Articolo metodologico
Questo protocollo presenta il saggio di germinazione coroide, un modello ex vivo di proliferazione microvascolare. Questo saggio può essere utilizzato per valutare le vie coinvolte nei micro vasi cororoidali proliferano e valutare i trattamenti farmacologici utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.
L'angiogenesi coroiroidale patologica, una caratteristica saliente della degenerazione maculare legata all'età, porta a compromissione della vista e cecità. I test di proliferazione delle cellule endoteliali (CE) che utilizzano cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) o EC retiniche primarie isolate sono ampiamente utilizzati modelli in vitro per studiare l'angiogenesi retinica. Tuttavia, isolare le cellule endoteliali retiniche murine pure è tecnicamente impegnativo e gli EC retinali possono avere risposte di proliferazione diverse rispetto alle cellule endoteliali coroidiali e alle diverse interazioni cellula/cellula. È stato sviluppato un saggio di germinazione coroidea ex vivo altamente riproducibile come modello di proliferazione microvascolare coroiroidale. Questo modello include l'interazione tra vascucolatura coroide (EC, macrofagi, periciti) e epitelio pigmentato retinico (RPE). Gli espianto di topo RPE/coroide/sclerale sono isolati e incubati nell'estratto di membrana basale (BME) ridotto dal fattore di crescita (giorno 0). Il mezzo viene cambiato a giorni diversi e la germinazione coroide viene quantificata al giorno 6. Le immagini dei singoli espianto coroide vengono scattate con un microscopio a fase invertita e l'area di germogliazione viene quantificata utilizzando un plug-in macro semi-automatizzato al software ImageJ sviluppato in questo laboratorio. Questo saggio di germinazione coroidea ex vivo riproducibile può essere utilizzato per valutare i composti per il potenziale trattamento e per la ricerca sulle malattie microvascolari per valutare le vie coinvolte nella proliferazione dei micro recipienti coroidiali utilizzando tipi selvatici e tessuti di topo geneticamente modificati.
La disregolazione dell'angiogenesi coroiroidale è associata alla degenerazione maculare neovascolare legata all'età (AMD)1. La coroide è un letto microvascolare presente sotto l'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato dimostrato che il flusso sanguigno ridotto nella coroide è associato alla progressione dell'AMD2. L'intricata relazione tra endotelio vascolare, RPE, macrofagi, periciti e altre cellule è responsabile dell'omeostasi del tessuto3,4,5. Pertanto, un microambiente coroideo riproducibile che modella il test è fondam....
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Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Boston Children's Hospital (protocollo ARCH numero 19-04-3913R).
1. Preparazione
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Confronto della crescita della germogliazione coroide al giorno
Abbiamo sezionato la coroide con sclera, incorporata nel BME e coltivata per 6 giorni(Figura 1). La coroide che germoglia nei topi C57BL/6J dal giorno 3 al giorno 6 è stata esaminata con un microscopio e quantificata con SWIFT-Choroid un metodo di quantificazione semi-automatizzato in ImageJ. In un caso rappresentativo, la superficie di germogliazione coroioidea (i recipienti che si e.......
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Il saggio di germinazione coroidea aiuta la ricerca in AMD neovascolare9,10,18,19,20. Le espianto coroide possono essere isolate dai topi, dai ratti e dagli esseriumani 17,21. L'espianto coroide comprende EC, macrofagi e periciti17. In questo saggio l'interazione tra ec coroidia.......
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Gli autori non hanno informazioni finanziarie. Il metodo informatizzato è disponibile gratuitamente per gli istituti accademici attraverso gli autori.
Il lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), del Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, della Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, del BCH Pilot Award, della BCH Manton Center Fellowship e della Little Giraffe Foundation (ZF), della German Research Foundation (DFG; a BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AnaSed (Xilazina) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Estratto di membrana basale (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Piatto per coltura cellulare | NEST | 704001 | 10cm |
| Terreno classico completo con siero e | sistemi cellulari | 4Z0-500 | |
| Alcool etilico 200 Proof | Pharmco | 111000200 | utilizzare per il 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscopio | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillina/Streptomicina | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Piastra per coltura tissutale (24 pozzetti) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamina) | AKORN | 59399-114-10 |
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