Articolo metodologico

Quantificare il micro-ambiente del tumore metastatico del cervello utilizzando un modello 3D a chip Organ-On-A, apprendimento automatico e tomografia confocale

DOI:

10.3791/61654

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16 agosto 2020

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center, University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery, University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Ann Arbor

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per preparare e cultare una barriera ematica del micro-ambiente tumorale metastatico e quindi quantificare il suo stato utilizzando l'imaging confocale e l'intelligenza artificiale (apprendimento automatico).

Abstract

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Le metastasi cerebrali sono le lesioni tumorali più letali; 10-30% di tutti i tumori metastasi al cervello, con una sopravvivenza mediana di soli 5-20 mesi, a seconda del tipo di cancro. Per ridurre il carico del tumore metastatico del cervello, le lacune nella conoscenza di base e traslazione devono essere affrontate. Le sfide principali includono una scarsità di modelli preclinici riproducibili e strumenti associati. I modelli tridimensionali della metastasi cerebrale possono produrre i dati molecolari e fenotipi pertinenti utilizzati per affrontare queste esigenze quando combinati con strumenti di analisi dedicati. Inoltre, rispetto ai modelli murini, i modelli organo su chip delle cellule tumorali del paziente che attraversano la barriera ematica nel microambiente cerebrale generano risultati rapidamente e sono più interpretabili con metodi quantitativi, quindi suscettibili a test ad alta produttività. Qui descriviamo e dimostriamo l'uso di una nuova piattaforma di nicchia microfluidica del cervello del sangue 3D (mBBN) in cui più elementi della nicchia possono essere ricostrutti per un periodo prolungato (diversi giorni), fluorescently immagine da microscopia confocale, e le immagini ricostruite utilizzando un'innovativa tecnica di tomografia confocale; tutti miravano a comprendere lo sviluppo di micro-metastasi e i cambiamenti al micro-ambiente tumorale (TME) in modo ripetibile e quantitativo. Dimostriamo come fabbricare, seminare, immagine e analizzare le cellule tumorali e i componenti cellulari e umoristici TME, utilizzando questa piattaforma. Inoltre, mostriamo come l'intelligenza artificiale (AI) viene utilizzata per identificare le differenze fenotipici intrinseche delle cellule tumorali che sono in grado di transitare attraverso un modello di mBBN e per assegnare loro un indice oggettivo del potenziale metastatico cerebrale. I set di dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per rispondere a domande di base e trasfondiali sulla metastasi, sull'efficacia delle strategie terapeutiche e sul ruolo del TME in entrambi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le metastasi cerebrali sono le lesioni tumorali più letali; 10-30% di tutti i tumori metastasi al cervello, con una sopravvivenza mediana di soli 5-20 mesi, a seconda del tipo dicancro 1,2. Una domanda principale che si pone quando si studia la metastasi del cancro è come i sub cloni migrano dall'ambiente umoristico del flusso sanguigno in un organocome il cervello 3,4. Questa domanda ha portato a molte variazioni di analisi di migrazione, invasione e stravasazione. Tutti questi metodi condividono la fase critica del conteggio o della misurazione delle proprietà delle cellule che si spostano da una posizione all'altra in risposta a uno stimolo. La maggior parte dei saggi migratori prontamente disponibili sono utilizzati per studiare la migrazione bidimensionale (2D) delle cellule tumorali. Questi hanno chiarito una ricchezza di conoscenza; tuttavia, non ricapitolano la natura tridimensionale del sistema in vivo che altri metodi possono fornire5. Pertanto, è necessario studiare il micro-ambiente tumorale (TME) in sistemi tridimensionali (3D), ma gli approcci di analisi disponibili per le strutture 3D sono limitati e spesso incoerenti.

Uno degli strumenti 3D più popolari è una camera Boyden che consiste in una membrana sospesa nella parte inferiore di un pozzo, che separa due regioni distinte. Boyden ha introdotto il saggio per studiare la chemiocita leucocato4. Le regioni inferiori possono essere variate in base alla chimica o ad altrimezzi 6,7 per indurre le cellule nella regione superiore a migrare nella regione inferiore. L'approccio più comune per quantificare il numero di cellule migrate è quello di rilasciare le cellule dal fondo della membrana utilizzando una soluzione tampone, li lyse, e quindi contarli in base alla quantità di contenuto di DNA nella soluzione7. Questo approccio indiretto è soggetto a errori dell'operatore a causa della variabilità tecnica e la procedura distrugge le informazioni sul fenotipo del cancro e sul micro-ambiente. Variazioni del saggio camera Boyden comportano fissazione delle cellule migratorie che rimangono sulla membrana, ma fornisce solo un conteggio delle cellule che non sono più praticabili per lo studiocontinuo 6,8,9.

A causa dei limiti della camera Boyden e della crescita delle innovazioni nella comunità microfluidica, sono stati sviluppati chip di analisi della migrazione che osservano il movimento delle cellule in risposta a uno stimolo in una direzione piuttosto che intre 10,11,12. Questi saggi di migrazione facilitano il controllo su fattori quali il flusso o la separazione di singolecellule 13,14 che consentono una migliore interpretazione dei risultati; tuttavia, il loro formato 2D perde inevitabilmente alcune informazioni dinamiche. Recenti studi si sono concentrati sulla stravasazione (cioè il movimento delle cellule dalla circolazione in un tessuto, come la barriera ematica) in un ambiente 3D14,15. La distanza di stravasazione nel comportamento di tessuto e sonda che si verifica alla barriera/membrana cellulare è più raffinata rispetto alle misurazioni raccolte utilizzando la camera Boyden o un dispositivo di migrazione microfluidico 2D16. Pertanto, i dispositivi che consentono un'adeguata imaging e analisi della stravasazione 3D sono fondamentali per catturare queste misurazioni sofisticate, ma sono carenti nella letteratura.

