Articolo metodologico

Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D

DOI:

10.3791/61640

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19 agosto 2020

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1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un metodo semplice, economico e veloce per risolvere la struttura 3D del tessuto adiposo bianco e topo umano utilizzando una combinazione di marcatori per visualizzare vascolatura, nuclei, cellule immunitarie, neuroni e proteine del mantello di goccia lipidi mediante imaging fluorescente.

Abstract

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L'obesità è un importante problema di salute pubblica a livello mondiale che aumenta il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2 e malattie del fegato. L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa del tessuto adiposo (AT) a causa dell'iperplasia adipocita e/o dell'ipertrofia, che porta a una profonda ristrutturazione della sua struttura tridimensionale. Infatti, la massima capacità di AT di espandersi durante l'obesità è fondamentale per lo sviluppo di patologie associate all'obesità. Questa espansione AT è un importante meccanismo omeostatico per consentire l'adattamento a un eccesso di assunzione di energia e per evitare la fuoriuscita di lipidi deleteri ad altri organi metabolici, come il muscolo e il fegato. Pertanto, comprendere il rimodellamento strutturale che porta al fallimento dell'espansione AT è una questione fondamentale con un'elevata applicabilità clinica. In questo articolo, descriviamo un metodo di compensazione semplice e veloce che viene regolarmente utilizzato nel nostro laboratorio per esplorare la morfologia del topo e del tessuto adiposo bianco umano mediante imaging fluorescente. Questo metodo di compensazione AT ottimizzato è facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio standard dotato di una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio fluorescente. Inoltre, i composti chimici utilizzati sono prontamente disponibili. È importante sottolineare che questo metodo consente di risolvere la struttura 3D AT colorando vari marcatori per visualizzare specificamente gli adidociti, le reti neuronali e vascolari e la distribuzione innata e adattiva delle cellule immunitarie.

Introduzione

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L'obesità è caratterizzata da un aumento della massa dei tessuti adiposa ed è diventata un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo, dato che le persone con obesità hanno aumentato il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2, malattie epatiche e alcuni tumori.

Una funzione fisiologica fondamentale del tessuto adiposo è quella di modulare il glucosio di tutto il corpo e l'omeostasilipido 1,2. Durante il periodo di alimentazione, gli adipociti (cioè le cellule principali del tessuto adiposo) immagazzinano l'eccesso di glucosio e lipidi forniti da un pasto in trigliceridi. Durante il digiuno, gli adipociti scomporsino i trigliceridi in acidi grassi non esterificati e glicerolo per sostenere la domanda di energia del corpo. Durante lo sviluppo dell'obesità, il tessuto adiposo si espande aumentando le dimensioni (ipertrofia) e/o il numero (iperplasia) degli adipociti1, per aumentare la loro capacità di stoccaggio. Quando l'espansione del tessuto adiposo raggiunge il suo limite, una costante altamente variabile tra i pazienti, i lipidi rimanenti si accumulano in altri organi metabolici tra cui muscoli efegato 3,4, portando al loro fallimento funzionale e avviando complicazioni cardio-metaboliche legate all'obesità1,5. Pertanto, identificare i meccanismi che regolano l'espansione del tessuto adiposo è una sfida clinica chiave.

