Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

L'osservazione dell'attività dei circuiti neurali viene eseguita idealmente con input sensoriali e feedback nativi e connettività intatta tra le regioni cerebrali, in vivo. Tuttavia, l'esecuzione di esperimenti che danno una risoluzione a una cellula della funzione del circuito neurale è ancora limitata da sfide tecniche nel cervello intatto. Mentre l'elettrofisiologia extracellulare in vivo o i metodi di imaging multifotonica possono essere utilizzati per studiare l'attività in sistemi nervosi intatti, interpretare come diversi input integrino o misurino gli input sinaptici sottosoglie rimane difficile. Le registrazioni intere cellulari in vivo superano questi limiti ma sono difficili da eseguire, anche nelle regioni cerebrali facilmente accessibili. Le sfide tecniche degli esperimenti di risoluzione a singola cellula sono ulteriormente amplificate in alcune popolazioni neuronali che si trovano in profondità nel cervello, o in popolazioni spazialmente diffuse che richiedono strumenti genetici per localizzare le cellule in vivo (ad esempio, espressione genetica della channelrhodopsina abbinata alla registrazione optrode) o identificazione istochimica post-hoc dopo la registrazione dell'etichettatura del sito (ad esempio con marcatori specifici della neurotrasmissione). Essendo situati diffusamente vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico, i neuroni olivocochlear mediali (MOC) soffrono dei limiti di cui^{sopra 1,}rendendoli estremamente difficili da accedere per la sperimentazione in vivo.

Le fette cerebrali (~100-500 μm di spessore) sono state a lungo utilizzate per studiare i circuiti cerebrali, compresi i circuiti uditivi del tronco encefalico, a causa della segregazione fisica dei neuroni collegati che sono contenuti all'interno della^{stessa fetta 2,3,4,5,6,7,8,9}. Esperimenti che utilizzano fette molto più spesse (>1 mm) sono stati impiegati in altri laboratori per capire come gli input bilaterali si integrano nelle aree del complesso olivario superiore (SOC) tra cui l'oliva mediale^{superiore 10,11}. Queste fette sono state preparate in modo tale che gli assoni del nervo uditivo (AN) sono rimasti intatti all'interno della fetta e sono stati stimolati elettricamente ad avviare il rilascio di neurotrasmettitori sinaptici nel CN, imitando l'attività dei neuroni uditivi di primo ordine mentre rispondevano al suono. Uno dei principali svantaggi di queste fette spesse è la visibilità dei neuroni per le registrazioni elettrofisiofisioche patch-clamp ("patching"). L'applicazione di patch diventa sempre più difficile man mano che i numerosi assoni in quest'area si mielivano con^{l'età di 12,13,14,15}anni, rendendo il tessuto otticamente denso e oscurando i neuroni anche in una tipica, sottile fetta cerebrale. Il nostro obiettivo è quello di creare preparati in vitro che assomiglino più strettamente alla connettività del circuito delle registrazioni in vivo, ma con le capacità di registrazione ad alta produttività e ad alta risoluzione dell'elettrofisiologia patch-clamp guidata visivamente nelle fette cerebrali.

Il nostro laboratorio studia la fisiologia dei neuroni del sistema efferente uditivo, compresi i neuroni MOC. Questi neuroni colinergici forniscono un feedback efferente alla coclea modulando l'attività delle cellule ciliate esterne (OHC)^{16,17,18,19,20}. Studi precedenti hanno dimostrato che questa modulazione gioca un ruolo nel controllo del guadagno nella cochlea^{21,22,23,24,25,26} e protezione dal trauma acustico^{27,28,29,30,31,32,33}. Nei topi, i neuroni MOC si trovano diffusamente nel nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) nel tronco uditivo¹. Il nostro gruppo ha utilizzato la linea di topi ChAT-IRES-Cre incrociata con la linea del mouse tdTomato reporter per colpire i neuroni MOC in fette di tronco encefalico sotto illuminazione epifluorescente. Abbiamo dimostrato che i neuroni MOC ricevono un input inibitoriofferente dal nucleo mediale ipsilaterale del corpo trapezoiato (MNTB), che è eccitato, a sua volta, dagli assoni delle cellule folte globulari (GBC) nel nucleo cocleare conlaterale (CN)^{34,35,36,37,38}. Inoltre, i neuroni MOC probabilmente ricevono il loro input eccitatorio dalle cellule T-stellate nel contralaterale CN^39,40,41. Nel loro insieme, questi studi mostrano che i neuroni MOC ricevono sia input eccitatori che inibitori derivati dallo stesso orecchio (contralaterale). Tuttavia, i neuroni presnaptici, e i loro assoni che convergono sui neuroni MOC, non sono abbastanza vicini l'uno all'altro per essere completamente intatti in una tipica preparazione delle fette coronali. Per indagare come l'integrazione degli input sinaptici ai neuroni MOC influenzi i loro potenziali schemi di fuoco d'azione, con particolare attenzione all'inibizione appena descritta, abbiamo sviluppato una preparazione in cui potremmo stimolare i diversi afferenti ai neuroni MOC da un orecchio nel modo più fisiologicamente realistico possibile, ma con i benefici tecnici degli esperimenti in vitro sulle fette cerebrali.