Indipendentemente dai saggi di migrazione, sono state sviluppate robuste tecniche di imaging per la risonanza magnetica (RSI) e la tomografia che sono in grado di identificare e ricostruire con precisione il tessuto nello spazio 3D17,18. Queste tecniche acquisiscono immagini in z-stack e parti di segmento dell'immagine in base alle proprietà del tessuto e quindi convertono le immagini segmentate in mesh tridimensionali19,20,21. Questo permette ai medici di visualizzare in 3D singoli organi, ossa e vasi per aiutare nella pianificazione chirurgica o nell'aiuto nella diagnosi di cancro o malattiecardiache 22,23. Qui, mostreremo che questi approcci possono essere adattati per l'uso su campioni microscopici e dispositivi di stravasazione 3D.

A fine questo, abbiamo sviluppato l'innovativa tecnica di tomografia confocale, presentata qui, che offre flessibilità per studiare la stravasazione delle cellule tumorali attraverso una membrana adattando gli strumenti di tomografia esistenti. Questo approccio consente lo studio dell'intera gamma dei comportamenti delle cellule tumorali mentre interagiscono con una barriera cellulare, come uno strato cellulare endoteliale. Le cellule tumorali presentano comportamenti di sondaggio; alcuni possono invadere ma rimanere vicino alla membrana, mentre altri attraversano facilmente la barriera. Questa tecnica è in grado di produrre informazioni sul fenotipo della cellula in tutte le dimensioni24. L'utilizzo di questo approccio per studiare il TME è relativamente economico, facile da interpretare e riproducibile, rispetto ai modelli murine in vivo più complessi. La metodologia presentata dovrebbe fornire una solida base per lo studio di molti tipi di tumori e micro-ambienti adattando la regione stromica.

Descriviamo e dimostriamo l'uso di una piattaforma 3D di nicchia del cervello del sangue microfluidica(Figura 1)in cui gli elementi critici della barriera e della nicchia (cellule endoteliali microvascolari cerebrali e astrociti) possono essere ristrutturati per un periodo prolungato (circa fino a 9 giorni), fluorescentemente immagini dalla microscopia confocale, e le immagini ricostruite utilizzando la nostra tecnica tomografia confocale (Figura 2); tutti miravano a comprendere lo sviluppo di micro-metastasi e i cambiamenti nel micro-ambiente tumorale in modo ripetibile e quantitativo. L'interfaccia della barriera ematica con la nicchia cerebrale è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali che sono rafforzate da membrana seminterrato, piedi astrociti e periciti25. Ci siamo concentrati selettivamente sui componenti astrociti ed endoteliali data la loro importanza nella formazione e nella regolazione della barriera ematica. Dimostriamo come fabbricare, seminare, immagine e analizzare le cellule tumorali e i componenti cellulari e umoristici del micro-ambiente tumorale, utilizzando questa piattaforma. Infine, mostriamo come l'apprendimento automatico possa essere utilizzato per identificare le differenze fenotipici intrinseche delle cellule tumorali che sono in grado di transitare attraverso un modello di mBBN e per assegnare loro un indice oggettivo del potenziale metastatico cerebrale24. I set di dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per rispondere a domande di base e trasslezionali sulla metastasi, sulle strategie terapeutiche e sul ruolo del TME in entrambi.

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Protocollo

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1. Preparare la barriera ematica di nicchia

NOTA: Il dispositivo di culto utilizzato in questa piattaforma è un'impalcatura basata su PDMS su cui costruiamo una nicchia di barriera cellulare della barriera ematica. È costituito da due parti separate da una membrana porosa. Per preparare la nicchia barriera ematica della barriera ematica sono necessari due stampi SU-8 realizzati con fotolithografia26,27. Il protocollo sarà descritto prima per lo stampo spesso 100 m e poi verranno date note per lo stampo spesso 200 m.