Le modifiche morfologiche documentate all'interno dei tessuti adiposo durante l'obesità sono legate alla sua disfunzione patologica. Diverse procedure di colorazione sono state utilizzate per descrivere l'organizzazione dei tessuti del tessuto adiposo, tra cui actin6, marcatori vascolari7, marcatori lipidico-droplet8e specifici marcatori di cellule immunitarie9,10. Tuttavia, a causa dell'enorme diametro degli adipociti (da 50 a 200 m)11, è essenziale analizzare gran parte dell'intero tessuto in tre dimensioni al fine di analizzare con precisione i drammatici cambiamenti strutturali di AT osservati durante l'obesità. Tuttavia, poiché la luce non penetra in un tessuto opaco, l'imaging in 3D all'interno di un grande campione di tessuto utilizzando la microscopia a fluorescenza non è possibile. I metodi di compensazione dei tessuti per renderli trasparenti sono stati riportati nella letteratura (per una revisione,vedi 12) che consente di eliminare i tessuti e di eseguire una microscopia a fluorescenza dell'intero tessuto in profondità. Questi metodi offrono opportunità senza precedenti per valutare l'organizzazione cellulare 3D in tessuti sani e mationali. Ciascuno dei metodi descritti presenta vantaggi e svantaggi e pertanto deve essere selezionato attentamente a seconda del tessuto studiato (per una revisione, vedere13). Infatti, alcuni approcci richiedono un lungo periodo di incubazione e/o l'uso di materiali o composti che sono costosi, tossici o difficili daottenere 14,15,16,17,18,19. Approfittando di uno dei primi composti utilizzati un secolo fa da Werner Spalteholz per ripulire i tessuti20, abbiamo istituito un protocollo user-friendly ed economico che è molto ben adattato per la pulizia di tutti i depositi di topi e tessuti adiposo umani in qualsiasi laboratorio con attrezzature tipiche tra cui una cappa chimica, uno shaker orbitale a temperatura controllata e un microscopio confocale.

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Protocollo

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Questo protocollo è stato testato ed è convalidato per tutti i depositi di tessuto adiposo bianco e topo umano. I tessuti adiposo umano e topo sono stati raccolti di conseguenza alle leggi europee e approvati dai comitati etici francesi e svedesi.

1. Fissazione del tessuto adiposo bianco e topo umano

  1. Immergere il topo raccolto o i tessuti adiposa bianchi umani in almeno 10 mL di PBS contenenti 4% di paraformaldeide (PFA) in un tubo di plastica da 15 mL.
  2. Agitare il tubo di plastica a temperatura ambiente su una piastra di rotolamento per 1 h.
  3. Lasciare il tubo di plastica a 4 gradi centigradi su una piastra di rotolamento durante la notte, per completare la fissazione.
    NOTA: Questo protocollo è adattato per grandi campioni di tessuto adiposo, come tamponi di grasso epidididimal interi ottenuti da topi alimentati da una dieta normale (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Per campioni più grandi come tamponi di grasso epididymal ottenuti da topi alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi (≈1,5 g - ≈4 cm3) o campioni di tessuto adiposo umano, anche se il protocollo di compensazione dovrebbe funzionare perfettamente per l'intero campione (aumentando il PFA e le miscele di anticorpi), in generale, tagliamo pezzi di tessuto intorno a 1 g (≈2,5 cm3) per riservare i campioni rimanenti sia per ulteriori colorazione o applicazioni. Per il PFA (punto 1.1.) si consiglia di utilizzare circa 10 volte il volume del tessuto. Per le miscele anticorpale (punti 3.1. e 3.4.), aumentare il volume per immergere completamente il tessuto e utilizzare un tubo di plastica da 15 mL (vedi Tabella dei materiali) se il tessuto è troppo grande per un microtubo di plastica da 1,5 mL (vedi Tabella dei materiali).

2. Permeabilizzazione e saturazione del tessuto adiposo bianco e topo umano

  1. Sciacquare il tessuto adiposo bianco fisso in 10 mL di PBS per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere tutte le tracce di PFA.
  2. Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con glicina dello 0,3% (vedi Tabella dei materiali)e agitare il tubo a temperatura ambiente in uno shaker orbitale per 1 h a 100 giri al minuto (rpm) per placare i restanti gruppi di aldeidi liberi.
  3. Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100 (vedi Tabella dei Materiali)e agitare il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata per 2 h a 100 giri/min.
  4. Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100 e 20% DMSO (vedi Tabella dei Materiali)e agitare il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min durante la notte.
  5. Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,1% Tween-20 (vedi Tabella dei materiali),0,1% Tritone X-100, 0,1% deossicholate (vedi Tabella dei materiali) e 20% DMSO e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per almeno 24 h.
  6. Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100 e agitare il tubo a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 1 h.
  7. Immergere il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA (vedi Tabella dei Materiali) e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 12 h, per saturare qualsiasi sito che potrebbe non legare specificamente gli anticorpi.
    NOTA: Al punto 2.7, il BSA può essere sostituito dal siero sanguigno delle specie dell'anticorpo secondario utilizzato.