La fetta di cuneo è una preparazione di fette spesse modificata progettata per lo studio dell'integrazione del circuito nei neuroni MOC (schematizzata nella figura 1A). Sul lato spesso della fetta, il cuneo contiene gli assoni mozzati del nervo uditivo (chiamato "radice nervosa uditivo" di seguito) mentre entrano nel tronco encefalico dalla periferia e dalla sinapsi nel CN. La radice nervosa uditivo può essere stimolata elettricamente per evocare il rilascio di neurotrasmettitori e l'attivazione sinaptica delle cellule del CN^{42completamenteintatto,43,44,45,46}. Questo formato di stimolazione ha diversi vantaggi per l'analisi del circuito. In primo luogo, invece di stimolare direttamente gli assoni T-stellati e GBC che forniscono un input afferente ai neuroni MOC, stimoliamo l'AN per consentire l'attivazione di circuiti intrinseci abbondanti nel CN. Questi circuiti modulano l'uscita dei neuroni CN ai loro obiettivi in tutto il cervello, compresi i neuroni MOC^{46,47,48,49,50,51}. In secondo luogo, l'attivazione polisinaptica di circuiti afferenti dall'AN attraverso il CN a monte dei neuroni MOC consente tempi di attivazione più naturali e la plasticità a queste sinapsi come sarebbero in vivo durante la stimolazione uditivo. In terzo luogo, possiamo variare i nostri modelli di stimolazione per imitare l'attività AN. Infine, sia le proiezioni monoali eccitatorie che inibitorie ai neuroni MOC sono intatte nella fetta di cuneo e la loro integrazione può essere misurata su un neurone MOC con la precisione dell'elettrofisiologia patch-clamp. Nel complesso, questo schema di attivazione fornisce un circuito più intatto ai neuroni MOC rispetto a una tipica preparazione delle fette cerebrali. Questa fetta di cuneo del tronco encefalico può anche essere utilizzata per indagare altre aree uditivi che ricevono input inibitori da MNTB ipsilaterale tra cui l'oliva superiore laterale, il nucleo olivario superiore e l'oliva superiore mediale^{10,11,52,53,54,55,56}. Oltre alla nostra preparazione specifica, questo metodo di affezione può essere utilizzato o modificato per valutare altri sistemi con i vantaggi di mantenere la connettività degli input a lungo raggio e migliorare la visualizzazione dei neuroni per una varietà di tecniche di elettrofisiologia o imaging a risoluzione a singola cellula.

Questo protocollo richiede l'uso di uno stadio o di una piattaforma del vibratomo che può essere inclinato di circa 15°. Qui usiamo uno stadio magnetico a 2 pezzi disponibile in commercio in cui lo "stadio" è un disco metallico con un fondo curvo posto in una "base dello stadio" magnetica concava. Il palco può quindi essere spostato per regolare l'angolo della fetta. I cerchi concentrici sulla base dello stadio vengono utilizzati per stimare l'angolo in modo riproducibile. La base dello stadio e dello stadio è posizionata nella camera di affezione, dove può anche essere ruotata la base dello stadio magnetico.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.

1. Preparazioni sperimentali

NOTA: I dettagli relativi alla preparazione delle fette, tra cui la soluzione di affettare, la temperatura di affezione, la temperatura e l'apparato di incubazione delle fette (ecc.) sono specifici per la preparazione del tronco encefalico eseguita in questo esperimento. I dettagli dell'incubazione delle fette possono essere modificati per esperienza di laboratorio.

