Articolo metodologico

Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

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DOI:

10.3791/61679

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4 dicembre 2020

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1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo i protocolli per eseguire l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori chemioattrattari nei neutrofili zebrafish

Abstract

La guida dei leucociti da parte di gradienti chimici è essenziale per le risposte immunitarie. I neutrofili sono le prime cellule ad essere reclutate in siti di danno tissutale dove eseguono funzioni antimicrobiche cruciali. Il loro traffico verso questi loci è orchestrato da diversi chemioattrattivi infiammatori, tra cui le chemochine. A livello molecolare, la segnalazione chemioattrattante è regolata dal traffico intracellulare dei recettori corrispondenti. Tuttavia, non è chiaro come i cambiamenti subcellulari nei recettori delle chemochine influenzino le dinamiche di migrazione dei leucociti a livello cellulare e tissutale. Qui descriviamo una metodologia per l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori delle chemochine nei neutrofili durante le risposte infiammatorie al danno tissutale. Questi strumenti hanno rivelato che il traffico differenziale del recettore delle chemochine nei neutrofili del pesce zebra coordina il raggruppamento e la dispersione dei neutrofili nei siti di danno tissutale. Ciò ha implicazioni per la nostra comprensione di come le risposte infiammatorie sono auto-risolte. Gli strumenti descritti potrebbero essere utilizzati per comprendere i modelli di migrazione dei neutrofili in una varietà di contesti fisiologici e patologici e la metodologia potrebbe essere estesa ad altri recettori di segnalazione.

Introduzione

La migrazione dei leucociti è di fondamentale importanza per le risposte immunitarie. Le cellule immunitarie sono cellule migratorie prototipiche, che sono notevolmente in grado di attraversare tessuti e vasi sanguigni e di percepire una serie di segnali di guida chimica per migrare direzionalmente verso microbi o altre cellule ospiti importanti. Una guida corretta si basa sul riconoscimento dei chemioattrattivi, tra cui le chemochine rappresentano la categoria1 più importante. Le chemochine sono riconosciute da recettori accoppiati a sette proteine G transmembrana altamente specifici. Al momento del legame con le chemochine, i recettori delle chemochine cambiano conformazione portando all'attivazione delle proteine G trimeriche associate e alla loro dissociazione in subunità di segnalazione funzionale che promuovono i cambiamenti citoscheletrici e la migrazione diretta1. Secondariamente, i recettori delle chemochine sono fosforilati e questa modifica porta alla desensibilizzazione all'attrattivo, che può essere seguita da una rapida risensibilizzazione / riciclaggio o degradazione intracellulare e down-regolazione dalla superficie cellulare2. Queste dinamiche dei recettori influenzano la durata e la dose di segnalazione ricevuta dalle cellule, ma il modo in cui influenzano il comportamento di migrazione dei leucociti è stato difficile da chiarire in vivo.

Il monitoraggio delle dinamiche dei recettori nei leucociti vivi nei sistemi tradizionali dei mammiferi deve affrontare diverse sfide. Per gli studi dal vivo, le fusioni di recettori con proteine fluorescenti devono essere espresse nelle cellule. Questo è difficile nei leucociti primari, in particolare nei neutrofili, e gli studi finora hanno utilizzato linee cellulari neutrofile surrogate per esprimere i recettori delle chemochine 3,4. La generazione di modelli murini transgenici, in cui i leucociti esprimono un recettore fluorescente o recettori mutanti con difetti di traffico informativo 5,6, comporta un notevole investimento di tempo e risorse. Anche in questi casi, la risoluzione e il contrasto di imaging per le dinamiche dei recettori di imaging nell'animale vivo possono essere limitati e gli studi hanno utilizzato l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse5. Date queste sfide tecniche, la nostra comprensione di come le dinamiche dei recettori chemioattrattivi influenzano il comportamento cellulare in un ambiente di tessuto vivo è attualmente limitata.

Qui forniamo una metodologia per monitorare il traffico di recettori nei neutrofili zebrafish. I pesci zebra sono geneticamente trattabili, come i topi, ma la transgenesi è relativamente più semplice attraverso l'uso di sistemi di trasposoni efficienti e la manipolazione diretta dello zigote7. La larva trasparente è idealmente suscettibile di imaging. Le dinamiche del recettore delle chemochine sono state visualizzate nelle cellule germinali primordiali e nella linea laterale primordium mediante espressione di fusioni corrispondenti con reporter fluorescenti 8,9,10. Le larve di zebrafish sono dotate di neutrofili maturi che hanno proprietà genetiche e cellulari altamente conservate rispetto ai neutrofili dei mammiferi. Le dinamiche di segnalazione subcellulare come la dinamica citoscheletrica e i regolatori di polarità sono stati visualizzati in queste cellule mediante la generazione di corrispondenti linee transgeniche 11,12,13. Recentemente, abbiamo visualizzato e analizzato funzionalmente le dinamiche del recettore delle chemochine nei neutrofili durante il corso delle risposte infiammatorie al danno tissutale14. Qui, descriviamo la generazione di linee reporter transgeniche per la segnalazione di chemochine nei neutrofili, la preparazione di embrioni per l'imaging dal vivo, un test delle ferite per lo studio della segnalazione dei neutrofili e il protocollo per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Forniamo anche un protocollo laterale per testare le risposte dei recettori delle chemochine ai ligandi candidati, che è utile quando si cerca di stabilire modelli di riconoscimento dei ligandi in recettori non caratterizzati. Queste tecniche possono essere utilizzate in combinazione con ulteriori manipolazioni genetiche, come l'inibizione dell'espressione di chemochine endogene o la generazione di recettori mutanti con traffico alterato indotto dal ligando, per interrogarsi su come specifiche dinamiche di segnalazione influenzano il comportamento dei leucociti in vivo. Le linee transgeniche che esprimono recettori delle chemochine marcati fluorescentemente possono anche essere utilizzate come reporter per gradienti di chemochine endogene, che sono altrimenti difficili da rilevare mediante colorazione diretta degli anticorpi. La metodologia descritta fornisce la possibilità di espandere la generazione di reporter ad altri recettori di immuno-segnalazione.