3. Procedura di colorazione per il topo e il tessuto adiposo bianco umano

  1. Trasferire il tessuto in un microtubo di plastica da 1,5 mL contenente 300 L di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e anticorpi primari (10 volte più concentrati rispetto alla colorazione della criosezione, ma la concentrazione ottimale degli anticorpi deve essere valutata per ogni anticorpo). Proteggere il tubo dalla luce coprendo con un foglio di alluminio e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per almeno due giorni (vedere la nota al punto 1.1 e al punto 3.7.1).
  2. Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agitare il tubo protetto dalla luce a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 5 h. Eseguire questo passaggio due volte.
  3. Risciacquare il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e scuotere il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri per una notte o due giorni.
  4. Trasferire il tessuto in un microtubo di plastica da 1,5 mL contenente 300 L di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA e anticorpi secondari (10 volte più concentrati rispetto alla colorazione della criosezione). Proteggere il tubo dalla luce coprendo con un foglio di alluminio e scuotere il tubo a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per almeno due giorni (vedere la nota al punto 1.1 e al punto 3.7.1).
  5. Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agitare il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 5 h. Eseguire questo passaggio due volte.
  6. Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di PBS integrato con 0,2% Triton X-100, 10% DMSO e 3% BSA e agitare il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per una notte o due giorni.
  7. Sciacquare il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di PBS e agitare il tubo, protetto dalla luce, a 37 gradi centigradi in uno shaker orbitale a temperatura controllata a 100 giri/min per 2 h.
    NOTA: per l'etichettatura di strutture specifiche come nuclei o actin, aggiungere al punto 3.1 la licazione (DAPI o equivalente) e/o il phalloidin etichettato in fluorescente. quando vengono utilizzati solo anticorpi primari etichettati in modo fluorescente, o al punto 3.4. quando vengono utilizzati anticorpi secondari.
    NOTA: Per la procedura di colorazione, possono essere utilizzati anticorpi primari già coniugati con fluorocromi (come quelli utilizzati per la citometria di flusso) e lo consigliamo per il guadagno di tempo e specificità. Infatti, anche se gli anticorpi primari del topo possono essere utilizzati seguiti da anticorpi anti-topo secondari, come lo abbiamo dimostrato qui, abbiamo spesso osservato una colorazione non specifica dei vasi sanguigni a causa dell'immunoglobulina circolante. Pertanto, per evitare questo problema, gli anticorpi primari che sono già etichettati sono altamente raccomandati e qui forniamo la prova che gli anticorpi utilizzati nella citometria di flusso sono compatibili con la nostra procedura. Tuttavia, nel caso specifico di un antigene espresso a bassi livelli, è obbligatorio un passaggio di amplificazione del segnale tramite anticorpi secondari; quando l'unico anticorpo primario disponibile è fatto nel topo, una perfusione cardiaca dei topi con PBS per almeno 5 minuti al sacrificio può rimuovere una grande percentuale di immunoglobulina circolante e quindi la colorazione non specifica.

4. Procedura di compensazione per il topo e il tessuto adiposo bianco umano

  1. Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di etanolo del 50% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
  2. Immergere il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di etanolo del 70% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
  3. Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di etanolo del 95% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
  4. Immergere il tessuto in un tubo di plastica da 15 mL contenente 10 mL di etanolo al 100% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min per 2 h.
  5. Immergere il tessuto in un tubo di plastica di 15 mL contenente 10 mL di etanolo al 100% e agitare il tubo, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 giri/min durante la notte.
  6. Immergere il tessuto in una bottiglia di vetro da 20 mL con un tappo di plastica (vedi tavolo di materiali) contenente 5 mL di salicilato metile (vedi Tabella dei materiali) sotto una cappa chimica e agitare il contenitore di vetro, protetto dalla luce, a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 100 rpm per almeno 2 h.
    NOTA: La procedura di compensazione potrebbe essere notevolmente accelerata (se necessario) evitando i punti 4.3. e 4,5,, anche se la qualità finale di compensazione sarebbe leggermente ridotta.