1. Preparare soluzioni interne per il bloccaggio delle patch.
   1. Preparare la soluzione di morsetto di tensione contenente (in mM) 76 Cs-metanosulfonato, 56 CsCl, 1 MgCl₂, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na₂-fosfocreatina, 5 QX-314 e 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Regolare il pH a 7,2 con CsOH.
   2. Preparare la soluzione di morsetto corrente contenente (in mM) 125 K-gluconato, 5 KCl, 1 MgCl₂, 0,1 CaCl₂, 10 HEPES, 1 EGTA, 0,3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na₂-fosfocreatina e 0,01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Regolare il pH a 7,2 con KOH.
2. Preparare 100 mL di agar al 4% aggiungendo 4 g di agar a 100 mL di acqua calda (quasi bollente). Posizionare sulla piastra di agitazione riscaldata per mantenere la temperatura e mescolare fino a completa dissoluzione. Versare in piastre petri di plastica da 100 mm a circa 1 cm di profondità e lasciare raffreddare. Conservare in frigorifero fino a quando necessario.
3. Preparare 1 L liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente in mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl₂, 1.3 MgSO₄, 5 KCl, 26 NaHCO₃, 1.25 KH₂PO₄e 10 destrosio. Bolla con carbogeno (5% CO₂ / 95% O₂) per almeno 10 min, quindi regolare il pH finale a 7,4 con 1 M NaOH se necessario. Mantenere l'ossigenazione e il pH della soluzione gorgogliando continuamente con carbogeno durante l'esperimento.
4. Preparare la soluzione di affezione da 200 mL aggiungendo acido cinurenico da 1 mM all'ACSF. Soluzione sonicata in un bagno d'acqua sonicante per 10 minuti fino a quando l'acido cinurenico non viene sciolto. Bollare continuamente con carbogeno e posizionare sul ghiaccio.
   ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale appropriati durante la manipolazione dell'acido cinurenico.
5. Montare una lama appropriata nel vibratomo seguendo le istruzioni del produttore. Raffreddare la camera di affettamento del vibratome circondarla di ghiaccio.

2. Rimozione del cervello con radice nervosa uditivo intatta per la stimolazione

NOTA: I topi per questi esperimenti sono stati ottenuti incrociando topi transgenici ChAT-IRES-Cre su uno sfondo C57BL/6J con topi reporter tdTomato (Ai14). I topi usati per l'istologia e l'elettrofisiologia erano post-udito (P14-P23), che è intorno a P12 nei topi. I neuroni che esprimono tdTomato nel nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) sono stati precedentemente caratterizzati come neuroni MOC in questa linea di topo⁵⁷.

1. Eutanasia (ad esempio asfissia di CO₂₎ e decapitare l'animale utilizzando procedure istituzionali approvate.
2. Usando una lama di rasoio, tagliare la pelle alla linea mediana del cranio dal naso alla parte posteriore del collo. Sbucciare la pelle per esporre il cranio.
3. Usando piccole forbici, fai un'incisione nel cranio attraverso la linea mediana partendo dalla base (estremità caudale vicino al midollo spinale) del cranio e continuando verso il naso.
4. Alla sutura lambda, fare tagli nel cranio dalla linea mediana, laterale verso l'orecchio su entrambi i lati. Sbucciare il cranio per esporre il cervello.
5. A partire dall'estremità rostrale, sollevare delicatamente il cervello lontano dal cranio con una piccola spatola da laboratorio o forcep smussate. Tagliare il nervo ottico e continuare a lavorare delicatamente il cervello all'indietro, esponendo la superficie ventrale.
6. Tagliare i nervi trigeminali pizzicandoli con force sottili vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico.
   NOTA: Fallo con attenzione poiché il nervo vestibulocochlear si trova appena sotto questo e deve essere intatto per un'eventuale stimolazione.
7. Mettere la preparazione in una piastra di Petri di vetro riempita con soluzione di affezione a freddo. Posizionare il piatto al microscopio di sezionamento. Bolla delicatamente con carbogeno.
8. Tagliare il nervo facciale vicino al tronco encefalico ed esporre il nervo vestibulocochlear.
9. Usando forcep fini, spingere le punte nella foramina dove il nervo vestibulocochlear esce il cranio il più lontano possibile e pizzicare il nervo per remarlo, lasciando la radice nervosa attaccata al tronco encefalico. Ripeti questo dall'altra parte.
10. Una volta che entrambe le radici nervose sono libere, rimuovere le meningi e la vascucolatura dalla superficie ventrale del tronco encefalico vicino al corpo trapezoiato.
11. Liberare completamente il cervello dal cranio pizzicando i nervi cranici rimanenti e il tessuto connettivo facendo attenzione a preservare il midollo spinale rimanente, se possibile.