Protocollo

NOTA: Tutti i pesci zebra sono stati tenuti secondo le linee guida ARRIVE e i regolamenti del Ministero degli Interni del Regno Unito, UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Generazione di larve di zebrafish reporter transgenico per il traffico di recettori di imaging nei leucociti

  1. Generare un costrutto basato su Tol2 per l'espressione specifica del tessuto del recettore di interesse con tag fluorescenti. Per i neutrofili, utilizzare sequenze di promotori dal lisozima C15 e dal gene della mieloperossidasi16. Il costrutto può essere progettato come una fusione con una singola proteina fluorescente (ad esempio GFP), un timer fluorescente tandem (ad esempio, una GFP a ripiegamento rapido e un tagRFP 8,14,17 a maturazione più lenta) o un'espressione bicistronica della GFP reporter e un marcatore a membrana di controllo9 (vedere Discussione per considerazioni sulla scelta dell'approccio).
    NOTA: Questo costrutto non ricapitola i livelli endogeni di espressione del recettore ma è utile per ottenere un alto livello di espressione del recettore nel tipo di cellula di interesse. Consultare la letteratura sui recettori simili 3,5,6,8,9,10,14 per decidere la posizione del tag fluorescente.
  2. Allestire un serbatoio contenente maschi e femmine adulti di tipo selvatico seguendo le pratiche di allevamento standard18, separate da una barriera il giorno prima della deposizione delle uova.
  3. Il giorno della deposizione delle uova, preparare una miscela di transgenesi per la microiniezione contenente 12,5 ng/μL di costrutto di DNA Tol2 e 17,5 ng/μL di mRNA di trasposasi7. Sollevare le barriere dalle vasche dei pesci poco dopo l'arrivo delle luci al mattino (questo può variare in diverse strutture per i pesci) e raccogliere le uova entro 15 minuti per l'iniezione di mRNA.
    NOTA: Assicurarsi che la soluzione di DNA sia priva di RNasi per evitare la degradazione dell'mRNA della trasposasi nella miscela. Un'opzione per aggirare questo è quella di iniettare uova con soluzioni separate di Costruzione e trasposasi di Tol2.
  4. Seguire i protocolli standard per la transgenesi e la microiniezione di uova di zebrafish19.
  5. Iniettare 1 nL della soluzione nella cellula di embrioni a stadio unicellulare.
    NOTA: i risultati dell'espressione sono più coerenti quando si inietta all'interno della cellula e si scartano le iniezioni che potrebbero non essere chiaramente all'interno della cellula. Gli embrioni a stadio unicellulare sono destinati a causa della variabilità dell'iniezione di volume per cellula quando si iniettano embrioni in stadio 2-16. Un'opzione sarebbe quella di separare le iniezioni in stadio monocellulare da lotti di iniezioni successive, nel caso in cui queste abbiano efficacie diverse.
  6. Controllare gli embrioni iniettati nel corso della giornata e rimuovere le uova non fecondate o morte per mantenere sana la frizione.
  7. A 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), schermare le larve al microscopio fluorescente. Il marcatore sarà visibile nei neutrofili, in particolare nel tessuto ematopoietico caudale (CHT), che è ricco di queste cellule.
    NOTA: La percentuale di cellule etichettate varia con diversi costrutti, ma di solito ci si aspetta che il 20-60% dei neutrofili esprima il costrutto. Percentuali più basse di solito predicono più screening nella fase adulta. È buona norma verificare anche la corretta localizzazione del recettore alla membrana, con un approccio di imaging ad alta risoluzione, in un campione di questi embrioni prima di far crescere il pesce.
  8. Coltiva larve positive seguendo le pratiche di allevamento standard20. Questi rappresentano la generazione F0.
  9. A 3 mesi di età, schermo F0 pesce per i fondatori. Incrocia i singoli pesci con un tipo selvatico non transgenico e scherma la loro prole a 3 dpf per l'espressione del recettore osservando sotto l'ambito di dissezione. A seconda del successo della transgenesi, che varia con ogni costrutto, osservare una percentuale di prole positiva in un sottoinsieme delle croci.
    NOTA: Per una buona transgenesi, circa un terzo o la metà degli adulti darà una prole positiva. La percentuale di prole che è positiva in una frizione varia con il numero di copie di transgeni inseriti e, può essere compresa tra il 10-60%. È utile tenere traccia dei rapporti mendeliani all'interno delle frizioni per identificare i transgenici a inserzione singola (questi sono più facilmente identificabili nelle frizioni F2 cercando un rapporto del 50% di larve positive)20.
  10. Coltiva la prole positiva, che rappresenta la generazione F1.
  11. A 3 mesi di età, schermare gli adulti F1 allo stesso modo per stabilire una linea transgenica F2 stabile.
  12. Eseguire esperimenti sulle larve F2 dopo aver convalidato l'espressione neutrofila-specifica del transgene.
    NOTA: Durante la transgenesi, si possono osservare diversi livelli di espressione del recettore ed è consigliabile mantenere diverse frizioni transgeniche per ottenere il livello di espressione più appropriato per le questioni biologiche. I primi risultati possono essere ottenuti in larve F0 o F1.

2. Raccolta di embrioni di zebrafish per valutare le risposte delle ferite leucocitarie

  1. Dopo aver stabilito una linea di reporter transgenica stabile, impostare un incrocio tra pesci transgenici adulti e femmine e raccogliere le uova la mattina successiva.
  2. Far crescere embrioni a 28,5 °C in mezzo E3 (o acqua di uova18).
  3. Opzionalmente, a 24 HPF, incubare gli embrioni in un tubo centrifugo contenente 50 ml di mezzo E3 integrato con candeggina allo 0,003% per 5 minuti. Successivamente risciacquare 3 volte in mezzo E3 lasciando riposare il tubo per un paio di minuti per consentire agli embrioni di depositarsi sul fondo e quindi decantare e sostituire il mezzo.
    NOTA: Questo fornisce un livello di controllo sull'esposizione all'infezione delle larve, che può influenzare il comportamento dei leucociti durante la ferita.
  4. Dopo lo sbiancamento, mantenere gli embrioni in mezzo E3 integrato con lo 0,003% di 1-fenil-2-tiourea per prevenire la sintesi della melanina. Il blu di metilene, che viene spesso utilizzato per prevenire le infezioni fungine, non viene aggiunto qui, per ridurre al minimo l'autofluorescenza dei tessuti.
  5. Lasciare che le larve si schiudano naturalmente e utilizzare a 3 dpf quando i neutrofili sono abbondanti21.