5.3D-confocale del tessuto adiposo bianco eliminato

  1. Trasferire il tessuto in una camera di imaging metallico dotata di fondo di vetro (vedi Tabella dei Materiali) sotto un cappuccio chimico e riempire la camera con salicilato metilo fresco.
    NOTA: Per fissare il tessuto in posizione, e quindi per evitare che esso fluttua o si muove lateralmente nella camera, applicare più coperture di vetro rotondo da 18 mm (vedi Tabella dei materiali) sulla parte superiore del tessuto quando lo si monta nella camera.
  2. Posizionare la camera di imaging su un microscopio confocale invertito.
  3. Immagine del tessuto utilizzando un obiettivo di basso ingrandimento (ad esempio, obiettivo 4x) per generare qualche cm3D mappe dell'intero tessuto adiposo o del campione di tessuto umano.
  4. Selezionare diverse aree per il campionamento del tessuto con un ingrandimento più elevato. In genere, utilizzare un obiettivo di aria lunga distanza 20 volte superiore che fornisce un buon rapporto tra risoluzione e profondità. Acquisiamo grandi immagini a mosaico con stack z tra 600 e 2000 m di profondità.
    NOTA: Utilizzare un obiettivo a lunga distanza per visualizzare più in profondità nel tessuto.

6. Estrazione dei risultati quantitativi dalle immagini del tessuto adiposo 3D

NOTA: la segmentazione delle diverse strutture e la successiva estrazione delle informazioni quantitative dallo stack di immagini 3D generate nel punto 5 possono essere eseguite utilizzando una qualsiasi delle molte opzioni software di analisi delle immagini esistenti, sia commerciali che freeware. Nei punti seguenti, descriviamo una strategia che viene regolarmente utilizzata nel nostro laboratorio per estrarre informazioni quantitative da immagini di tessuto adiposo 3D utilizzando un software commerciale (vedi Tabella dei materiali).

  1. Convertire le pile 3D nel formato software per liberare spazio di memoria.
  2. Segmentare le celle.
    1. Aprire il modulo Cell del software.
    2. Modificare l'impostazione Rilevamento celle in colorazione membrana plasmatica.
    3. Scegliere il canale fluorescente del marcatore utilizzato per delineare la periferia cellulare (phalloidin che etichetta l'actina corticale o i marcatori di membrana plasmatica come F4/80 per il macrofago, TCR-β per le cellule T o un cluster di proteine CD di differenziazione specifiche per i sottotipi di cellule immunitarie).
    4. Impostare le soglie e fornire un intervallo di dimensioni di cella previste (ad esempio, da 1 a 200 m per il rilevamento delle cellule).
    5. Eseguire la segmentazione. Un volume corrispondente allo z-stack verrà generato con le celle segmentate codificate a colori con un colore diverso per ciascuna delle celle vicine.
    6. Applicare filtri statistici (dimensioni, rotondità, circolarità, ecc.) nella scheda statistica per escludere gli artefatti di segmentazione e/o per rifinire le celle segmentate alla cella di interesse in base alle loro dimensioni (cioè, 20-200 m per gli adidociti; 5-25 m per i macrofagi; 1-3 m per i linfociti).
    7. Estrarre le misurazioni e i dati quantitativi (volume, numero, dimensioni, diametro, ecc.) dalla scheda delle statistiche.
  3. Segmentare i componenti cellulari (nuclei, vesicles, ecc.) o i vasi come una struttura.
    NOTA: Anche se la segmentazione del filamento è molto utile per studiare la connettività dei vasi, usiamo la segmentazione del modulo di superficie per estrarre i dati sulle dimensioni, il volume e i diametri dei vasi. Infatti, la quantificazione delle dimensioni dei vasi viene persa quando si utilizza il modulo filamenti.
    1. Apri il modulo Superficie del software.
    2. Selezionare il canale fluorescente del marcatore utilizzato per etichettare in modo specifico il componente subcellulare per ricostruirlo in 3D.
    3. Impostare le soglie e fornire un intervallo della dimensione prevista del diametro della struttura (ad esempio, 0,5-5 m per i nuclei; 0-100 m per i vasi; ecc.).
    4. Eseguire la segmentazione. Verrà generato un volume con la struttura cellulare segmentata. Le misurazioni e i dati quantitativi (volume, numero, dimensione, diametro, ecc.) possono essere estratti dalla scheda delle statistiche.
  4. Segmentare i vasi come continuum tubolare.
    NOTA: Anche se la segmentazione del filamento è molto utile per studiare la connettività dei vasi, usiamo la segmentazione del modulo di superficie per estrarre i dati sulle dimensioni, il volume e i diametri dei vasi. Infatti, la quantificazione delle dimensioni dei vasi viene persa quando si utilizza il modulo filamenti.
    1. Aprire il modulo Filamenti del software.
    2. Selezionare il canale fluorescente corrispondente alla colorazione del recipiente.
    3. Impostare le soglie per l'intensità della fluorescenza e selezionare il numero appropriato di nodi di connessione previsti.
    4. Eseguire la segmentazione. I filamenti che rappresentano la rete navale saranno generati in 3D. Le misurazioni possono essere estratte dalla scheda delle statistiche, consentendo di ottenere dati quantitativi, tra cui la lunghezza della nave, il numero di ramificazioni della nave, ecc.