3. Bloccare e montare il cervello sul palco (disco magnetico)

1. Preparare la superficie del cervello per fissarsi allo stadio bloccando il cervello a livello del chiasmo ottico.
   1. Con la superficie ventrale verso l'alto, stabilizzare il cervello usando uno strumento smussato per immobilizzare delicatamente il midollo spinale in modo che il cervello non si inclini durante il passaggio successivo.
   2. A livello del chiasmo ottico, usa le forcep aperte per creare il piano per bloccare il cervello inserendo attraverso il cervello fino al fondo del piatto. Inserire le forcep con un angolo di circa 20° da verticale in modo che le punte escino dalla superficie dorsale del cervello caudale al chiasmo ottico.
   3. Tagliare lungo le forcep usando la lama del rasoio.
2. Incollare il cervello sulla superficie dello stadio.
   1. Preparare un piccolo blocco (~ 1 cm³) del 4% di agar per sostenere il cervello.
   2. Posizionare una piccola goccia di colla sul palco e stenderla in un rettangolo in modo che sia il cervello che il blocco di agar possano essere incollati verso il basso.
   3. Usando le forcep, sollevare con cura il cervello e tamponare delicatamente il liquido in eccesso usando il bordo di un tovagliolo di carta. Posizionare la superficie bloccata sulla colla, la superficie ventrale sarà verso la lama durante l'affettamento.
   4. Spingere delicatamente il blocco di agar contro la superficie dorsale del cervello per sostenerlo durante l'affezione e garantire un corretto posizionamento cerebrale (cioè un angolo).

4. Affettare il cervello per creare una fetta di cuneo

NOTA: Preparare una fetta cerebrale usando il vibratoma che ha la radice nervosa cocleare sul lato spesso e i neuroni olivocochlear mediali (MOC) e il nucleo mediale del corpo trapezoidico (MNTB) sul lato sottile.

1. Posizionare il disco magnetico con il cervello attaccato sulla base del palco e posizionarlo nella camera di affezione con la superficie ventrale del cervello orientata verso la lama.
2. Riempire la camera con soluzione di affettamento ghiacciato e bollare con carbogeno.
3. Abbassare la lama nella soluzione e tagliare le fette caudali nella regione di interesse per assicurarsi che le fette siano simmetriche. Se le fette appaiono asimmetriche, inclinare leggermente lo stadio per ottenere simmetria.
   NOTA: Le velocità della lama tra 0,05-0,10 mm/s sono state efficaci per tagliare fette sane e possono variare a seconda dell'età animale e della regione cerebrale.
4. Una volta che le fette sono simmetriche, spostare lo stadio ~15° (corrispondente a circa 3 anelli concentrici sulla base del palco) su un lato.
   NOTA: spostare lo stage lontano dalla radice del nervo uditivo che si desidera conservare nella sezione.
5. Continuare a affeggiare attentamente fino a quando la radice nervosa udibile è vicina alla superficie su un lato e il nervo facciale può essere visto sulla superficie dell'altro lato.
6. Spostare il palco indietro di 15° nella posizione originale.
7. Allontanare la lama dal tessuto e ruotare la base del palco di 90° in modo che il bordo laterale del lato sottile sia rivolto verso la lama. Abbassare la lama diverse centinaia di micron e quindi portare lentamente la lama vicino al bordo del tessuto. Ripetere questa ripetizione fino a quando la lama non tocca il bordo laterale. Abbassare la lama allo spessore desiderato del bordo sottile della fetta, qui altri duecento micron.
   NOTA: La fetta risultante è idealmente spessa circa 300 mm a livello del nucleo ventrale del corpo trapezoiato (VNTB) sul lato in cui avrà luogo il bloccaggio del cerotto.
8. Allontanare la lama dal tessuto e far girare indietro la base dello stadio in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso di essa.
9. Creare il taglio che designa la superficie rostrale della fetta di cuneo. Trasferire la fetta su un pezzo di carta di interfaccia (1 cm²⁾di superficie caudale verso il basso. Spostare la fetta nella camera di incubazione o in un altro apparecchio di incubazione adatto per il recupero (30 min a 35 °C).
   NOTA: Il nervo facciale deve essere visibile su entrambi gli emisferi della fetta sulla superficie rostrale (vedere figura 1B).