3. Ferimento delle pinne ventrali delle larve

  1. Preparare le larve per la ferita. Utilizzare le larve a 2,5-3,5 dpf, quando si osservano abbondanti neutrofili. Trasferire le larve al mezzo E3 integrato con 160-200 mg / L di tricaina MS222.
    NOTA: Le soluzioni concentrate di tricaina devono essere preparate e congelate in aliquote in anticipo e scongelate il giorno stesso.
  2. Lasciare le larve in mezzo E3 + tricaina per 15 minuti per assicurarsi che siano anestetizzate. Controlla le loro risposte toccando delicatamente con un piccolo pennello o uno strumento simile.
  3. Selezionare le larve con espressione del recettore transgenico sotto un ambito di dissezione fluorescente.
  4. Trasferire le larve in una capsula di Petri da 120 mm in E3 + tricaina per la ferita. Usando un bisturi sterile tagliare la pinna ventrale della larva, mentre si osserva sotto il cannocchiale di dissezione (Figura 1).
    NOTA: L'idea è quella di eseguire un taglio abbastanza profondo da causare un sostanziale reclutamento di neutrofili ma senza tagliare i vasi del CHT. Il taglio è fatto perpendicolarmente all'asse CHT in modo tale che l'incisione raggiunga quasi i vasi del CHT. Questo richiede un po 'di pratica e dovrebbe prima essere eseguito con la supervisione su larve che non vengono generate per questo scopo (ad esempio, larve in eccesso da un altro esperimento).

4. Preparazione delle larve per l'imaging dal vivo

  1. Sciogliere l'agarosio a basso punto di fusione (LMP) nel mezzo E3 riscaldando per ottenere una soluzione liquida di agarosio al 2%.
  2. Lasciare raffreddare questa soluzione a 60 °C.
    NOTA: Tenere un matraccio o un tubo con agarosio in un'incubatrice a 60 °C per evitare l'impostazione dell'agarosio tra il montaggio di diverse larve.
  3. Pipetta 0,5 mL del liquido LMP + E3 in una parabola con fondo di vetro per l'imaging al microscopio.
  4. Pipettare una larva di zebrafish ferita e anestetizzata insieme a 0,5 ml di E3 + 2x Tricaina nel piatto di fondo di vetro.
  5. Mescolare delicatamente le due soluzioni per ottenere una soluzione di agarosio/E3 di Tricaina all'1%, evitando la generazione di bolle. Orientare l'embrione lateralmente e spingere delicatamente verso il basso in modo che la parte caudale del pesce sia il più vicino possibile al vetro.
    NOTA: il tessuto da fotografare deve essere il più vicino possibile al fondo di vetro durante l'imaging con un microscopio invertito. L'impostazione dell'orientamento per la larva deve essere rapida in modo che l'agarosio non si fissi prima che la larva sia posizionata.
  6. Lasciare raffreddare la soluzione di agarosio e solidificare per 5-10 minuti. Verificare se l'agarosio è impostato toccando delicatamente il gel di agarosio con un piccolo pennello o una punta.
  7. Una volta che l'agarosio è solido, aggiungere 2 ml di E3 integrato con 0,2 mg/mL di tricaina alla piastra di imaging.

5. Imaging confocale dal vivo

NOTA: Embrioni di immagini su un microscopio confocale a disco rotante o equivalente (Figura 2). È possibile utilizzare anche un microscopio a scansione laser, ma la risoluzione temporale della dinamica sarà più limitante. Preparare le impostazioni di imaging prima di portare la larva ferita, in modo che la risposta possa essere ripresa il più rapidamente possibile dopo la ferita. I neutrofili arrivano alla ferita entro 5 minuti e i recettori nelle prime cellule in arrivo possono internalizzarsi entro questo lasso di tempo. Con la pratica è possibile fotografare già 15 minuti dopo l'infortunio.

  1. Accendere il microscopio: laser, fotocamera e computer secondo le istruzioni del produttore.
  2. Utilizzare il software di acquisizione per configurare le impostazioni di imaging. Scegli i laser per i fluorofori appropriati e i tempi di esposizione approssimativi in base a esperimenti precedenti (acquisisci GFP con 488 nm e tagRFP con laser a 561 nm).
  3. Trasferire la piastra con l'embrione montato, il più presto possibile dopo il set di agarosio, sulla piattaforma del disco rotante di imaging confocale.
  4. Usa l'oculare del microscopio per trovare il pesce nel piatto usando il joystick da palcoscenico.
  5. Concentrati sull'area della ferita, usando la manopola di messa a fuoco.
    NOTA: Per trovare l'area di interesse potrebbe essere più facile utilizzare un obiettivo ad aria a basso ingrandimento (10x).
  6. Seleziona il campo da visualizzare intorno alla ferita. Utilizzare un obiettivo 30x/40x con apertura numerica elevata per ottenere una risoluzione sufficiente.
  7. Utilizzare i pulsanti software per regolare il tempo di esposizione in modo che il marcatore fluorescente possa essere visto con un buon contrasto ma senza saturare il segnale.
    NOTA: il tempo di esposizione deve essere il più basso possibile per ridurre al minimo l'esposizione fluorescente e massimizzare la risoluzione temporale nel time-lapse. La potenza del laser dipende dalle condizioni del laser, ma deve essere regolata a un livello che consenta un tempo di esposizione sufficientemente basso per l'imaging dinamico.
  8. Utilizzare i pulsanti software per selezionare il volume da visualizzare come z-stack
  9. Imposta un time lapse ogni 30 s per la durata desiderata.
    NOTA: Per le ferite sterili delle pinne ventrali, il reclutamento massimo è osservato da 2-3 ore.
  10. Prima di avviare il time-lapse, scatta un'istantanea del campo luminoso per documentare il campo visivo. Se possibile, acquisire un campo luminoso all'interno del filmato time-lapse.

