dermo-epidermica tra epidermide e derma(Figura 4D).
      2. In Analizzafare clic su Misura.
      3. Copiare l'area epidermica nel foglio di calcolo di Excel in "area epidermica misurata" e passare al passaggio 11.7.
    3. Se la ferita non è completamente epiteliale:
      1. Tracciare lungo l'aspetto superiore dell'epidermide fino al bordo anteriore e tornare al punto di partenza dopo la giunzione dermo-epidermica (Figura 4C).
      2. In Analizzafare clic su Misura.
      3. Ripetere i gradini 11.6.3.1 e 11.6.3.2 sul lato opposto della ferita.
      4. In Analizza fare clic su Misura.
      5. Sommare i due numeri ottenuti nei passaggi 11.6.3.2 e 11.6.3.4 e inserire il risultato sotto "area epidermica misurata" nel foglio di calcolo.
  7. Ripetere i passaggi da 11.3 a 11.6 ogni 40sezione (ogni8° diapositiva).
  8. Calcola l'area epidermica dell'intera ferita.
    1. Creare una nuova colonna nel foglio di calcolo "area epidermica calcolata" accanto a "lunghezza epidermica".
    2. Moltiplicare il numero per "lunghezza epidermica" per 280 per ogni sezione tranne l'ultima (sezione spessa 7 μm x 40 sezioni).
    3. Moltiplicare il numero per "lunghezza epidermica" per 7 per l'ultima sezione (spessore della sezione).
    4. Sommare il valore dell'"area epidermica calcolata" per ogni sezione per ottenere l'area epidermica dell'intera ferita.
  9. Calcola l'area della ferita dell'intera ferita.
    1. Ripetere i passaggi da 11.8.1 a 11.8.4 utilizzando le misurazioni della lunghezza della ferita.
  10. Calcola il volume epidermico dell'intera ferita.
    1. Ripetere i passaggi da 11.8.1 a 11.8.4 utilizzando le misure "area epidermica misurata".
  11. Calcola il volume della ferita dell'intera ferita.
    1. Ripetere i passaggi da 11.8.1 a 11.8.4 utilizzando le misure "area ferita misurata".
  12. Calcola la percentuale di volume epidermico nella ferita.
    1. Dividere il volume epidermico totale per il volume totale della ferita e moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale (non fare questo rapporto per ogni sezione).
  13. Calcola la percentuale di area epidermica tra l'area della ferita.
    1. Dividere l'area epidermica totale per l'area totale della ferita e moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale. Se una ferita è completamente epiteliale, questo numero dovrebbe essere 100.

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Risultati

La figura 5 descrive l'intervallo in valori misurati e calcolati ottenuti eseguendo analisi morfometriche su ferite di tipo selvaggio generate in diversi ceppi di topi da più chirurghi e analizzate da diversi individui. Topi di tipo selvatico di diversi ceppi possono mostrare differenze statistiche come descritto sia nei nostri studi che nellaletteratura 9,10. Sulla base di questi risultati rappresentativi, raccomandiamo che, all'int...

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Discussione

Il modello bilaterale di ferita accisa è una procedura altamente personalizzabile che può essere utilizzata per studiare molti aspetti diversi della guarigione delle ferite. Prima di iniziare un progetto di guarigione delle ferite, gli investigatori devono eseguire un'analisi del potere per determinare il numero di ferite necessarie per rilevare un difetto di una particolare dimensione dell'effetto. Esistono incongruenze all'interno della letteratura sul fatto che singoli topi o ferite debbano essere usati come repliche ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Siamo grati a tutti i membri del Dunnwald Lab che hanno contribuito all'ottimizzazione di questo protocollo nel corso degli anni, e a Gina Schatteman la cui persistenza nel promuovere l'uso del sezionale seriale per l'analisi delle ferite ne ha reso possibile la creazione. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti da NIH /NIAMS a Martine Dunnwald (AR067739).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100% etanolo
70% etanolo
80% etanolo
95%
Alcohol PrepNOVAPLUSV910070% Alcool isopropilico, sterile
Idrossido
Piastre per biopsiaCellpath22-222-012
FoglioQualcosa di solido ma manipolabile delle dimensioni di un foglio di carta
MicroscopioCon capacità di acquisizione digitale e un obiettivo 4X
Applicatori con punta in
Vetrini coprioggetti22 x 60 #1
Fogli
di cera dentaleFotocameraInclude un righello per la scala, se applicabile
Ago per dissezione (dritto)
Stampi per22 x 22 x 12 Anelli
inclusioneSimport Scientific Inc.M460
Eosina Y
Acido
Tagliacapelli
Cuscinetto riscaldanteConairUmido secco Cuscinetto riscaldante
Ematossilina
Microtomo
Pennelli Paraffina
Tipo 6
Paraformaldeide
Permount
Soluzione tampone fosfato (PBS)
Povidone-iodioAplicare82-255
Cassetta di lavorazioneSimport Scientific Inc.M490-2
ASR.009
bisturi per impieghi regolari #10
per bisturi
Forbicisterili per chirurgia
PunzoniDimensioni determinate dal ricercatore
Scatole
Scaldavetrini
Vetrini per microscopio superfrostedFisher Scientific22 037 246
Bagno
Stazione di inclusioneMinimo di un dispenser di paraffina e di una piastra fredda
Processatoredi tessuti Minimo di un forno con pompa a vuoto
Triplo antibiotico pinzetta per unguento
, puntasterile per chirurgia
, pinzettasterile per chirurgia
WypAll X60Kimberly-Clark34865
di ammonio di plastica nera a campo chiaro cotone digitale inclusione per acetico glacialeLame per microtomoLame di rasoio Lame per Manico chirurgiche affilate per biopsia cutanea per vetrinid'acqua per il controllo della temperatura dei tessuti oftalmico curva conica

Riferimenti

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