5. Configurazione e registrazione di elettrofisiologia

1. Posizionare la fetta di cuneo nella camera di registrazione e fissare la fetta con un'arpa o un sistema di stabilizzazione. Perfondere continuamente il tessuto ad una velocità di 7-10 mL/min con ACSF caldo (35 °C) bollato con carbogeno.
2. Identificare i neuroni MOC geneticamente etichettati nel VNTB utilizzando l'epifluorescenza con filtri di emissione a 561 nm per registrazioni di patch-clamp. Capovolgere la sezione se non sono disponibili celle potenzialmente patchabili.
3. Utilizzando l'ottica DIC, concentrarsi sulla radice nervosa udibile sul lato spesso della fetta e utilizzare un micromanipolatore per spostare l'elettrodo stimolante del tungsteno bipolare verso la radice del nervo uditivo e delicatamente nella superficie del tessuto.
   NOTA: Gli elettrodi di aspirazione sono stati utilizzati in esperimenti di stimolazione nervosa uditivo in altri laboratori. Gli elettrodi di vetro theta o i metodi di stimolazione ottica possono essere utilizzati se applicabili ad altri preparati specifici.
4. Spostare il campo visivo al VNTB per scegliere un neurone MOC da indirizzare per l'elettrofisiologia del patch clamp.
5. Riempire una pipetta di registrazione con una soluzione interna appropriata per l'esperimento proposto.
6. Patch e registrazione dal neurone MOC nella configurazione a cellule intere. Compensare la capacità della membrana e la resistenza in serie, se necessario.
7. Regolare l'ampiezza della stimolazione elettrica della radice nervosa uditivo per ottenere eventi postinaptici coerenti nel neurone MOC.
   NOTA: Potrebbe essere necessario spostare l'elettrodo di stimolazione.
8. Eseguire protocolli di stimolazione appropriati per osservare le correnti sinaptiche evocate in MOC (morsetto di tensione) o modelli di potenziale d'azione (morsetto di corrente).
   NOTA: La preparazione della fetta di cuneo può essere utilizzata con qualsiasi tipico strumento patch-clamp come registrazioni di patch sciolte, farmacologia, optogenetica, imaging del calcio, disaccamento del neurotrasmettitore, ecc.

6. Conferma istologica dei nuclei del tronco encefalico

NOTA: Questo viene fatto con colorazione viola cresile, in fetta di cuneo fissa e ri sezionata. Questo metodo consente la visualizzazione dei nuclei contenuti nella sezione.

1. Dopo aver preparato una fetta di cuneo, immergere la fetta in fissivo (4% di PFA in PBS) durante la notte. Risciacquare la fetta 3x per 10 minuti in PBS (temperatura ambiente su uno shaker), quindi mettere in saccarosio al 30% in PBS durante la notte a 4 °C per crioproteggere.
2. Ritagliare la fetta su un microtomo di congelamento (40-70 mm) e raccogliere sezioni seriali in una piastra da 24 pozza in PBS.
3. Montare sezioni su vetrini rivestiti di gelatina e lasciare asciugare completamente. Posizionare le diapositive nel carrello scorrevole.
4. Preparare soluzioni di violetta cresile
   1. Preparare l'1% di acetato di violetta cresile mescolando 5 g di acetato di violetta cresile in 500 mL dH₂O
   2. Preparare il tampone di acetato preparando prima la soluzione di 90 mL A (acido acetico glaciale da 540 mL + 89,46 mL dH₂O) e 10 mL soluzione B (136 mg di acetato di sodio in 10 mL dH₂O). Combinare la soluzione A e la soluzione B producendo il buffer di acetato.
   3. Unire l'1% di acetato di violetta cresile con il tampone di acetato 1:1 per lo 0,5% di viola cresile nel tampone di acetato. Filtrare prima dell'uso.
   4. Preparare il 95% e il 70% di etanolo diluire il 100% di etanolo con volumi appropriati di dH₂O
5. Eseguire il protocollo di colorazione viola cresile. Spostare il carrello scorrevole attraverso vassoi di soluzione, gonfiando la soluzione in eccesso su un tovagliolo di carta tra vassoi: xilene - 5 min; 95% di etanolo - 3 min; 70% di etanolo - 3 min; dH₂O – 3 min; Soluzione di viola cresile allo 0,5% - monitoraggio di 8-14 minuti frequentemente fino a quando la colorazione nucleare diventa viola scuro; dH₂O – 3 min; 70% di etanolo - 3 min; 95% di etanolo - 1-2 min; 100% di etanolo - il tuffo scivola due volte; xilene – 5 min; xilene: 25 min fino all'eseguito il montaggio.
   ATTENZIONE: Utilizzare gli xileni solo sotto una cappa aspirante.
6. Rimuovere le diapositive dallo xilene una alla volta e posizionare immediatamente i coperchi sulle diapositive utilizzando il supporto di montaggio. Lasciare asciugare il supporto di montaggio (durante la notte).
7. Sezioni immagine.