  1. Per preparare lo stampo, pulire un wafer di silicio da 4" usando l'acetone con una bottiglia di spremere e poi asciugarlo con una pistola azotata.
    1. Cuocere il wafer di silicio su una piastra calda per 10 minuti a 200 gradi centigradi per rimuovere tutto il solvente residuo.
    2. A sua volta centrare il wafer di silicio sul mandrino di un cappotto di spin e erogare 1 mL di SU8-2075 per lo stampo superiore. Girare per 5 s a 500 giri/min (accelerazione 300 rpm/s) per disperdere il fotoresist e poi 30 s a 2200 giri/min (accelerazione 300 rpm/s) per ottenere un rivestimento SU-8 di spessore 100 m. L'ottimizzazione può essere necessaria per ottenere lo spessore specificato.
  2. Cuocere morbido il wafer su una piastra calda a 65 gradi centigradi per 2 minuti e poi immediatamente a 98 gradi centigradi per 20 minuti.
  3. Posizionare il wafer in una lampada fotolithography e posizionare la maschera centrata sul wafer secondo le procedure standard. Esporre i wafer rivestiti SU-8 con una luminosità di 230 mJ/cm2 di UVB (360 nm ± 10 nm). Un esperimento di matrice di esposizione può essere eseguito per determinare il dosaggio ottimale. I disegni delle maschere sono disponibili in Supplemental File 1.
  4. Eseguire una cottura post-esposizione a 65 gradi centigradi per 2 minuti e poi immediatamente a 98 gradi centigradi per 10 minuti per migliorare l'adesione. Raffreddare il wafer a 50 gradi centigradi.
  5. Rimuovere la resistenza non esposta utilizzando su-8 foto-sviluppatore. Risciacquare il wafer in sviluppatore per 5 minuti in un bagno e quindi utilizzare una bottiglia spray riempito con sviluppatore SU-8 in una cappa chimica per agitare e rimuovere il SU-8 rimanente non curato. Un microscopio 4x può essere utilizzato per osservare se tutto il SU-8 non curato è stato rimosso. Una linea bianca sui bordi delle funzioni fotoresist indica che il SU-8 non è stato rimosso completamente.
  6. Eseguire un'ultima cottura in forno a 110 gradi centigradi per 60 minuti.
  7. Seguire la stessa procedura per lo stampo di spessore 200 m utilizzando SU-8 2075 ma regolare il protocollo al seguente:
    1. Impostazioni del coater di spin: Girare per 5 s a 500 giri/base (accelerazione 300 giri/s) per disperdere il fotoresist e poi 30 s a 1300 giri/min (accelerazione 300 giri/s) per ottenere un rivestimento spesso di 200 m.
    2. Cuocere morbido a 65 gradi centigradi per 2 minuti e poi a 98 gradi centigradi per 40 min.
    3. Tempo di esposizione di 340 mJ/cm2.
    4. Post esposizione cuocere: 2 min a 65 gradi centigradi, e poi 98 gradi centigradi per 15 min.
  8. Infine, silanizzare ogni wafer mettendoli in una camera a vuoto all'interno di un cappuccio chimico con un contenitore di plastica in cui sono state poste 3 gocce (150 l) di soluzione silanizzante (Trichloro perfluoro octyl silane). Tirare un vuoto e lasciare durante la notte per consentire al vapore di rivestire il wafer. Questo passaggio riduce l'adesione tra il SU-8 e IL PDMS, aumentando la durata dello stampo.
    CAUTION: Trichloro perfluoroctyl silane deve essere sempre maneggiato nel cappuccio di fumi e tenuto lontano dalle fonti d'acqua.
  9. Posizionare i singoli stampi wafer in piatti Petri da 150 mm utilizzando due strisce di nastro adesivo a due lati. Assicurarsi che i wafer siano piatti. Un'alternativa è quello di fabbricare uno stampo in alluminio all'interno del quale il wafer può essere posizionato. Poiché lo stampo in alluminio è racchiuso produrrà calò con uno spessore uniforme, mentre il metodo petri piatto è sensibile all'inclinazione della superficie è posto su. La migliore flatità dei calcamenti PDMS riduce il tempo di imaging confocale a valle.

2. Formare e assemblare il dispositivo di barriera ematica (BBB) PDMS

  1. Mescolare 75 g di PDMS con un rapporto di 1:10 (Crosslinker:Base) in peso in una tazza di plastica.
  2. Versare il PDMS sugli stampi (1 mm di spessore per lo stampo spesso 200 m e 4 mm per lo stampo spesso 100 m) e degas in un desiccatore sottovuoto per un'ora o fino a quando tutte le bolle sono state rimosse. Mettere in forno a 65 gradi durante la notte. Lo spessore di 1 mm può essere regolato in base alla distanza di lavoro dell'obiettivo 10x nel microscopio confocale.
  3. Dopo che il PDMS ha curato utilizzare una lama per tagliare delicatamente contro il wafer attraverso il PDMS intorno ai bordi. Sbucciare il PDMS e utilizzare una lama per tagliare lungo le guide rettangolari e un punzone biopsia di 1,5 mm per aprire le prese e le prese sul dispositivo. Coprire le parti del dispositivo PDMS con nastro da imballaggio largo 48 mm per mantenerlo pulito da polvere e detriti.
  4. Utilizzare successivamente le forbici di dissezione per tagliare un rettangolo di 5 mm x 50 mm di membrana in policarbonato con pori da 5 m e conservarlo all'interno di un piatto Petri per un uso successivo.
  5. Raccogliere quanto segue: 200 punta di pipetta L, 2 mL di 1:10 PDMS mescolato con toluene ad un rapporto di 2:3 per peso in una fiala di vetro, una pipetta Pasteur con una lampadina di compressione, le parti superiori e inferiori PDMS preparate, la membrana, tre vetrini di vetro 50 mm x 75 mm e trasportarlo tutto in un rivestimento di spin. I passaggi seguenti per l'assemblaggio e il seeding delle celle del dispositivo sono descritti nella Figura 1.
  6. Utilizzare la pipetta Pasteur per trasferire 1 mL di soluzione di colla PDMS:toluene in un vetrino di vetro da 50 mm x 75 mm sul mandrino del cappotto di spin. Girare per 5 secondi a 100 giri/min (accelerazione 300 rpm/s) e 30 secondi a 2000 giri/min (accelerazione 300 giri/s).
  7. Posizionare la diapositiva su un tavolo e coprirla con una camera superiore PDMS e una camera inferiore in modo che le facce PDMS con caratteristiche modellate in esso contattino lo scivolo e la colla viene trasferita alla faccia PDMS, delineando il perimetro di tutte le caratteristiche.
  8. Capovolgere la camera superiore PDMS su un altro scivolo con il rivestimento della colla rivolto verso l'alto e posizionare con attenzione la membrana attraverso il dispositivo tra le prese e le prese. Inserire la punta da 200 L nella soluzione di colla PDMS:toluene fino a quando non ne ha intasa una parte nella punta. Toccare la punta tra ogni ingresso e presa per posizionare una piccola goccia vicino al bordo della membrana dove contatta il PDMS.
  9. Rimuovere l'altra metà del dispositivo e posizionarla con il rivestimento della colla mentre si allineano le prese e le prese sulle due parti.
  10. Mettere il dispositivo assemblato in forno a 37 gradi centigradi durante la notte per curare la colla. Trasferire in un barattolo di campana sottovuoto con desirico e lasciare disidratare per due giorni. Questo è un passo cruciale per consentire al Toluene di evaporare e migliorare la consistenza della semina del dispositivo regolando il vapore acqueo assorbito nell'aria di laboratorio.

