Dimostrazione di complessi eterologhi formati da proteine di membrana di tipo III residenti in Golgi utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa

Sommario

Il protocollo qui presentato ha lo scopo di dimostrare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi con N- e/o C-termini esposti citoplasmaticamente in cellule di mammifero vive utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di esplorare l'applicabilità della variante più recente della complementazione della luciferasi divisa per dimostrare complessi eterologhi formati da trasportatori di zucchero nucleotidici (NST). Queste proteine multitransmembrana residenti in ER e Golgi trasportano gli zuccheri nucleotidici sintetizzati citoplasmaticamente attraverso le membrane degli organelli per fornire enzimi che mediano la glicosilazione con i loro substrati. Gli NST esistono come dimeri e/o oligomeri superiori. Sono state riportate anche interazioni eterologhe tra diversi NST. Per verificare se la tecnica è adatta per studiare il fenomeno dell'eteromerizzazione NST, l'abbiamo testata contro una combinazione dei due NST residenti a Golgi che hanno precedentemente dimostrato di associarsi con diversi altri mezzi. Il test di complementazione della luciferasi sembra essere particolarmente adatto per studiare le interazioni tra proteine di membrana residenti nel Golgi, in quanto non richiede alti livelli di espressione, che spesso innescano l'errata localizzazione delle proteine e aumentano il rischio di falsi positivi.

Introduzione

Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per verificare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti nel Golgi in cellule umane trasfettate transitoriamente utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa. La procedura è stata ampiamente testata contro i trasportatori di zucchero nucleotidici (NST), ma siamo stati anche in grado di ottenere risultati positivi per altre proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi i cui N- e / o C-termini sono rivolti verso il citoplasma.

Il nostro gruppo di ricerca esplora il ruolo degli NST nella glicosilazi....

Protocollo

1. Generazione di plasmidi di espressione

1. Esaminare la topologia di membrana delle proteine di interesse utilizzando uno strumento di previsione della topologia.
2. Progettare la strategia di clonazione in modo che i frammenti più grandi e più piccoli affrontino il citoplasma una volta che le proteine di fusione sono state inserite nelle membrane di Golgi. Se, come nel caso qui presentato, sia N- che C-termini delle proteine di interesse sono orientati citoplasmaticamente, etichettare le proteine in otto modi possibili (vedi Figura 1B). Se N- o C-terminus di una o entrambe le proteine di interesse è orientato luminalmente....

Risultati

Per ottenere i dati più affidabili in questo approccio è necessario testare tutte le possibili combinazioni (vedere la Figura 1). Parallelamente, dovrebbero essere inclusi controlli positivi e negativi. Il controllo positivo dovrebbe consistere nelle due proteine che sono note per interagire, di cui una è fusa con il frammento più grande e l'altra è fusa con il frammento più piccolo. Il controllo negativo idealmente dovrebbe consistere nelle due proteine di membrana di tipo III non interagen.......

Discussione

Qui forniamo un protocollo dettagliato che consente la dimostrazione di complessi eterologhi formati tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi, come le NST, utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa. L'approccio proposto all'analisi e all'interpretazione dei dati prevede di mettere in relazione la luminescenza ottenuta per la combinazione proteica di interesse con la luminescenza ottenuta per la corrispondente combinazione di controllo, che è composta da una delle proteine di interesse .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			di tripsina-EDTA allo 0,25%
Linea
BioCoat Poly-D-Lysine 96 pozzetti Micropiastra trattata con TC a fondo piatto bianco/trasparente, con coperchio	Corning	356651
Centrifuga
Integratori per colture cellulari (siero fetale bovino inattivato termicamente, L-glutammina, penicillina, incubatrice per streptamicina)
CO2
Terreno di coltura dedicato alla linea cellulare utilizzata
Materiali e reagenti per il clonaggio molecolare standard (batteri, polimerasi termostabile, enzimi di restrizione, DNA ligasi, materiali e reagenti per la purificazione degli acidi nucleici)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	Questo kit contiene vettori che consentono di marcare le proteine di interesse con frammenti di NanoBiT a diversi orientamenti, nonché il plasmide di controllo che codifica per la proteina HaloTag fusa con SmBiT e una coppia di plasmidi di controllo positivo.
Sistema di analisi per cellule vive Nano-Glo	Promega	N2011	Questo kit contiene furimazina, che è un substrato che consente di rilevare l'attività di NanoLuc nelle cellule viventi, e un tampone di diluizione dedicato.
Opti-MEM I Siero a Ridotto Terreno, senza rosso fenolo	Gibco	11058021
Agitatore
Software per l'analisi dei dati (ad es. GraphPad Prism)
Termociclatore

Soluzione cellulare aderente per mammiferiper colture cellulari Plasmidi di espressione che codificano per proteine di interesse non marcate con frammenti NanoBiT Reagente di trasfezione FuGENE HD Promega E2311 Lettore di micropiastre GloMax Discover (o un lettore di micropiastre a luminescenza diverso)Promega GM3000 Oribital