Lo scopo di questo protocollo è quello di indagare l'evoluzione e l'espressione dei geni candidati utilizzando i dati di sequenziamento dell'RNA.
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Articolo metodologico
Una pipeline bioinformatica per lo studio dell'evoluzione molecolare e dell'espressione genica usando RNA-seq
In questo articolo
Sommario
Abstract
Distillare e segnalare set di dati di grandi dimensioni, come i dati sull'intero genoma o sul trascrittame, è spesso un compito scoraggiante. Un modo per abbattere i risultati è concentrarsi su una o più famiglie geniche che sono significative per l'organismo e lo studio. In questo protocollo, delineamo i passaggi bioinformatici per generare una filogenesi e quantificare l'espressione dei geni di interesse. Gli alberi filogenetici possono dare un'idea di come i geni si stanno evolvendo all'interno e tra le specie e rivelare l'ortografia. Questi risultati possono essere migliorati utilizzando i dati RNA-seq per confrontare l'espressione di questi geni in diversi individui o tessuti. Studi sull'evoluzione molecolare e sull'espressione possono rivelare modi di evoluzione e conservazione della funzione genica tra le specie. La caratterizzazione di una famiglia genica può servire come trampolino di lancio per studi futuri e può evidenziare un'importante famiglia genica in un nuovo genoma o carta del trascrittame.
Introduzione
I progressi nelle tecnologie di sequenziamento hanno facilitato il sequenziamento di genomi e trascrittimi di organismi non modello. Oltre alla maggiore fattibilità del sequenziamento di DNA e RNA da molti organismi, è disponibile al pubblico un'abbondanza di dati per studiare i geni di interesse. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire misure bioinformatiche per indagare l'evoluzione molecolare e l'espressione di geni che possono svolgere un ruolo importante nell'organismo di interesse.
Studiare l'evoluzione di un gene o di una famiglia genica può fornire informazioni sull'evoluzione dei sistemi biologici. I membri di una famigli....
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali uc irvine.
1. Preparazione della libreria RNA-seq
- Isolare l'RNA utilizzando i seguenti metodi.
- Raccogliere campioni. Se l'RNA deve essere estratto in un secondo momento, flash congelare il campione o posizionare nella soluzione distoccaggio dell'RNA 15 (Tabella dei materiali).
- Eutanasia e sezionare l'organismo per separare i tessuti di interesse.
- Estrarre l'RNA totale utilizzando un kit di estrazione e purificare l'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA(Table of Materials)
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Risultati
I metodi di cui sopra sono riassunti nella figura 1 e sono stati applicati a un insieme di dati di tessuti Hydra vulgaris. H. vulgaris è un invertebrato di acqua dolce che appartiene al phylum Cnidaria che comprende anche coralli, meduse e anemoni di mare. H. vulgaris può riprodursi asessualmente germogliando e possono rigenerare la testa e il piede quando vengono bisessuali. In questo studio, abbiamo mirato a indagare l'evoluzione e l'espressione dei geni.......
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Discussione
Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una descrizione dei passaggi per caratterizzare una famiglia genica utilizzando i dati RNA-seq. Questi metodi hanno dimostrato di funzionare per una varietà di specie e set di dati4,34,35. Il gasdotto qui stabilito è stato semplificato e dovrebbe essere abbastanza facile da essere seguito da un principiante della bioinformatica. Il significato del protocollo è che delinea tutti i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad e Aline G. Rangel per i consigli e le indicazioni nell'incorporare alcuni di questi passaggi nel nostro flusso di lavoro. Siamo anche grati a Katherine Williams, Elisabeth Rebboah e Natasha Picciani per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di studio della George E. Hewitt Foundation for Medical research presso A.M.M.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit bioanalizzatore-DNA | Agilent | 5067-4626 | materiali da laboratorio umidi |
| bioanalizzatore-RNA | Agilent | 5067-1513 | materiali da laboratorio umidi |
| BLAST+ v. 2.8.1 | Su cluster di computer* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ | ||
| Blast2GO (sul tuo PC) | Su computer locale https://www.blast2go.com/b2g-register-basic | ||
| boost v. 1.57.0 | Su cluster di computer | ||
| Bowtie v. 1.0.0 | Su cluster di computer https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ | ||
| Cluster di calcolo (altamente consigliato) | NOTA: Le analisi dei dati genomici vengono eseguite al meglio su un cluster di calcolo ad alte prestazioni perché i file sono molto grandi. | ||
| Gemelli v. 2.2.1 | Sul cluster di computer | ||
| edgeR v. 3.26.8 (in R) | In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | ||
| gcc v. 6.4.0 | Sul cluster di computer | ||
| Java v. 11.0.2 | Sul cluster di computer | ||
| MEGA7 (sul tuo PC) | Sul computer locale https://www.megasoftware.net | ||
| MEGAX v. 0.1 | Su computer locale https://www.megasoftware.net | ||
| Kit NucleoSpin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.5 | Materiali di laboratorio umidi |
| Perl 5.30.3 | Su cluster di computer | ||
| Python | Su cluster di computer | ||
| Qubit 2.0 Fluorimetro | ThermoFisher | Q32866 | materiali da laboratorio umidi |
| R v.4.0.0 | su cluster di computer https://cran.r-project.org/src/base/R-4/ | ||
| RNAlater | ThermoFisher | AM7021 | materiali da laboratorio umidi |
| Kit RNeasy Kit | Qiagen | 74104 | materiali da laboratorio umidi |
| RSEM v. 1.3.0 | Software per computer https://deweylab.github.io/RSEM/ | ||
| RStudio v. 1.2.1335 | Su computer locale https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download | ||
| Samtools v. 1.3 | Software per computer | ||
| SRA Toolkit v. 2.8.1 | Su cluster di computer https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit | ||
| STAR v. 2.6.0c | Su cluster di computer https://github.com/alexdobin/STAR | ||
| StringTie v. 1.3.4d | Su cluster di computer https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ | ||
| Transdecoder v. 5.5.0 | Su cluster di computer https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases | ||
| Trimmomatic v. 0.35 | Su cluster di computer http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Trinity v.2.8.5 | Su cluster di computer https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | materiali di laboratorio umidi |
| Kit di preparazione della libreria di RNA TruSeq v2 | Illumina | RS-122-2001 | materiali di laboratorio umidi |
| TURBO Kit senza DNA | ThermoFisher | AM1907 | materiali |
| di laboratorio bagnati | |||
| *Il download e l'installazione sul cluster di computer possono richiedere l'accesso root. Contattare l'amministratore di rete. |
Riferimenti
- Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
- Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene ortholo....
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Ristampe e permessi