3. Semina il micro-ambiente cerebrale nel dispositivo

  1. Coltura cellulare e reagenti: prima di iniziare questo protocollo, ottenere i seguenti reagenti e celle. Coltivare tutte le linee cellulari in un'incubatrice fissata a 37 gradi centigradi in 5% CO2.
    1. Mantenere le cellule umane triplo negativo del cancro al seno MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) e MDA-MB-231-BR-GFP (ottenute da Patricia Steeg, PhD) in DMEM con glucosio 4,5 g/L, integrato con 2 mM L-glutamine, 10% FBS e 1x antibiotico-antimia. Crea cellule fluorescenti MDA-MB-231-GFP trasducendo la cella MDA-MB-231 con lentivirus pLL-EV-GFP vettoriale vuoto. Ordinare la popolazione GFPtrasdutta utilizzando l'ordinamento delle celle attivato dalla fluorescenza (FACS) prima della sperimentazione.
    2. Mantenere le cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane hCMEC/D3 nel mezzo EGM-2. Creare celle fluorescenti hCMEC/D3-DsRed trasducendo hCMEC/D3 con il vettore vuoto pLL-3.7-dsRed lentivirus. Rimuovere tutte le cellule non fluorescenti non trasdutbili dalla coltura utilizzando FACS prima dell'uso sperimentale.
    3. Mantenere i normali astrociti umani (NHA) in DMEM integrato con glucosio 4,5 g/L, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM di piruvato di sodio, 1x integratore di crescita N-2 e 1x antibiotico-antimicotico. Immortalare gli astrociti trasducendo il vettore lentivirale pLOX-TERT-iresTK (Addgene 12245). Creare il vettore utilizzando plasmide psPAX2 e envelope plasmid pMD2.G (Addgene 12260 e 12259).
  2. Rimuovere un dispositivo mBBN dal desiccatore sottovuoto e posizionarlo su una superficie metallica o di carta (cioè nastro adesivo) con le insenature rivolte verso il basso e metterla in una camera al plasma. Posizionare anche uno scivolo di vetro 50 mm x 75 mm nella camera al plasma. Tirare un vuoto e poi trattare con plasma a 80 W per 30 s.
  3. Rimuovere rapidamente lo scivolo di vetro e il dispositivo dalla camera al plasma e posizionare il dispositivo con le insenature rivolte verso l'alto sul vetredo allineato utilizzando una guida (Supplemental File 2). Questo creerà un legame permanente tra il PDMS e lo scivolo di vetro e non può essere riposizionato.
  4. Successivamente tagliare le punte fuori 16, 200 punte di pipetta 2, 2 mm dalla punta. Inserire le punte delle pipette in tutte le prese e le prese. Il dispositivo può essere riposto nel desiccatore sottovuoto a questo punto se non è pronto a seminare le cellule.
  5. Mettere il dispositivo nella camera al plasma e trattare con plasma per 8 min a 200 W. Dopo che il dispositivo si è raffreddato (5 min) dal trattamento al plasma, posizionalo all'interno di un contenitore secondario sterile, come una scatola trasparente di punta della pipetta. Eseguire il passo successivo entro 15 minuti o l'efficacia del trattamento al plasma può essere ridotta portando all'intasamento.
  6. Diversi giorni prima dell'esperimento la coltura Petri piatti di 1 x 106 cellule endoteliali (hCMEC/D3-DsRed) e 1 x 106 astrociti (NHA). Mentre il dispositivo è sottoposto al trattamento al plasma da 8 minuti, preparare una soluzione di collagene composta da 0,5 mL di collagene bovino PureCol da 3 mg/mL di tipo I con 64 L di 0,8 M NaHCO3 e 20 L di 10x meM ad alto glucosio (250 mM). Sospendere 5,0 x 105 cellule NHA nella soluzione di collagene. Mantenere la soluzione sul ghiaccio mentre non è in uso.
  7. Trasferire 120 L della soluzione collagene/astrocita/microglia nel dispositivo attraverso la punta della pipetta per la camera inferiore (Figura 1 Frecce rosse). Lasciare che la soluzione si spini attraverso la camera nella punta di pipetta opposta. Dopo che tutti e quattro i canali del dispositivo sono stati riempiti, posizionare il chip nell'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2 per 1 h o fino a quando il collagene non si è impostato.
  8. Dopo i set di collagene, riempire tutte le punte di pipetta alimentando la camera inferiore con una miscela di supporto completo. Per i chip contenenti cellule endoteliali e astrociti, viene utilizzato un mix 50:50 di supporti endoteliali:astrociti.
  9. Rivestire la camera superiore con 2% fattore di crescita ridotto Matrigel in supporto endoteliale completo utilizzando la punta della pipetta camera superiore (Figura 1 Frecce blu) e posto in incubatrice per 1 ora.
  10. Risciacquare la camera superiore con la miscela multimediale indicata e alternare quale punta viene testata con celle endoteliali (Figura 1 Frecce verdi). Sospendere 1 x 106 cellule endoteliali in 1 mL di supporti endoteliali e semi 30 L ogni 15 minuti in punte alternate della camera superiore per una copertura uniforme. Seme cellule endoteliali in ogni punta camera superiore due volte, per un totale di 4 volte per camera.
  11. Dopo la semina finale delle cellule endoteliali, riempire tutte le punte con la miscela multimediale e posizionare il dispositivo nell'incubatrice a 37 gradi centigradi e 5% di CO2,cambiando i supporti in entrambe le camere ogni 12 h.