7. Etichettatura della biocitina per il tracciamento anterogrado degli assoni nel tessuto vivo e non con prefisso

1. Preparare una fetta di cuneo come sopra (Passaggi 2-4).
2. Trasferire la sezione sulla carta di interfaccia (~1 cm²). Al microscopio di sezionamento, individuare il CN sul lato spesso della fetta.
3. Rimuovere con cura l'ACSF in eccesso dall'area circostante la fetta torcendo un angolo di carta velina per allontanare l'ACSF dal tessuto. Ciò impedisce alla biocitina di diffondersi nelle aree circostanti della fetta che potrebbero portare all'assorbimento nelle cellule al di fuori del NC.
4. Con le forcep fini, selezionare un piccolo cristallo di biocitina e posizionarlo sulla superficie del CN. Premere delicatamente il cristallo nel tessuto per favorire il contatto con i neuroni e il successivo assorbimento nei somata. Ripetere questo passaggio per coprire la regione di interesse desiderata, in questo caso le regioni CN contenenti neuroni T-stellate e GBC.
5. Posizionare la fetta in una camera di incubazione. Lasciare incubare la fetta per 2-4 h a 35 °C per consentire l'assorbimento e il trasporto della biocitina. Dopo l'incubazione, sciacquare la fetta in ACSF per rimuovere eventuali particelle di biocitina.
6. Posizionare la fetta in fissivo (4% di PFA in PBS) durante la notte. Risciacquare 3 volte per 10 minuti in PBS.
7. Crioproteggere la fetta in saccarosio al 30% in PBS durante la notte a 4 °C o fino a quando la fetta non affonda.
8. Resect il tessuto per produrre sezioni trasversali su un microtomo di congelamento a 70-100 mm.
9. Elaborare il tessuto utilizzando metodi immunoistochimici standard con una streptavidina coniugata fluorescentmente.
   NOTA: Ulteriori immunoistochimica possono essere eseguite sulle sezioni se utili per l'etichettatura di corpi cellulari presnaptici, assoni, recettori o altre molecole sinaptiche importanti per la visualizzazione del circuito (cioè, i passaggi degli anticorpi primari non dovrebbero influire negativamente sulla visualizzazione secondaria della biocitina).
10. Immagine del tessuto.

Esame istologico della fetta di cuneo
Per la nostra indagine sulla funzione neuronale del tronco encefalico uditivo, la preparazione della fetta di cuneo è stata progettata per contenere la radice nervosa uditivo e il contralaterale CN ai neuroni MOC destinati alle registrazioni (fetta di esempio mostrata nella figura 1B). L'esame istologico iniziale del preparato è importante per confermare che la fetta contiene i nuclei necessari per l'attivazione del circuito e che le proiezioni assonali sono intatte. Due tipi di cellule all'interno della NC forniscono informazioni sonore ai neuroni MOC. Si ipotizza che le cellule T-stellate forniscano l'input eccitatorio ai neuroni MOC39,40,41,58. Le cellule folte globulari (GBC) eccitano i neuroni MNTB nell'emisfero contralaterale(attraversoil calice specializzato della sinapsi held) 34,36,37,38,59,60 che, a loro volta, forniscono input inibitori ai neuroni MOC57 (figura schematica 1A). Per confermare la presenza sia di cellule T-stellate che di GBC, abbiamo risezionato (a 50 μm) una fetta di cuneo che è stata fissata per immersione nel 4% di PFA ed eseguita colorazione viola cresile per etichettare i somata. Nel lato spesso della fetta di cuneo (Figura 2, emisfero sinistro), il CN era presente quasi nella sua piena estensione rostro-caudale. Inoltre, le suddivisioni dorsale e ventrale della NC erano intatte(Figura 2; freccia e punta di freccia in S19). Neuroni t-stellati e GBC si raggruppano nel nucleo cocleare ventrale vicino a dove ilnervo uditivo( Figura 2 ; freccia in S17) entra nel CN61,62,63,64,65. La fetta di cuneo contiene anche neuroni dei neuroni da ipsilaterale a MOC MNTB da cui vengono eseguite le registrazioni (emisfero sottile della fetta di cuneo originale, lato destro nella Figura 2). Ciò conferma che almeno una parte dell'input inibitorio ai neuroni MOC è intatto(Figura 2, fette 1-15, evidenziato da ovali tratteggiati in S11).

