Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

Matthew  J. Fischl; Catherine J. C. Weisz

doi:10.3791/61664

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Articolo metodologico

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

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DOI:

10.3791/61664

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18 agosto 2020

Matthew J. Fischl¹ , Catherine J. C. Weisz¹

¹Section on Neuronal Circuitry, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, NIH

In questo articolo

Sommario

L'integrazione di diversi input sinaptici ai neuroni è meglio misurata in una preparazione che preserva tutti i nuclei pre-sinaptici per la tempismo naturale e la plasticità del circuito, ma le fette cerebrali in genere tagliano molte connessioni. Abbiamo sviluppato una fetta cerebrale modificata per imitare l'attività del circuito in vivo mantenendo la capacità di sperimentazione in vitro.

Abstract

Le tecniche di elettrofisiologia a fette in vitro misurano l'attività a singola cellula con una precisa risoluzione elettrica e temporale. Le fette cerebrali devono essere relativamente sottili per visualizzare e accedere correttamente ai neuroni per il bloccaggio delle patch o l'imaging, e l'esame in vitro dei circuiti cerebrali è limitato solo a ciò che è fisicamente presente nella fetta acuta. Per mantenere i benefici della sperimentazione di fette in vitro preservando una porzione maggiore di nuclei presnaptici, abbiamo sviluppato una nuova preparazione di fette. Questa "fetta di cuneo" è stata progettata per le registrazioni di elettrofisiologia patch-clamp per caratterizzare i diversi input monaurali e sound-driven ai neuroni olivocochlear mediali (MOC) nel tronco encefalico. Questi neuroni ricevono i loro input eccitatori e inibitori afferenti primari dai neuroni attivati dagli stimoli nell'orecchio contralaterale e dal corrispondente nucleo cocleare (CN). È stata progettata una fetta cerebrale asimmetrica che è più spessa nel dominio rostro-caudale sul bordo laterale di un emisfero e poi si assottiglia verso il bordo laterale dell'emisfero opposto. Questa fetta contiene, sul lato spesso, la radice nervosa uditiva che trasmette informazioni sugli stimoli uditivi al cervello, sui circuiti NC intrinseci e sia sulle vie afferenti inibitorie disinaptiche che trisintottiche che convergono sui neuroni MOC contralaterali. La registrazione viene eseguita dai neuroni MOC sul lato sottile della fetta, dove vengono visualizzati utilizzando l'ottica DIC per tipici esperimenti patch-clamp. La stimolazione diretta del nervo uditivo viene eseguita mentre entra nel tronco uditivo, consentendo l'attività intrinseca del circuito CN e la plasticità sinaptica a sinapsi a monte dei neuroni MOC. Con questa tecnica, si può imitare l'attivazione del circuito in vivo il più vicino possibile all'interno della fetta. Questa preparazione della fetta di cuneo è applicabile ad altri circuiti cerebrali in cui le analisi dei circuiti beneficeranno della conservazione della connettività a monte e degli input a lungo raggio, in combinazione con i vantaggi tecnici della fisiologia delle fette in vitro.

Introduzione

L'osservazione dell'attività dei circuiti neurali viene eseguita idealmente con input sensoriali e feedback nativi e connettività intatta tra le regioni cerebrali, in vivo. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti che danno una risoluzione a una cellula della funzione del circuito neurale è ancora limitata da sfide tecniche nel cervello intatto. Mentre l'elettrofisiologia extracellulare in vivo o i metodi di imaging multifotonica possono essere utilizzati per studiare l'attività in sistemi nervosi intatti, interpretare come diversi input integrino o misurino gli input sinaptici sottosoglie rimane difficile. Le registrazioni intere cellulari in vivo superano questi limiti....