4. Monitorare la progressione della formazione dello strato endoteliale

  1. La copertura completa del canale da parte dello strato endoteliale viene osservata dopo 3 giorni. Utilizzare uno dei due metodi per monitorare la copertura della barriera endoteliale: Fluorescenza o TEER. la fluorescenza hCMEC/D3-DsRed e la copertura in base alla percentuale nell'area del canale possono essere quantificate utilizzando ImageJ.
    1. Aprire il file TIFF in ImageJ rappresentante della barriera hCMEC/D3-DsRed. Nel software ImageJ, fare clic su File > Apri per selezionare il file.
    2. Unire tutti i livelli z dell'immagine utilizzando l'intensità massima che segue questi comandi e opzioni da tastiera: Immagine > Stack > Progetto > Tutte le sezioni, Intensità massima.
    3. Eseguire una soglia di colore che sia la stessa su tutti i chip microfluidico valutati utilizzando questo metodo. Per lo studio presentato abbiamo impiegato una soglia di 450. Utilizzate il menu soglia in ImageJ in: Immagine > Regola > Soglia.
    4. Impostare le misurazioni da registrare utilizzando i seguenti comandi e opzioni: Analizza > Imposta misure > Limite alla soglia, Frazione area.
    5. Selezionare una regione rappresentativa del canale microfluidico da misurare disegnando una casella. Lo strumento box si trova nel menu principale di ImageJ. Misura 3 repliche tecniche posizionate all'inizio, al centro e alla fine di ogni canale microfluidico utilizzando la stessa dimensione della scatola.
    6. Analizzare ogni canale e registrare la frazione dell'area, che rappresenta la copertura endoteliale %. Esportare queste misurazioni come file di foglio di calcolo per stampare e visualizzare i dati utilizzando i seguenti comandi: Analizza > Misura.
  2. In alternativa, utilizzare TEER basato su spettroscopia Impedance per misurare le giunzioni endoteliali strette per area. La quantificazione della barriera endoteliale utilizzando TEER è un proxy per l'integrità dello strato endoteliale come barriera.
    1. Posizionare due elettrodi nell'ingresso e nella presa delle camere superiore e inferiore.
    2. Quantificare l'impedenza del monostrato endoteliale come combinazione delle resistenze, induvi e condensate nel chip secondo un modello proposto da Srinivasan et al.28,29.

5. Semina le cellule tumorali nel dispositivo

  1. Dopo che lo strato endoteliale è maturato, le cellule tumorali del seme nel dispositivo. Preparare una soluzione da 1 mL di 1 x 106 cellule tumorali in supporti completi per le cellule tumorali.
  2. Scambia i supporti nel chip per ricostituire i nutrienti della coltura cellulare.
  3. Seni ogni canale della camera superiore con 30 L di cellule tumorali in sospensione e poi ri-ri posto il dispositivo nell'incubatrice per 15 minuti. Semina sempre le cellule tumorali sullo stesso lato di tutti e quattro i canali della camera superiore all'interno di un singolo dispositivo.
  4. Scambia il dispositivo con nuovi supporti e ricarica i suggerimenti ogni 12 ore fino a quando il dispositivo non viene immagine per il comportamento metastatico.

6. Immagine del micro-ambiente tumorale mediante imaging confocale

  1. Nel punto di tempo sperimentale desiderato (1, 2 o 9 giorni), utilizzare l'imaging confocale per acquisire un'immagine 3D del canale. Eseguiamo questo passaggio su un Nikon A1 utilizzando le impostazioni descritte di seguito. Questo passaggio è automatizzato e ogni canale richiede 20-40 minuti per l'immagine a seconda di quanti canali fluorescenti sono inclusi e della profondità z necessaria per coprire le posizioni di tutte le cellule.
  2. Accendere il microscopio, aprire il software e posizionare il coperchio dell'incubatrice al microscopio.
  3. Impostare il riscaldatore a fase del microscopio su 37 gradi centigradi e CO2 al 5%, se disponibile.
  4. Dopo che l'incubatrice al microscopio si è stabilizzata, posizionare il dispositivo nello stadio del microscopio utilizzando il supporto di 50 mm x 75 mm.
  5. Concentrarsi su un lato del dispositivo (a sinistra se da utilizzare con il software di analisi fornito) con un obiettivo 10x e impostare l'altezza di z come zero. Nelle impostazioni dello z-stack, includere un intervallo di 100 m sopra e 200 m sotto il piano di messa a fuoco. Quindi utilizzare l'impostazione di cucitura per impostare il numero di campi X e Y rispettivamente su 1 e 9 con la sovrapposizione del 15%. Impostare il foro steno a forma di foro e l'altezza dello strato z su 9 m. Regolare l'esposizione al campo luminoso in modo che la membrana porosa sia visibile. Accendere i laser di eccitazione per i canali dsRed (561 nm) e GFP (488 nm) e regolare le potenze e i tagli del laser fluorescente in modo che ogni canale sia visibile senza sovraesposire i pixel.
  6. Verificare che tutti i campi siano a fuoco quando vengono sovrascritti. In tal caso, immettere un nome di file di output (001.nd2) per l'immagine e avviare l'esperimento per acquisire automaticamente l'immagine confocale 3D.