In esperimenti separati, abbiamo confermato che gli assoni e i terminali presnaptici dei neuroni CN erano intatti nella fetta di cuneo usando l'etichettatura anterograda con biocitina. In primo luogo, la fetta di cuneo dal vivo è stata preparata e posizionata sulla carta dell'interfaccia. Subito dopo aver preparato la fetta di cuneo, i cristalli di biocitina sono stati collocati nel CN che ha permesso l'assorbimento e il trasporto anterogrado lungo gli assoni durante un periodo di incubazione. Quindi è stato eseguito il fissaggio e la risezione del tessuto (sezioni da 70 mm). La colorazione di sezioni con streptavidina etichettata fluorescentmente è stata eseguita per visualizzare gli assoni etichettati con la biocitina. Le immagini confocali di queste sezioni mostrano un'etichettatura luminosa nel CN dove i cristalli sono stati posizionati e portati nei corpi cellulari(Figura 3A,emisfero sinistro, area tratteggiata). Gli assoni che uscivano dalla CN lungo la striata acustica ventrale(Figura 3A,punte di freccia bianche) erano chiaramente etichettati e potevano essere seguiti fino ai loro punti di terminazione. I puncta biocitina-positivi che circondano i neuroni MOC contralaterali suggeriscono che la nostra preparazione preserva i contatti sinaptici originati dal NC (Figura 3B). Allo stesso modo, i calici etichettati di Held nell'MNTB contralaterale indicano che gli assoni che si proiettano dai GBC ai neuroni MNTB sono conservati nella fetta di cuneo (Figura 3C). Questi esami istologici confermano che la nostra fetta di cuneo contiene sia i corpi cellulari che le proiezioni assonali dei circuiti di ingresso afferenti ai neuroni MOC, che, quindi, ci consente di misurare le risposte postsinaptiche evocate dalla stimolazione del nervo uditivo e dalla successiva propagazione dell'attività attraverso circuiti ascendenti.

Fisiologia sinaptica a fette di cuneo
L'integrazione di input sinaptici eccitatori e inibitori modella criticamente l'attività neuronale. Di recente abbiamo descritto input inibitori ai neuroni MOC dai neuroni dell'MNTB57, ma l'effetto dell'integrazione di questi input con input eccitatori sull'attività dei neuroni MOC è sconosciuto. In una fetta di cuneo di un topo ChAT-IRES-Cre x tdTomato, sono state eseguite registrazioni di morsetti di tensione da un neurone MOC. La corrente è stata applicata tramite un elettrodo stimolante bipolare del tungsteno guidato da un'unità di isolamento dello stimolo per evocare il rilascio di neurotrasmettitori dagli assoni presnaptici. In primo luogo la striatura acustica ventrale (VAS) alla linea mediana è stata stimolata elettricamente per attivare direttamente gli assoni stellati T e i neuroni MNTB tramite stimolazione dell'assone GBC (Figura 4A), per misurare la latenza alle risposte post-sinaptiche in una configurazione di registrazione che imita i tipici esperimenti a fette sottili(Figura 4B),tracce di esempio, grigio, potenziale di tenuta -60 mV). In esperimenti separati, la radice nervosa uditivo è stata stimolata ad attivare circuiti ascendenti monaurali e le risposte post-sinaptiche sono state misurate ai neuroni MOC come descritto sopra. La stimolazione elettrica in entrambe le località ha evocato un artefatto elettrico veloce seguito da risposte di corrente multipeaked (risposte di esempio dalla stimolazione AN nella figura 4C,tracce nere, potenziale di tenuta -60 mV). Abbiamo confrontato le misure di latenza di esordio della prima corrente postinaptica (PSC) evocata con la stimolazione diretta del VAS con quelle evocate con stimolazione nervosa uditivo e abbiamo trovato una latenza significativamente più lunga per gli eventi di stimolazione AN. Ciò è stato attribuito al ritardo sinaptico subito presso la sinapsi AN/CN (stimolazione AN: 5,27 ± 0,43 ms, deviazione mediana ± mediana assoluta (MAD), intervallo 4,26-5,93 ms, n = 8; Stimolazione VAS: 1,98 ± 0,28 ms, mediana ± MAD, intervallo 0,75-3,46 ms, n = 17; Wilcoxon Signed Ranks Test, p = 0.014, Figura 4D). Questi risultati confermano che la stimolazione della radice nervosa uditivo si traduce nell'attivazione sinaptica dei neuroni CN e nella successiva attività del circuito, rappresentando più da vicino l'in vivo , come la tempistica rispetto alla stimolazione diretta degli assoni T-stellate o GBC/MNTB.

Con la nostra soluzione interna a base di cesio, alta [Cl-] utilizzata in morsetto di tensione, eccitatorio (glutattergico) e inibitorio (GABA e glicenergico) I PSC sono entrambi verso l'interno a riposo del potenziale della membrana (-60 mV) e quindi indistinguibili. Evocando l'attività del circuito nella configurazione stimolante an, abbiamo isolato elettricamente il presunto ingresso inibitorio spostando il potenziale di tenuta a 0 mV, il potenziale approssimativo di inversione per le correnti glutattergiche mediate ampa. Nel nostro neurone di esempio, le risposte di corrente esterna sono state osservate a 0 mV(Figura 4Ci,tracce rosse) indicative di conduzioni di cloruro. È probabile che si tratta di risposte sinaptiche GABA o glicenergiche. Questi dati dimostrano l'utilità della fetta di cuneo per attivare sia gli input eccitatori che inibitori ai neuroni MOC stimolando la radice nervosa uditiva, con attivazione di successivi circuiti afferenti. Inoltre, diversi modelli di risposte post-sinaptiche sono stati evocati dalla stimolazione AN, suggerendo che anche in condizioni di stimolazione identica degli assoni AN, l'attività dell'intero circuito è dinamica e complessa. Questo paradigma sperimentale consente un'analisi dettagliata di come gli stimoli uditivi complessi si propagano attraverso il tronco encefalico e si integrano nei neuroni MOC, determinando l'output del sistema efferente MOC e l'eventuale impatto sulla cocllea.

