Qui, descriviamo un metodo semplice, economico e veloce per risolvere la struttura 3D del tessuto adiposo bianco e topo umano utilizzando una combinazione di marcatori per visualizzare vascolatura, nuclei, cellule immunitarie, neuroni e proteine del mantello di goccia lipidi mediante imaging fluorescente.
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Articolo metodologico
Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obesità è un importante problema di salute pubblica a livello mondiale che aumenta il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2 e malattie del fegato. L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa del tessuto adiposo (AT) a causa dell'iperplasia adipocita e/o dell'ipertrofia, che porta a una profonda ristrutturazione della sua struttura tridimensionale. Infatti, la massima capacità di AT di espandersi durante l'obesità è fondamentale per lo sviluppo di patologie associate all'obesità. Questa espansione AT è un importante meccanismo omeostatico per consentire l'adattamento a un eccesso di assunzione di energia e per evitare la fuoriuscita di lipidi deleteri ad altri organi metabolici, come il muscolo e il fegato. Pertanto, comprendere il rimodellamento strutturale che porta al fallimento dell'espansione AT è una questione fondamentale con un'elevata applicabilità clinica. In questo articolo, descriviamo un metodo di compensazione semplice e veloce che viene regolarmente utilizzato nel nostro laboratorio per esplorare la morfologia del topo e del tessuto adiposo bianco umano mediante imaging fluorescente. Questo metodo di compensazione AT ottimizzato è facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio standard dotato di una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio fluorescente. Inoltre, i composti chimici utilizzati sono prontamente disponibili. È importante sottolineare che questo metodo consente di risolvere la struttura 3D AT colorando vari marcatori per visualizzare specificamente gli adidociti, le reti neuronali e vascolari e la distribuzione innata e adattiva delle cellule immunitarie.
Introduzione
L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa dei tessuti adiposa ed è diventata un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo, dato che le persone con obesità hanno aumentato il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2, malattie epatiche e alcuni tumori.
Una funzione fisiologica fondamentale del tessuto adiposo è quella di modulare il glucosio di tutto il corpo e l'omeostasilipido 1,2. Durante il periodo di alimentazione, gli adipociti (cioè le cellule principali del tessuto adiposo) immagazzinano l'eccesso di glucosio e lipidi forniti ....
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Protocollo
Questo protocollo è stato testato ed è convalidato per tutti i depositi di tessuto adiposo bianco e topo umano. I tessuti adiposo umano e topo sono stati raccolti di conseguenza alle leggi europee e approvati dai comitati etici francesi e svedesi.
1. Fissazione del tessuto adiposo bianco e topo umano
- Immergere il topo raccolto o i tessuti adiposa bianchi umani in almeno 10 mL di PBS contenenti 4% di paraformaldeide (PFA) in un tubo di plastica da 15 mL.
- Agitare il tubo di plastica a temperatura ambiente su una piastra di rotolamento per 1 h.
- Lasciare il tubo di plastica a 4 gradi centigradi su una piastra di ro....
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Risultati
Utilizzando la procedura descritta di seguito e riepilogata nella Figura 1, siamo stati in grado di macchiare e cancellare otticamente il tessuto adiposo bianco e umano, come illustrato nella Figura 2A e nella Figura 2B, rispettivamente. Il tessuto eliminato è stato trasferito alla camera di imaging metallico per eseguire l'imaging confocale (Figura 3A). La compensazione ha migliorato drasticamente la p.......
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Discussione
Le modifiche che si verificano all'interno del tessuto adiposo nel corso della progressione patologica, come quella dell'obesità, sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi alla base della patologia. Studi pionieristici che hanno rivelato tali meccanismi nel tessuto adiposo sono stati basati su approcci globali come la proteomica del tessuto adiposointero 21, la citometria di flusso22,23e la trascrittomica24
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da INSERM, Università della Costa Azzurra, e con sovvenzioni dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso gli investimenti per il futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), il programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) tramite Academy 2 "Systèmes Complexes" e Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical ('quipe FRM DEQ201839587), e il Programma Giovani Investigatori a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-(ANSA) - EREARON. Ringraziamo anche l'Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, e che è supportato anche dalla piattaforma IBISA M....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microprovette da 1,5 mL | Provette Eppendorff - Dutscher | 33528 | |
| Provette in plastica da 15 mL | Provette Falcon - Dutscher | 352096 | |
| Vetrino coprioggetti rotondo in vetro da 18 mm | Mariendfeld | 0117580 | |
| Flacone in vetro da 20 mL | Anticorpo | 986546 | |
| anti-topo-alexa647 | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Diluizione: 1/100 |
| anticorpo coniugato anti-coniglio-alexa647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Diluizione: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE anticorpo | Biolegend | BLE145703 | Diluizione: 1/100 |
| CD31 anticorpo | AbCam | ab215912 | Diluizione: 1/50 |
| Software di analisi 3D commerciale - Strumento | IMARIS Oxford | con modulo cellulare | |
| Microscopio confocale - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Concentrazione di riserva: 5 mg/mL; diluizione 1/1000 |
| Deossicolato | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 anticorpo | Santa Cruz | sc-53566 | Diluizione: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Concentrazione di riserva: 2 µ g/µ L; Iniezione endovenosa: 50 & micro; L/topi |
| Camera di imaging metallica dotata di fondo in vetro - Camera AttoFluor | Thermofisher | A7816 | |
| Salicilato di metile | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Anticorpo perilipina | Progen | 651156 | Diluizione: 1/50 |
| Falloidina-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Diluizione: 1/100 |
| TCR | -β-PBBiolegend | BLE109225 | Diluizione: 1/100 |
| TH anticorpo | AbCam | ab112 | Diluizione: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
Riferimenti
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E.
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Ristampe e permessi