7. Misurare il micro-ambiente tumorale tramite tomografia confocale

  1. Utilizzare la tomografia confocale un approccio per stimare una serie di metriche e misure che descrivono le singole cellule e il micro-ambiente tumorale all'interno del dispositivo. L'analisi tomografica confocale (Figura 2) converte uno z-stack confocale in una rappresentazione tridimensionale delle celle. Utilizzando uno script pitone personalizzato all'interno dell'ambiente jupyter notebook/laboratorio, un piano viene poi abbinato allo strato di cellule che formano la barriera ematica comemembrana 30. Infine, effettuare misurazioni fenotipi delle popolazioni di cellule tumorali (Tabella 1).
    1. Eseguire questa analisi alla fine di un esperimento o in un corso di tempo. Installare python e le librerie appropriate secondo la guida software di riferimento, quindi aprire il software dal prompt dei comandi di Windows eseguendo il comando "conda activate", seguito da "jupyter lab". L'ambiente Jupyter verrà caricato all'interno del browser predefinito.
    2. In Esplora file Jupyter fare doppio clic sul blocco appunti Jupyter "contom.ipynb" per aprirlo. Eseguire la cella sotto il titolo Librerie di importazione, classi/funzioni personalizzate e configurare il blocco appunti facendo clic sulla cella del blocco appunti e quindi sul pulsante di riproduzione. Tutte le celle del blocco appunti riportate di seguito vengono eseguite utilizzando lo stesso approccio. Si noti che qui notebook "cella" si riferisce a un blocco di codice pitone all'interno del blocco appunti Jupyter.
  2. Preparare i dati. Questo algoritmo utilizza il toolkit di visualizzazione (VTK) per modificare e visualizzare lo z-stack e i dati tridimensionali17.
    1. Posizionare il file fornito. XLSX ("Experiment Tracker.xlsx") nella stessa cartella windows del blocco appunti Jupyter. Il file tiene traccia degli esperimenti e delle interfacce con il taccuino Jupyter. Posizionare il file ND2 dalla sezione 6 in una sottocartella denominata "'Experiment_XXX'"" sotto il percorso del blocco appunti Jupyter. Ulteriori cartelle di esperimento possono essere aggiunte all'interno regolando il "XXX" per l'ID numerico assegnato alle nuove cartelle.
    2. Etichettare la prima cartella dell'Experiment_001 """ e il file ND2 "001.nd2". In primo luogo, convertire il file di imaging ND2 in un file TIFF a più immagini cucito separato dal canale di colore. Eseguire questa operazione eseguendo la cella del blocco appunti sotto il titolo "Leggi lo stack z confocale in memoria" con la funzione Save_tiff_from_ND2 () non commento30. Il file ND2 è un formato di imaging proprietario di Nikon, quindi è necessario convertirlo in un formato con cui il software open source è compatibile.
      NOTA: il TIFF (Tag Image File Format) viene utilizzato perché è onnipresente, compatibile a 16 bit, facilmente importato in VTK e più immagini possono essere memorizzate in un unico file, che è appropriato per le immagini z-stack. L'esecuzione della cella del blocco appunti leggerà un'immagine dal file ND2, estrarrà le informazioni del colore e le posizioni XY, quindi ma ridimensionerà l'immagine in una matrice numpy in base a una struttura predeterminata. L'array verrà quindi salvato come file TIFF utilizzando il file tifffile della libreria python.
  3. Convertire i dati di imaging in modello 3D
    1. Importare il file TIFF in VTK (vtkTIFFReader ) utilizzando un rendering 3D per visualizzare le celle (Figura 2). Selezionare una soglia in base al colore delle celle nell'immagine. Per chiarire, l'oggetto VTK rappresenta un blocco di pixel (X, Y, z) nello spazio (volume), ma solo alcuni pixel (verde o rosso) rappresentano le celle, il resto sono di sfondo o di rumore (nero).
    2. Pertanto, impostare un filtro di opacità sul volume che rimuove lo sfondo confermare che ciò che rimane fluorescenza è solo le celle. Eseguire questa operazione utilizzando la cella del blocco appunti Jupyter intitolata, Modificare i valori di opacità per ogni canale del microscopio regolando le variabili di valore Channel_alpha (ad esempio, GFP_alpha). Visualizzare l'effetto utilizzando la cella del blocco appunti denominata Visualizza un rendering 3D per verificare che la soglia sia impostata correttamente.
    3. Salvare i valori di opacità nel foglio di calcolo da utilizzare nel passaggio successivo. Convertire i dati del volume in singoli oggetti 3D, ognuno dei quali rappresenta una cella nell'immagine utilizzando una tecnica denominata cubi31 . Questo algoritmo estrae una mesh poligonale di un isosuperficio da campi scalari discreti tridimensionali di voxel.
    4. Utilizzare il valore di opacità nell'algoritmo per separare ogni cella dallo sfondo. Completare questo passaggio per tutte le celle fluorescenti identificate in ogni canale del microscopio eseguendo Converti immagine voxel in una mesh triangolare e salva come file VTK nel blocco appunti.
  4. Montaggio di un piano alla membrana
    1. Adattare un piano alla barriera endoteliale individuando innanzitutto i centriidi cellulari (cella del notebook: analizzare il canale RFP (barriera endoteliale)). Scorrere l'elenco mesh nel volume ed estrarre le aree che non sono connesse utilizzando un PolyDataConnectivityFilter da VTK. Calcolare il centroide di ogni mesh e aggiungere la misura a un elenco di centriidi che filtrano per mesh troppo grandi o troppo piccole (<50, >1000000 voxel).
    2. Adattare un piano all'elenco dei centriidi per le celle endoteliali utilizzando un metodo di minimizzazione dell'errore (cella del notebook: adattare un piano ai centriidi RFP (barriera endoteliale)) (Figura 2, Figura 3)32. Ispezionare l'adattamento del piano tracciando il piano e i centriidi e regolare manualmente se necessario (utilizzando theta, beta e z) eseguendo la cella del notebook denominata Visualizza centriidi RFP e adattamento piano.
    3. Dopo che il piano è stato montato correttamente, salvare la normale del piano nel file Di monitoraggio dell'esperimento . XLSX per un utilizzo futuro.
  5. Analizzare le caratteristiche descrittive delle singole cellule tumorali per i seguenti descrittori (Tabella 1).
    NOTA: se il computer che esegue l'analisi è in ritardo, l'analisi ad alta velocità effettiva tramite il calcolo ad alte prestazioni è un'opzione. Questo algoritmo è utile sui computer portatili standard per l'analisi di un piccolo numero di celle, tuttavia VTK non è adatto a un gran numero di singoli oggetti (>1000). Pertanto, è facoltativo utilizzare l'algoritmo adattato per funzionare su un cluster di elaborazione ad alte prestazioni. Ciò consente un'analisi rapida degli esperimenti con molte cellule (Figura 2). Tutto il 7.5 viene realizzato eseguendo le celle del notebook denominate Analizza i restanti canali del microscopio per i descrittori fenotipico e Leggi nelle informazioni di Experiment_tracker e analizza i canali esistenti.
    1. Misurare la stravasazione delle cellule tumorali: dopo aver caratterizzato lo strato endoteliale con un piano, misurare il volume di ogni cellula tumorali che è migrata attraverso la membrana. Ritagliare ogni cella (Boolean) in modo che la mesh sotto la membrana venga mantenuta e la porzione sopra la membrana vengarimossa 33. Quindi chiudere la mesh aperta (vtkFillHoles).
      1. Ricalcolare il normale e il nuovo centroide della mesh ritagliata. Misurare il volume e la posizione di ogni cellula del cancro ritagliata per l'analisi. Il volume è equivalente al numero di voxels i riempimenti mesh di ogni singola cella. Calcolare la distanza tra il piano endoteliale e la posizione di ogni cellula tumorali.
    2. Misurare il fenotipo cellulare: Calcolare la morfologia di ogni cellula del cancro fattoricando la sua forma, volume e posizione.
  6. Convalidare le misure e salvare in un foglio di calcolo o in un grafico. Eseguire la cella del blocco appunti denominata Controllare che i centriidi siano stati misurati in modo accurato e verrà visualizzato un rendering che mostra i centriidi identificati sopra il volume immagine per tipo di cella. Dopo aver eseguito tutti gli esperimenti, esportare il set di dati completo come singolo file di foglio di calcolo digitando gli esperimenti da includere in BASE all'ID nella cella del blocco appunti denominata Esporta i dati come singolo file Data.XLSX per le variabili sperimentando la sostituzione degli ID esperimento forniti. Se verificare il set di dati completato, stamparlo utilizzando la cella del blocco appunti denominata Distanza stravasata. Il grafico verrà visualizzato nell'ambiente del blocco appunti e verrà salvato su file.