Figura 1: Immagine schematica e di esempio della fetta a cuneo. (A) Schema del circuito mediale di retroazione olivocochlear. Le frecce blu indicano l'afferente via ascendente verso i neuroni MOC e le frecce nere indicano la via di retroazione discendente dai neuroni MOC alla base delle cellule ciliate esterne (OHC). (B) Immagine brightfield di una fetta di cuneo con etichette della radice nervosa uditivo (ANR) e del nucleo cocleare (contorno tratteggiato) sul lato spesso. L'asterisco indica la posizione approssimativa del nucleo ventrale del corpo trapezoiato in cui i neuroni MOC sono mirati per il bloccaggio del cerotto sul lato sottile della fetta di cuneo. Linee nere tratteggiate indicano i nervi facciali che possono essere visti in entrambi gli emisferi della fetta sulla superficie rostrale. IHC - cellula capillare interna, GBC - cellula folta globulare, SPN - nucleo paraolivariale superiore, MNTB - nucleo mediale del corpo trapezoiato, VNTB - nucleo ventrale del corpo trapezoiato, LSO - oliva superiore laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sezioni macchiate di viola cresile da una fetta di cuneo che è stata ri sezionata a 50 μm. Ogni altra sezione è stata immagine. Le sezioni sono numerate rostrali --> caudali. Le fette di cuneo tendevano a contenere l'intero nucleo cocleare (CN) che includeva sia il CN dorsale (freccia in S19) che il CN ventrale (punta di freccia in S19), la radice del nervo uditivo (punta di freccia aperta in S17) e gran parte dell'MNTB (area scura vicino alla superficie ventrale in S3-S15, evidenziata con ovali tratteggiati in S11). D e V sulla barra di scala rappresentano dorsale e ventrale nell'orientamento della fetta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Gli assoni di input crescente ai neuroni MOC dal nucleo cocleare conlaterale rimangono intatti nella fetta di cuneo. (A) La sezione più rosea di una fetta di cuneo prelevata da un topo P23 ChAT-IRES-Cre x tdTomato (fluorescenza rossa) che è stata ri sezionata (70 μm) ed elaborata per la visualizzazione della biocitina. L'immagine confocale è una pila z di proiezione di massima intensità piastrellata. Gli assoni nella striata acustica ventrale sono evidenziati da punte di freccia bianche. Il contorno tratteggiato indica la piccola porzione del nucleo cocleare che rimane in questa fetta più rostrale. Barra di scala 500 μm. (B) Immagine confocale di un neurone positivo ChAT-IRES-Cre x tdTomato nel VNTB con puncta positiva alla biocitina nel neuropilo circostante. Barra di scala 50 μm. (C) Assoni etichettati biocitina mostrati attraversare la linea mediana e terminare nel contralaterale MNTB come calici di Held. La linea tratteggiata verticale rappresenta la linea mediana della fetta. Barra di scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: La stimolazione elettrica degli ingressi afferenti nel morsetto di tensione produce correnti postsinaptiche multipeak nei neuroni MOC. (A) Schema della fetta di cuneo con set-up di registrazione sia per la stimolazione ventrale acustica (VAS) (elettrodo stimolante grigio) che per la stimolazione del nervo uditivo (AN) (elettrodo stimolante nero) di ingressi afferenti al MOC. (B) Esempi di correnti postsinaptiche (PPC) da un singolo neurone P17 evocate con un singolo stimolo elettrico vicino alla linea mediana a -60 mV. (C) PSC evocati durante la stimolazione AN a -60 mV in un neurone P15. (Ci) Esempi di PSC nella stessa cella di C evocati a 0 mV di potenziale di detenzione (il potenziale approssimativo di inversione per le correnti mediate AMPA nella nostra configurazione di registrazione, rosso). (D) Dati sulla popolazione per la quantificazione della latenza al primo PSC per la stimolazione VAS e AN. Scatole: quartili, inserto di linea: mediana, interno quadrato: media, baffi: deviazione assoluta mediana. * p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.