6. Quantificazione dell'internalizzazione del recettore nei neutrofili zebrafish

  1. Registrare l'intervallo di tempo di acquisizione dell'immagine e la dimensione in pixel dell'immagine. Tieni un registro di quanti minuti dopo l'avvolgimento dell'imaging è iniziato.
  2. Apri i set di dati di immagini utilizzando Fiji trascinando l'immagine sull'interfaccia del software, seleziona un fotogramma rappresentativo di interesse per ciascun set di dati utilizzando il cursore temporale, ad esempio a 1-1,5 ore dopo il ferimento, e salvalo.
  3. Procedere con MATLAB per elaborare il set di dati dell'immagine.
  4. Creare un nuovo script e includere funzioni per la lettura delle immagini (riga 6 nello script chiamato 'select_neutrophils.m' per la definizione del centroide nel file supplementare 1), l'apertura (riga 11 nel file supplementare 1) e la selezione manuale dei punti sull'immagine (riga 12 nel file supplementare 1).
  5. Apri il frame di interesse eseguendo questo script (file supplementare 1), identifica i neutrofili da analizzare mediante ispezione visiva, fai clic su di essi e registra una stima dei loro centroidi, sia nella ferita della pinna ventrale che nel CHT.
    NOTA: I neutrofili non mobilizzati nel CHT servono come riferimento interno per i neutrofili la cui distribuzione del recettore rimane costante. Ciò consente la normalizzazione dei valori di contrasto delle cellule nella ferita a un riferimento interno.
  6. Procedere con la segmentazione dei neutrofili in ogni fotogramma utilizzando la tecnica dei contorni attivi22 come descritto nei passaggi seguenti.
  7. Creare una funzione per includere i metadati necessari per la segmentazione in base ai contorni attivi (ad esempio, numero di iterazioni, distorsione del contorno, centroide stimato ecc.) 22 (v. «dati sulle ferite.m» nel fascicolo complementare 2).
  8. Creare uno script che chiami la funzione 'wound_data.m' per inserire le informazioni necessarie per la segmentazione di ciascun neutrofilo (riga 28 nello script chiamato 'calc_contrast.m' nel file supplementare 3).
  9. Includere nello script i comandi per la lettura delle immagini (riga 32 nel file supplementare 3).
  10. Aggiungi la generazione di un'immagine nera (cioè un'immagine in cui i valori dei pixel sono zeri) con una dimensione uguale all'immagine di input (riga 44 nel file supplementare 3) e la definizione di un quadrato di 10 × 10 pixel attorno al centroide di ciascun neutrofilo (riga 45 nel file supplementare 3).
  11. Includere la segmentazione dei neutrofili utilizzando contorni attivi (righe 48-49 nel file supplementare 3) e la rimozione di piccoli oggetti falsi rilevati (riga 52 nel file supplementare 3).
    NOTA: il contorno di segmentazione iniziale è il quadrato attorno al centroide, che si evolve con la tecnica del contorno attivo in base alle intensità dei pixel, al numero di iterazioni e alla distorsione del contorno. Il risultato della segmentazione è una maschera binaria in cui tutti i pixel hanno valore 0 a parte l'area neutrofila i cui pixel hanno valore 1.
  12. Includi la moltiplicazione dell'immagine binaria segmentata con quella originale per ottenere solo le intensità dei pixel del neutrofilo, con il resto dell'immagine che non è un numero, quindi non contribuisce ai calcoli (righe 56-57 nel file supplementare 3).
  13. Aggiungere il calcolo della matrice di co-occorrenza a livello di grigio per ciascun neutrofilo (GLCM)14,23 (riga 61 nel file supplementare 3). GLCM è un'altra rappresentazione dell'immagine che mostra la posizione relativa dei pixel in termini di intensità dei pixel.
  14. Includere il calcolo del contrasto del neutrofilo basato sul GLCM (righe 62,65 nel file supplementare 3). La metrica di contrasto misura le differenze di intensità tra i pixel vicini. I pixel vengono confrontati con i pixel a una certa distanza, che può essere regolata empiricamente in base alla dimensione dei picchi locali di intensità. A titolo indicativo, per le immagini, con una dimensione in pixel di 0,389 μm, quando il recettore mostrava distribuzione vescicolare ogni punto luminoso era nell'intervallo di 5 pixel. Pertanto, le intensità sono state confrontate in pixel distanziati di 5 pixel l'uno dall'altro.
  15. Aggiungere comandi per salvare i valori separatamente per i singoli neutrofili nella pinna ventrale (riga 68 nel file supplementare 3).
  16. Includere il calcolo del valore medio di contrasto dei neutrofili da tutti i neutrofili CHT allo stesso modo dei neutrofili nella ferita (righe 72-119 nel file supplementare 3). Per i neutrofili CHT, chiamare la funzione 'cht_data.m' (riga 77 nel file supplementare 4).
  17. Includere la normalizzazione del valore di contrasto dei singoli neutrofili alla ferita al contrasto medio dei neutrofili CHT calcolato sopra nel passaggio 6.16 (cioè divisione) (riga 122 nel file supplementare 3). Questo dà un contrasto normalizzato che riflette quanto sia "punteggiato" l'aspetto del recettore nelle singole cellule che rispondono rispetto alle cellule che non rispondono al controllo (Figura 3 e Figura 4).
  18. Eseguire lo script (file supplementare 3) facendo clic sul simbolo di esecuzione nel software.
  19. Ripeti tutti i passaggi per condizioni diverse.
  20. Utilizzare un software statistico (vedere Tabella dei materiali) per importare i risultati per le diverse condizioni creando una tabella a colonne, tracciare i risultati ed eseguire test statistici per verificare la significatività della differenza tra i valori medi.
    NOTA: i codici per l'analisi sono disponibili anche in GitHub all'https://github.com/LeukocyteMotionAndDynamics/ReceptorTraffic

7. Saggi di risposta alle chemochine negli embrioni precoci

NOTA: Questo è un esperimento collaterale opzionale che consente di testare i cambiamenti di distribuzione dei recettori in risposta a una chemochina candidata ed è indipendente dagli esperimenti sopra descritti riguardanti l'espressione dei neutrofili dei costrutti del recettore. Le differenze nel traffico indotto dal ligando tra i recettori sono difficili da stabilire con questa tecnica poiché i livelli di ligando sono saturi14. Tuttavia, se si vede l'internalizzazione del ligando di un recettore in questo sistema, questa può essere un'indicazione che il ligando è riconosciuto dal recettore nei casi in cui l'identità del ligando non è chiara. Questo è utile, perché l'espressione dei recettori delle chemochine in linee cellulari consolidate come le cellule HEK293T14 può essere ingombrante.