8. Analizzare le caratteristiche correlate utilizzando l'Intelligenza Artificiale

NOTA: identificare le caratteristiche fenotiptiche metastatiche utilizzando algoritmi di intelligenza artificiale.

  1. Eseguire la classificazione binaria utilizzando Orange in base allo schema illustrato nella Figura 5 e File supplementare 3. Avviare Orange da un secondo prompt dei comandi di Windows digitando "conda activate" seguito da "python -m Orange.canvas" e fare clic su Nuovo dal prompt dei comandi. Orange è un software basato sul trascinamento della selezione, quindi organizza le funzioni trascinando ogni elemento dal menu a sinistra sull'area di disegno in modo che corrisponda al file supplementare 3. Al termine, fare doppio clic sull'icona File e selezionare il file Data.XLSX.
  2. Filtrare i dati per rimuovere le misure non riuscite, definite come quelle che non hanno superato un'operazione booleana o dando valori di variabile parametrici al di fuori dei limiti noti utilizzando l'icona "Seleziona righe". Fare doppio clic sull'icona e impostare le condizioni che corrispondono al filtro, ad esempio "Sphericity è compreso tra 0 e 1". Creare le condizioni per 8.2.1, 8.2.2 e 8.2.3.
    1. Filtrare le misure extravasate della distanza per variare da -100-200 m.
    2. Filtrare le misure di sfericità della forma della cella nell'intervallo da 0 a 1.
    3. Filtrare le misurazioni del volume delle cellule tumorali in modo da 0 a 2000 voxel.
    4. Utilizzare tutte le variabili parametriche (Tabella 1) per classificare l'assistente al debug gestito metastatico del cervello-MB-231-BR-GFP e l'MDA metastatico non cerebrale-MB-231-GFP. Fare doppio clic sull'icona Seleziona colonne nell'area di disegno. Utilizzando il pulsante > per spostare le variabili disponibili in Feature, Variabili didestinazione o Meta Attributi. L'unica variabile che deve essere una variabile di destinazione è un'etichetta metastatica che definisce se le celle nel set di dati sono considerate metastatiche (1) o meno (0). Le variabili dell'esperimento possono essere inserite nella sezione Meta Attributes.
  3. Campionare i dati in un training (80%) e set di test (20%). Fare doppio clic sull'icona Campionatore di dati e selezionare un Tipo di campionamento Percentuale fissa di dati: impostato su 80% e selezionare le caselle di controllo replicabili e stratificabili. Stratificare e convalidare il set di training usando 10 pieghe su ogni modello/classificatore. Fare doppio clic su Test e punteggio e selezionare Convalida incrociata con Numero di pieghe: impostato su 10 e Stratificato selezionato. Impostare la classe di destinazione su 1.
  4. In questo metodo, utilizzare reti neurali e algoritmi di apprendimento della foresta casuale in quanto sono robusti per i dati. All'interno dell'icona Foresta casuale, scegliere il numero di alberi da 50 e non selezionare altre opzioni. All'interno dell'icona Rete neurale scegliere Neuroni per layenascosto r: 100, Attivazione: ReLu, Risolutore: Adam, Alpha: 0.0001e Max Iterations: 200. Tuttavia, queste impostazioni variano in modo significativo a seconda dello studio e devono essere ben comprese prima dell'applicazione.
  5. Dopo aver impostare l'area di disegno fare doppio clic su ogni icona da File a Dati di esempio e premere Applica o Invia dati. Fare doppio clic su Test e punteggio e i dati di training inizieranno a essere usati per sviluppare un modello usando gli algoritmi. Dopo aver eseguendo il training del modello di apprendimento automatico, riaprono Test & Score e seleziona Test su dati di test e chiudi la finestra popup per segnare le prestazioni del modello classificando le celle nel chip in base alla probabilità che siano metastatiche del cervello da 0 a 1.
  6. Salvare le prestazioni del modello di apprendimento automatico in un file (Tabella 2). Includere l'area sotto la curva (AUC) del ROC, la precisione e il punteggio F1. Salvare un secondo file contenente i singoli indici metastatici e le probabilità di classificazione. Fare doppio clic sull'icona Salva e fare clic su Salva con nome per scrivere in file le probabilità di classificazione. Analogamente, la curva ROC può essere visualizzata facendo doppio clic sull'icona Analisi ROC e le prestazioni del modello possono essere calcolate facendo doppio clic sull'icona Matrice confusione.