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Risultati

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Utilizzando la procedura descritta di seguito e riepilogata nella Figura 1, siamo stati in grado di macchiare e cancellare otticamente il tessuto adiposo bianco e umano, come illustrato nella Figura 2A e nella Figura 2B, rispettivamente. Il tessuto eliminato è stato trasferito alla camera di imaging metallico per eseguire l'imaging confocale (Figura 3A). La compensazione ha migliorato drasticamente la p...

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Discussione

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Le modifiche che si verificano all'interno del tessuto adiposo nel corso della progressione patologica, come quella dell'obesità, sono fondamentali per la comprensione dei meccanismi alla base della patologia. Studi pionieristici che hanno rivelato tali meccanismi nel tessuto adiposo sono stati basati su approcci globali come la proteomica del tessuto adiposointero 21, la citometria di flusso22,23e la trascrittomica24

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da INSERM, Università della Costa Azzurra, e con sovvenzioni dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso gli investimenti per il futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), il programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) tramite Academy 2 "Systèmes Complexes" e Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical ('quipe FRM DEQ201839587), e il Programma Giovani Investigatori a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-(ANSA) - EREARON. Ringraziamo anche l'Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, e che è supportato anche dalla piattaforma IBISA Microscopy and Imaging C'tzur (MICA). Ringraziamo Marion Dussot per l'aiuto tecnico nella preparazione dei tessuti. Ringraziamo Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, per la lettura a prova del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microprovette da 1,5 mLProvette Eppendorff - Dutscher33528
Provette in plastica da 15 mLProvette Falcon - Dutscher352096
Vetrino coprioggetti rotondo in vetro da 18 mmMariendfeld0117580
Flacone in vetro da 20 mLAnticorpo986546
anti-topo-alexa647Jackson ImmunoResearch715-605-150Diluizione: 1/100
anticorpo coniugato anti-coniglio-alexa647Jackson ImmunoResearch711-605-152Diluizione: 1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PE anticorpoBiolegendBLE145703Diluizione: 1/100
CD31 anticorpoAbCamab215912Diluizione: 1/50
Software di analisi 3D commerciale - StrumentoIMARIS Oxfordcon modulo cellulare
Microscopio confocale - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306Concentrazione di riserva: 5 mg/mL; diluizione 1/1000
DeossicolatoSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Glut4 anticorpoSanta Cruzsc-53566Diluizione: 1/50
GlycineSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1Concentrazione di riserva: 2 µ g/µ L; Iniezione endovenosa: 50 & micro; L/topi
Camera di imaging metallica dotata di fondo in vetro - Camera AttoFluorThermofisherA7816
Salicilato di metileSigma-aldrichM6752
Anticorpo perilipinaProgen651156Diluizione: 1/50
Falloidina-alexa488ThermoFisherA12379Diluizione: 1/100
TCR-β-PBBiolegendBLE109225Diluizione: 1/100
TH anticorpoAbCamab112Diluizione: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416
coniugato Wheaton

Riferimenti

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