  1. Impostare un incrocio di pesci selvatici (ad esempio, AB) e raccogliere le uova la mattina successiva poco dopo aver sollevato i separatori (come descritto sopra).
  2. Iniettare 100 pg di mRNA del recettore marcato fluorescentemente (ad esempio, Cxcr1-FT), insieme a 100 pg di mRNA per un marcatore di membrana (ad esempio, CFP di membrana). Includere nella miscela dosi variabili di mRNA per il ligando chemochina.
    NOTA: Come indicazione 150 pg Cxcl8a mRNA ha dato prominente internalizzazione di fluorescente Cxcr1-FT (vedi Figura 5).
  3. Risciacquare gli embrioni con il mezzo E3 e incubare a 28°C.
  4. A circa 7 hpf, testare l'espressione dell'mRNA su un telescopio di dissezione fluorescente e selezionare gli embrioni da visualizzare.
  5. Preparare in anticipo lo 0,8 % di agarosio LMP e conservare in un tubo di vetro in un blocco termico a 60 °C. Usa una pipetta di vetro per manipolare gli embrioni. Decorionare delicatamente gli embrioni usando un paio di pinze in ogni mano.
  6. Aspirare un singolo embrione decorionato con la pipetta di vetro assicurandosi che non ci siano bolle sulla punta. Rilasciare delicatamente l'embrione nel tubo di agarosio permettendogli di affondare nel tubo.
  7. Aspirare l'embrione dal tubo di agarosio, raccogliendo un po 'di agarosio liquido lungo la strada. Rilasciare delicatamente l'embrione sul centro di un piatto di imaging con fondo di vetro. Ruotare rapidamente l'embrione in modo che il palo animale sia rivolto verso il fondo del piatto (questo lato deve essere più vicino all'obiettivo quando si utilizza un microscopio invertito).
    NOTA: Potrebbe essere necessario riadattare l'orientamento degli embrioni mentre l'agarosio è ancora in fase di impostazione.
  8. Dopo aver impostato l'agarosio, integrare con 2 ml di mezzo E3.
    NOTA: Gli embrioni in questa fase sono molto fragili rispetto alle larve e ci vuole un po 'di pratica per decorare e montare. È importante aspirare e rilasciare il più delicatamente possibile, per evitare la rottura dell'embrione.
  9. Ripeti il processo con l'obiettivo di caricare 3-5 embrioni per piatto.
  10. Immagini di embrioni su un microscopio confocale invertito (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un obiettivo olio 40x/1.3 NA per ottenere una risoluzione sufficientemente elevata. Visualizza mCFP, sfGFP e tagRFP con 405, 488 e 552 nm, rispettivamente, sull'ambito. Regola i filtri e le impostazioni per avere un contrasto elevato evitando la saturazione e riducendo al minimo le perdite tra i canali.
  11. Ripetere il montaggio e l'imaging per condizioni diverse.

Risultati

La ferita della pinna ventrale è seguita da una rapida mobilizzazione dei neutrofili dal CHT nella pinna ventrale e dal raggruppamento al margine della ferita, entro 30-60 minuti (Figura 1). Abbiamo visualizzato la distribuzione di due recettori delle chemochine, Cxcr1 e Cxcr2, che sono espressi dai neutrofili zebrafish24 e riconoscono Cxcl8a e Cxcl8b14, usando la microscopia confocale a disco rotante. Abbiamo generato due linee transgeniche corrispondenti, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), in cui i neutrofili esprimono un costrutto timer fluorescente (FT) del recettore, cioè una fusione con un tandem di sfGFP e tagRFP (Figura 2 e riferimento14). L'uso dei due fluorofori aveva lo scopo di consentire il monitoraggio di un'ampia gamma di destini recettoriali e fornire stime del tempo di turnover proteico sulla membrana plasmatica, poiché i recettori di nuova sintesi fluorescevano in verde e diventavano progressivamente rossi all'età di 8,14 anni. Tuttavia, questi recettori hanno un rapido turnover costitutivo sulla membrana plasmatica dei neutrofili e che il tempo di permanenza era più breve del tempo di maturazione di tagRFP, con sfGFP che mostrava localizzazione di membrana e tagRFP che mostrava localizzazione vescicolare allo stato stazionario (Video supplementare 1 e ref14). Pertanto, ci siamo concentrati sulla distribuzione di sfGFP per monitorare l'internalizzazione indotta dal ligando nei siti di danno tissutale. Il modello di distribuzione del recettore è stato quantificato utilizzando la metrica di contrasto, che riporta le differenze di intensità tra i pixel vicini. La logica è che quando la distribuzione del recettore è membranosa e liscia, il valore di contrasto è basso. Quando la distribuzione del recettore è vescicolare e più puntina, il valore di contrasto è alto (Figura 3).

