Questo protocollo fornisce metodi per la visualizzazione delle cellule batteriche e del polisaccaride del locus di sintesi dei polisaccaridi (Psl) all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica.
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Articolo metodologico
Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diagnosi precoce e l'eradicazione di Pseudomonas aeruginosa nei polmoni dei pazienti affetti da fibrosi cistica possono ridurre la possibilità di sviluppare un'infezione cronica. Lo sviluppo di infezioni croniche da P. aeruginosa è associato a un declino della funzione polmonare e a un aumento della morbilità. Pertanto, c'è un grande interesse a chiarire le ragioni della mancata eradicazione di P. aeruginosa con la terapia antibiotica che si verifica in circa il 10-40% dei pazienti pediatrici. Uno dei molti fattori che possono influenzare la clearance dell'ospite di P. aeruginosa e la suscettibilità agli antibiotici sono le variazioni nell'organizzazione spaziale (come l'aggregazione o la formazione di biofilm) e nella produzione di polisaccaridi. Pertanto, eravamo interessati a visualizzare le caratteristiche in situ di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti con FC. Una tecnica di pulizia dei tessuti è stata applicata ai campioni di espettorato dopo aver incorporato i campioni in una matrice di idrogel per mantenere le strutture 3D relative alle cellule ospiti. Dopo la pulizia dei tessuti, sono state aggiunte etichette fluorescenti e coloranti per consentire la visualizzazione. L'ibridazione fluorescente in situ è stata eseguita per la visualizzazione di cellule batteriche, il legame di anticorpi anti-Psl marcati in modo fluorescente per la visualizzazione dell'esopolisaccaride e la colorazione DAPI per colorare le cellule ospiti per ottenere informazioni strutturali. Questi metodi hanno permesso l'imaging ad alta risoluzione di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da FC tramite microscopia confocale a scansione laser.
Introduzione
In questo studio, gli esperimenti sono stati progettati per visualizzare la struttura in vivo di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti pediatrici affetti da fibrosi cistica (FC). Le infezioni da P. aeruginosa diventano croniche nel 30-40% della popolazione pediatrica FC; Una volta che le infezioni croniche si sono stabilite, sono quasi impossibili da eliminare1. Gli isolati di P. aeruginosa provenienti da pazienti con infezione precoce sono generalmente più suscettibili agli antimicrobici, pertanto vengono trattati con antibiotici anti-pseudomonali per prevenire l'instaurarsi di infezioni cro....
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Protocollo
Per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani è necessaria l'approvazione del Research Ethics Board (REB). Gli studi qui presentati sono stati approvati dall'Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Raccolta dell'espettorato
- Conservare l'espettorato espettorato in una coppetta sterile e conservare immediatamente a 4 °C per un massimo di 24 ore prima della fissazione.
NOTA: Lasciare l'espettorato troppo a lungo a 4 °C senza fissazione può portare alla degradazione cellulare, in particolare alla degradazione dei globuli bianchi. È preferibile fissarlo il prima possibile. - Trasferire i campio....
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Risultati
Il disegno generale dell'esperimento è riassunto nella Figura 1 e nella Figura 2. La Figura 1 fornisce un riepilogo dei protocolli di elaborazione e di eliminazione dell'espettorato. L'elaborazione e la rimozione dell'espettorato possono richiedere fino a 17 giorni. Tuttavia, il protocollo può essere interrotto e i campioni possono essere conservati dopo la fissazione con PFA (giorno 2) o dopo la pulizia dei tessuti (giorni 5-17 a s.......
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Discussione
Lo scopo di questo protocollo è quello di consentire uno sguardo sull'organizzazione in situ delle cellule di P. aeruginosa nell'espettorato di pazienti con fibrosi cistica. I campioni di espettorato devono essere conservati a 4 °C fino al momento dell'elaborazione, se non possono essere fissati immediatamente. È stato dimostrato che il numero di cellule di P. aeruginosa nell'espettorato non cambia in modo significativo se processato a 1 ora, 24 ore o 48 ore, se conservato a 4 °C, anche se lasciato a 25.......
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Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la Cystic Fibrosis Foundation che ha finanziato questa ricerca e MedImmune per la loro generosa donazione di anticorpi anti-Psl0096. Per questo studio l'imaging è stato eseguito presso la struttura di imaging CAMiLoD dell'Università di Toronto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 29:1 acrilammide bisacrilammide, soluzione al 30 % | BioRad | 161-0146 | |
| Vetro di copertura a 8 camere Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Camere di perfusione Coverwell | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnasi Inibitore | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Dettagli dell'ordine: Prodotto: DNA Oligo modificato; Nome: PseaerA; Sequenza: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Sintesi: 50 nmol; Depurazione: HPLC; Stato di spedizione: Resa completa (secco) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Gli anticorpi rossi Psl0096-Texas sono stati gentilmente forniti da Medimmune e l'azienda deve essere contattata per richieste di ordine. | |
| VA-044 Indurente | Wako | 27776-21-21 |
Riferimenti
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
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Ristampe e permessi