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Risultati

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Utilizzando questa tecnica, abbiamo analizzato i tipi di cellule etichettati con diverse proteine fluorescenti o coloranti. Dimostriamo l'uso di questo approccio con un chip mBBN formulato con astrociti hCMEC/D3-DsRed e non fluorescenti. Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali sono state seme su una membrana porosa (5 pori incisi) e collocate in un'incubatrice34 a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2. Dopo tre giorni la confluenza dello strato endoteliale è stata confermata tr...

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Discussione

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Abbiamo sviluppato e presentato un nuovo metodo che adatta gli strumenti spesso utilizzati nelle analisi di imaging clinico per la misurazione della stravasazione e la migrazione delle cellule tumorali attraverso una barriera endoteliale nel tessuto cerebrale. Pongono questo approccio può essere utile sia per le misurazioni in vivo che in vitro; abbiamo dimostrato il suo uso su un sistema microfluidico 3D che ricapitola la vascolatura cerebrale. Le misurazioni delle cellule tumorali, tra cui la distanza stravasata, la pe...

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Dichiarazioni

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Non ci sono divulgazioni da dichiarare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo lo Steeg Lab, del National Cancer Institute per la generosa donazione di cellule MDA-MB-231-BR-GFP. La microscopia confocale è stata eseguita presso l'Istituto Biointerfaces dell'Università del Michigan (BI). La citometria del flusso è stata eseguita presso l'University of Michigan Flow Cytometry Core. I vettori virali sono stati creati dall'Università del Michigan Vector Core. Ringraziamo anche Kelley Kidwell per la guida nell'analisi statistica di questi dati.

Finanziamento:

C.R.O. è stato parzialmente supportato da una NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) e 1R21CA245597-01. T.M.W. è stato parzialmente supportato da 1R21CA245597-01 e dal National Center for Advancing Translational Sciences del National Institutes of Health sotto il numero premio UL1TR002240. Il finanziamento per i materiali e la caratterizzazione è stato fornito dal National Cancer Institute of the National Institutes of Health con il numero premio 1R21CA24597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation e la Breast Cancer Research Foundation. Il contenuto è esclusivamente di competenza degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTA con rosso fenoloThermo Fisher Scientific 25200056
Punzone per biopsia da 1,5 mm con stantuffoIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
Piastre di Petri da 150 mmFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, senza Ca e MgThermo Fisher Scientific14190144
punta per pipetta da 200 mlFisher Scientific02-707-411
wafer di silicone da 4 polliciUniversity Wafer452
nastro da imballaggio largo 48 mmFisher Scientific19-072-097
vetrino da 50 x 75 mmScientific12-550C
Microscopio confocale A1Nikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotico/antimicotico (penicillina/streptomicina/amfotericina)Gibco15240062
Fisher Scientific Forbiciper dissezione NC1721575
Fisher Scientific Fisher Scientific08-951-5
DMEM con 4,5 g/L di glucosioThermo Fisher Scientific11960-044
nastro biadesivoFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Siero fetale bovino, inattivato a caldoCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
fiala di vetroFisher Scientific03-341-25D
glutamax Thermo Fisher Scientific
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamminaThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - fattore di crescita ridotto con rosso fenoloCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 integratore per la crescitaThermo Fisher Scientific17502048
normali astrociti umani (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversità di Lubiana
Pipetta PasteurFisher Scientific13-711-9AM
Maschere per fotolitografiaPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversità del Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversità del Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
membrana in policarbonato, dimensione dei pori 5umMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005sodio di collagene bovino di tipo I
Thermo Fisher Scientific25080094
piruvato di sodioThermo Fisher Scientific11360070
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 sviluppatoreMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro ottilsilanoSigma-Aldrich448931-10G
Fisher Lama per taglierino 35050061 Bicarbonato di Tazza Solo Fisher Scientific NC1416545

Riferimenti

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