Un metodo alternativo consiste nel quantificare il rapporto tra i livelli dei recettori (intensità sfGFP) rispetto ai livelli di un marcatore di membrana di controllo, ad esempio la CFP di membrana (mCFP) (Figura 3). Entrambi i metodi potrebbero rilevare l'internalizzazione del recettore, come indicato da un modello di distribuzione del recettore vescicolare più globale nella cellula (valore di contrasto più elevato) o livelli di recettori più bassi sulla membrana (rapporto sfGFP / mCFP inferiore). Tuttavia, la metrica di contrasto potrebbe anche rilevare l'internalizzazione del recettore nei cluster di neutrofili alla ferita, in cui la segmentazione della membrana era meno accurata e non applicabile (Figura 3). Utilizzando questa metrica, siamo stati in grado di quantificare le differenze visibili tra il traffico di neutrofili Cxcr1 e Cxcr2 nelle ferite (Figura 4 e Video supplementare 2). Cxcr1-FT interiorizzato in cellule situate nella ferita mentre Cxcr2-FT è rimasto membranoso nei neutrofili nella ferita (Figura 4A-C, Video supplementare 2 e Video supplementare 3). La soppressione di Cxcl8a e Cxcl8b, attraverso il trattamento con morfolino, ha influenzato in modo differenziale l'internalizzazione di Cxcr1-FT alle ferite (Figura 4C,D). Per convalidare ulteriormente che Cxcr1-FT risponde a Cxcl8a, abbiamo eseguito saggi di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Abbiamo scoperto che Cxcr1-FT è marcatamente interiorizzato in embrioni in cui Cxcl8a è stato co-espresso (Figura 5). Complessivamente questi risultati indicano che i metodi descritti possono essere utilizzati per misurare l'internalizzazione del recettore indotta da chemochine nei neutrofili e stabilire l'identità del ligando mediando questi effetti.

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Figura 1: Migrazione dei neutrofili alle ferite delle pinne ventrali. (A) (A sinistra) Vignetta della larva di 3 dpf che mostra la posizione del tessuto ematopoietico caudale (CHT), la circolazione di Venere (VC, blu), la pinna ventrale (VF) e il sito della ferita. (Destra) Cartone animato raffigurante l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT e raggruppati sulla ferita. Il plesso della vena caudale (CVP) del tessuto CHT è disegnato in blu. (B) Immagine in campo luminoso (a sinistra) e proiezione confocale (a destra) che mostra la ferita della pinna ventrale e la distribuzione dei neutrofili nelle larve di Tg(mpx:GFP) a 2 ore dopo l'avvolgimento. Le linee tratteggiate mostrano i contorni VF e CHT. Barra della scala = 25 μm. Immagine cartoon e fluorescente modificata dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine nei neutrofili. (A) Costrutti utilizzati per l'espressione transgenica neutrofila-specifica di Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) e Cxcr2-FT. Proiezioni confocali di neutrofili nella testa di una larva transgenica 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), top; Tg(lyz:Cxcr2-FT), in basso) che mostra i canali tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra di scala = 20 μm. (B) Schema anatomico di 3 larve dpf come in Figura 1A. Sotto la larva ci sono schemi che raffigurano l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT (in alto) o eseguono la chemiotassi quando entrano nella pinna ventrale (in basso). Il quadrato tratteggiato indica l'area ripresa nelle istantanee a destra. (C) Neutrofili nelle larve di Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP è mostrato) dopo mobilizzazione dal CHT (pannelli superiori) o chemiotassi verso la ferita (pannelli inferiori). Le frecce mostrano le stesse celle nel tempo. I punti temporali sull'immagine a destra sono minuti trascorsi dopo l'immagine a sinistra. Barra di scala = 10 μm. (D) Rappresentazione schematica dell'approccio sperimentale per l'imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine. Pannelli A-C modificati dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Esempi di quantificazione della dinamica dei recettori. I neutrofili singoli (blu) o raggruppati (verde) alle ferite o i neutrofili non mobilizzati nel CHT (rosso, arancione) sono stati segmentati e analizzati con metodi diversi per confrontare i risultati. Le stesse celle di esempio mostrate sono state analizzate con due metodi per mettere in relazione ciò che si vede nell'immagine con l'intervallo di valori estratti. (A) La superficie delle celle di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale sfGFP. (B) Il contrasto è stato calcolato dalle celle di esempio mostrate in A. (C) La membrana delle cellule di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale CFP. È seguita l'analisi raziometrica di sfGFP/CFP. (D) Il rapporto sfGFP/CFP è stato calcolato sulle celle di esempio mostrate in C. Le barre di errore rappresentano S.E.M. da singole celle, nei casi di n>1, i valori qui non sono stati utilizzati per analisi statistiche ma semplicemente per esemplificare le misurazioni ottenute con i diversi metodi di quantificazione. Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Dinamica differenziale di Cxcr1 e Cxcr2 in risposta al ferimento. (A) Proiezione confocale di neutrofili in larve Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) alla ferita a 80 minuti dopo l'avvolgimento (canale sfGFP mostrato). Barra della scala = 10 μm.  (B) Neutrofilo Cxcr1-FT ingrandito (a sinistra) e Cxcr2-FT (a destra) alla ferita. Il recettore verde è mostrato in grigio. Barra di scala = 5 μm. (C) Contrasto normalizzato (contrasto per singolo neutrofilo normalizzato al contrasto medio delle cellule non mobilizzate nel CHT). cxcl8a si riferisce all'iniezione di un blocco di giunzione insieme a un morfolino che blocca la traduzione per cxcl8a. cxcl8b si riferisce all'iniezione con un morfolino che blocca la giunzione per cxcl8b. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 cellule (CHT), n=47 cellule (ferita) da 8 larve. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 cellule (Cxcl8a-MO) da 5 larve, n=16 cellule (Cxcl8b-MO) da 5 larve. Per Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 cellule (CHT) e n=20 cellule (ferita) da 3 larve. I dati sono stati raggruppati da larve indipendenti acquisite in 1-5 sessioni di imaging. Test di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn per Tg (lyz: Cxcr1-FT), test di Mann-Whitney spaiato a due code per Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Proiezione confocale di neutrofili in larve transgeniche Tg(lyz:Cxcr1-FT) trattate con cxcl8a morpholino (MO) (a sinistra) e cxcl8b MO (a destra) che rispondono alle ferite delle pinne (canale sfGFP mostrato in verde). Istantanea scattata in punti temporali di accumulo equivalente di neutrofili (85 minuti post-ferimento nell'immagine sinistra e 45 minuti post-ferimento nell'immagine destra). Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Test di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Fette confocali a scansione laser di embrioni gastrulanti che mostrano espressione e distribuzione di Cxcr1-FT. 100 pg di mRNA Cxcr1-FT sono stati iniettati in uova a stadio cellulare con o senza mRNA Cxcl8a 150 pg. I recettori verdi e rossi sono mostrati in canali separati. Il marcatore CFP a membrana di controllo (mCFP) viene mostrato nel canale ciano. Barra della scala = 20 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Film supplementare 1: Neutrofili transgenici nella testa di una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 5 fps. Barra della scala = 20 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clicca qui per scaricare questo video.

Film supplementare 2: Neutrofili in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) larve transgeniche che rispondono alle ferite delle pinne. Il film inizia entro 10 minuti dopo il ferimento e dura 60 minuti sfGFP (verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 10 fps. CHT = tessuto ematopoietico caudale. VF = pinna ventrale. Barra della scala = 25 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clicca qui per scaricare questo video.

Film supplementare 3. Ulteriori esempi di neutrofili da una larva transgenica Tg (lyz: Cxcr1- FT) ferita (larva diversa da quella mostrata nel Video 2), acquisita a una risoluzione più elevata, che mostra l'internalizzazione del recettore (canale sfGFP mostrato in verde) alla mobilizzazione nel CHT o all'ingresso e chemiotassi nella pinna ventrale. L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 2 fps. Barra della scala = 10 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

Il metodo descritto consente l'imaging dal vivo della dinamica dei recettori in risposta a ligandi endogeni in situ durante una risposta infiammatoria al danno tissutale. L'uso di reporter neutrofili Cxcr1/Cxcr2 potrebbe essere esteso ad altri contesti fisiologici, come infezioni, modelli tumorali o altri tipi di danno tissutale 14,25,26,27. Inoltre, le linee di salvataggio transgeniche, in cui il recettore endogeno viene soppresso e salvato da un recettore mutante esogeno, potrebbero fornire strumenti utili per analizzare l'importanza di specifici modelli di migrazione dei neutrofili nelle risposte immunitarie. Ad esempio, i mutanti del recettore Cxcr1 che hanno una desensibilizzazione compromessa causano un raggruppamento di neutrofili più prominente nei siti infiammatori14. Questo fenotipo di guadagno di funzione potrebbe essere utilizzato per comprendere il ruolo della congregazione dei neutrofili in diversi processi fisiologici, ad esempio la riparazione delle ferite, le malattie infettive o l'evoluzione del tumore e integrare gli esperimenti di knockdown / knockout del recettore. La metodologia fornisce anche una base per ampliare la gamma di reporter disponibili. La scelta del reporter fluorescente è importante da considerare e dipende dalla questione biologica. Abbiamo scoperto che il turnover costitutivo di questi recettori delle chemochine nei neutrofili era elevato, rispetto alle cellule epiteliali, e che i reporter con maturazione rapida (ad esempio, sfGFP) erano tenuti a riportare i livelli di membrana allo stato stazionario e risolvere le differenze sulla stimolazione dei neutrofili 8,14. Pertanto, i rapporti di membrana di sfGFP / tagRFP non sono applicabili per misurare l'internalizzazione indotta dal ligando in questo tipo di cellula, ma il modello di tagRFP consente il monitoraggio dei destini intracellulari del recettore, che potrebbe essere utile in alcuni studi. Abbiamo anche scoperto che il segnale intracellulare più concentrato di tagRFP è utile per lo screening delle singole larve. Un approccio alternativo per misurare i livelli dei recettori sulla membrana plasmatica sarebbe quello di co-esprimere un marcatore di membrana fluorescente nei neutrofili nello stesso transgene9 o in un transgeneindipendente 14. Nel primo scenario il transgene fornirebbe un ulteriore mezzo per lo screening del pesce e i livelli di espressione sarebbero comparabili tra il marcatore e il recettore. Quest'ultimo approccio sarebbe più modulare, in quanto una linea zebrafish con un reporter recettore potrebbe essere combinata con diverse linee reporter. In entrambi i casi, vale la pena notare che la quantificazione di membrana dei livelli del recettore è difficile nei neutrofili raggruppati (vedi sotto). Infine, notiamo che una possibile estensione di questo protocollo sarebbe quella di seguire l'imaging dal vivo mediante immunoistochimica per analisi di localizzazione più dettagliate.

Il sistema di transgenesi Tol2 è ben consolidato7 e il promotore del lisozima C è stato ampiamente utilizzato per l'espressione dei neutrofili11,15. L'approccio della transgenesi è, quindi, relativamente semplice e il livello di espressione raggiunto con questo promotore è abbastanza alto da fornire un contrasto sufficiente per l'analisi della dinamica del recettore. Una possibile limitazione è che il livello di espressione non ricapitola i livelli di espressione del recettore endogeno. Nuove tecnologie CRISPR potrebbero essere implementate per stabilire linee knock-in per i recettori di particolare interesse28. Queste tecnologie sono ancora ingombranti e potrebbero non garantire i livelli di espressione richiesti per l'imaging subcellulare, ma il loro sviluppo di successo sarebbe un importante passo avanti per la comprensione delle dinamiche di segnalazione endogena. Le convalide funzionali sono importanti per interpretare i dati con costrutti recettoriali transgenici. Ad esempio, i saggi di riconoscimento dei ligandi possono essere utilizzati per stabilire che la proteina di fusione fluorescente è funzionale e il salvataggio dei fenotipi knockout potrebbe essere utilizzato per stabilire che i livelli di espressione transgenica dei neutrofili sono compatibili con la funzionalità14. Infine, un modo più diretto per convalidare la fusione del recettore sarebbe quello di utilizzare un test funzionale in vitro con recettore marcato insieme a versioni non marcate14.

L'approccio di quantificazione affronta difficoltà specifiche nella segmentazione accurata della membrana nei neutrofili in vivo. Nelle cellule di natura epiteliale, la quantificazione dei livelli dei recettori può essere eseguita automaticamente normalizzando i livelli del recettore di membrana in un marcatore di controllo, che può essere espresso in tandem o separatamente9. In effetti, abbiamo applicato un tale approccio, quando abbiamo utilizzato il test di riconoscimento del ligando in embrioni gastrulanti14. Tuttavia, i neutrofili subiscono cambiamenti complessi e rapidi nella forma delle cellule in vivo, rendendo difficile la segmentazione della membrana sia in 2D che in 3D14. Questo è ancora più difficile quando i neutrofili si raggruppano, che si verifica in molti contesti fisiologici29. La metrica di contrasto supera questa limitazione in quanto non richiede la segmentazione della membrana, ma riflette invece lo stato complessivo della distribuzione del recettore nella cellula (membranoso / liscio vs vescicolare / punteggiato). È importante notare che la metrica di contrasto può essere influenzata dal contrasto complessivo dell'immagine, quindi è necessaria la normalizzazione dei valori delle singole cellule a un riferimento interno per tenere conto della variabilità del segnale in diversi embrioni / campioni. Ad esempio, abbiamo usato il valore medio di contrasto cellulare dei neutrofili non responsivi nel CHT (cioè neutrofili che rimangono fermi e non migrano nella pinna ventrale)14. Un'ulteriore possibilità sarebbe quella di normalizzare con i valori di contrasto di un marcatore di controllo nella stessa cella. Ciò fornirebbe una soluzione quando non è disponibile un riferimento interno di cellule non rispondenti e potrebbe probabilmente risolvere differenze quantitative più sottili nella dinamica dei recettori tra condizioni diverse.

La posizione dell'imaging è un'altra variabile da considerare. La ragione per scegliere la ferita della pinna ventrale qui, al contrario del più comunemente usato modello di ferita della pinna caudalemodello 16,30, è perché il sito di ferimento si trova vicino al sito di residenza dei neutrofili / origine migratoria. Ciò accelera la tempistica del test, poiché ci vuole relativamente poco tempo per l'arrivo dei neutrofili. Inoltre, offre l'opportunità di catturare il comportamento cellulare sia all'origine della migrazione (CHT) che nella posizione di interesse target (ferita). Questo è rilevante qui, perché la risoluzione spaziale e temporale richiesta per l'imaging subcellulare è difficile da combinare con un ampio campo visivo o una scansione multi-posizione. Pertanto, il test della ferita della pinna ventrale consente di tracciare l'evoluzione della risposta migratoria dall'origine della migrazione e la cattura simultanea di fluttuazioni non specifiche del recettore nelle cellule che non rispondono. Come accennato in precedenza, quest'ultimo è utile ai fini della quantificazione in quanto fornisce un riferimento interno per dinamiche non specifiche. In altri sistemi, potrebbe non essere possibile avere un tale riferimento interno, nel qual caso i valori di contrasto di un marcatore a membrana coespresso fornirebbero un controllo alternativo.

In sintesi, prevediamo che la metodologia è applicabile ad altri sistemi e può essere implementata per una varietà di scopi. Ad esempio, gli stessi reporter potrebbero essere utilizzati in altri contesti infiammatori, come le impostazioni di infezione o altri modelli di malattia. Il repertorio delle linee reporter del recettore zebrafish potrebbe essere esteso ad altri recettori di segnalazione, per comprendere i meccanismi di segnalazione o segnalare le dinamiche del ligando in vivo. L'approccio può essere combinato con tecniche di knockdown/knockout per interrogare le basi meccanicistiche delle dinamiche osservate. Ad esempio, la perturbazione dell'espressione del ligando può indicare la dipendenza dal ligando per le dinamiche dei recettori osservate. In futuro, prevediamo che il sistema potrebbe essere ulteriormente perfezionato per incorporare l'inserimento knock-in dei giornalisti. In definitiva, i risultati che utilizzano questa metodologia fornirebbero nuove intuizioni preziose al di là della comunità dei pesci zebra, data la conservazione di questi recettori di segnalazione nei mammiferi e la relativa sfida di condurre questi studi in organismi più grandi.

Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi

Ringraziamenti

Ringraziamo Christine Holt e Bill Harris per l'aiuto con la microscopia confocale. Ringraziamo Darren Gilmour per i costrutti della spina dorsale del timer fluorescente e Anna Huttenlocher per il vettore backbone Tol2-Lyz. Ringraziamo Steve Renshaw per la linea Tg(mpx:GFP)i114 . Questo lavoro è stato supportato dal MRC (MR/L019523/1), dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e una sovvenzione Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. è stato supportato da un MRC DTP studentship e in parte dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione. H.W. è stato supportato da un MRC DTP Studentship. H.P. è stato supportato da una sovvenzione di dottorato Wellcome Trust (105391 / Z / 14 / Z) e in parte da un Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione e MRC (MR/L019523/1).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-fenil-2-tioureaSigma-AldrichP7629-25G
50mL CellStar Centrifuga TuboGrenier Bio-One Limited210270
Clark vetro capillareHarvard Apparatus30-0020
Cleanline Thin BleachScientific Laboratory SuppliesCLE0301
Cannocchiale da dissezioneNikonSMZ645
Riscaldatore a blocco DriTechneFDB02AD
FijiNational Institutes of Health, Bethesda, MD
Pincipe, Gioielleria Dumont n. 5Sigma-AldrichF6521
Piastre per micropozzetti con fondo in vetroMatTekP35G-1.5-14-C
Pipetta pasteur in vetroFisherbrand11795098
Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit di trascrizioneInvitrogen10391175
Leica SP8 microscopio confocaleLeicaN/A
Agarosio a basso punto di fusioneInvitrogen16520-100
Supporto magneticoNarishigeGJ-1
MATLABThe MathWorks, Inc., Natick, MA
Blu di metileneSigma-AldrichM9140-25G
MgSO4Sigma-AldrichM-2643
Sistema di microiniezioneParkerPicospritzer III
Puntali per pipette per microcaricatoriEppendorf5242956003
MicromanipolatoreNarishigeM-152
Estrattore per micropipetteSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97
Vetrino per microscopioThermo-ScientificJ1800AMNZ
PerkinElmer Disco rotante UltraVIEW ERS, Olympus IX81 Disco rotante Microscopio confocaleOlympusN/A Petri
dish (120mm)Grenier Bio-One Limited632180
Rosso fenoloSigma-AldrichP0290-100ML
Poly(A) Tailing KitInvitrogenAM1350
PrismGraphPad Software
Pennello piccoloN/A
applicata spettrale Modulo laserN/A
Lama per bisturi chirurgico n. 23Swann-Morton233-5528
Tricaina MS222Sigma-AldrichE10521-50G
Software VolocityN/A
Scanner confocale a disco rotante Yokogawa CSU10YokogawaN/A
Ricerca LMM5

Riferimenti

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