Articolo metodologico

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

DOI:

10.3791/61680

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20 settembre 2020

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1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

Abstract

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La trascrizione genica è un processo essenziale nella biologia cellulare e consente alle cellule di interpretare e rispondere a segnali interni ed esterni. I metodi tradizionali di popolazione di massa (Northern blot, PCR e RNAseq) che misurano i livelli di mRNA non hanno la capacità di fornire informazioni sulla variazione da cellula a cellula nelle risposte. La visualizzazione e la quantificazione precisa di singole cellule e alleliche è possibile tramite ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH). RNA-FISH viene eseguito ibridando RNA bersaglio con sonde oligonucleotidiche marcate. Questi possono essere ripresi in modalità di throughput medio/alto e, attraverso pipeline di analisi delle immagini, forniscono dati quantitativi su RNA sia maturi che nascenti, il tutto a livello di singola cellula. Le fasi di fissazione, permeabilizzazione, ibridazione e imaging sono state ottimizzate in laboratorio per molti anni utilizzando il sistema modello qui descritto, che si traduce in un'analisi a cella singola di successo e robusta dell'etichettatura smFISH. L'obiettivo principale con la preparazione e l'elaborazione dei campioni è quello di produrre immagini di alta qualità caratterizzate da un elevato rapporto segnale-rumore per ridurre i falsi positivi e fornire dati più accurati. Qui presentiamo un protocollo che descrive la pipeline dalla preparazione del campione all'analisi dei dati in combinazione con suggerimenti e passaggi di ottimizzazione da adattare a campioni specifici.

Introduzione

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La trascrizione e la traduzione genica sono i due principali processi coinvolti nel dogma centrale della biologia, che vanno dalla sequenza del DNA all'RNA alla proteina1. In questo studio, ci concentriamo sulla produzione di RNA messaggero (mRNA) durante la trascrizione. La nascente molecola di RNA comprende sia introni non codificanti che esoni codificanti. Gli introni vengono splicati co-trascrizionalmente prima che l'mRNA si muova nel citoplasma per la traduzione sui ribosomi2,3.

Tradizionalmente, la misurazione dell'mRNA viene eseguita in popolazioni di ....

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Protocollo

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Per garantire risultati ottimali, la parte di laboratorio umida di questo protocollo richiede precauzioni standard prive di RNasi in tutte le fasi. Ad esempio, l'uso di punte di pipette filtrate, recipienti sterili e tamponi privi di RNasi è altamente incoraggiato. Si suggerisce anche l'uso di inibitori della RNasi come i complessi di vanadil ribonucleosidi, specialmente per gli RNA bersaglio a bassa abbondanza.

1. Coltura cellulare e configurazione sperimentale

  1. Mantenere le cellule aderenti del cancro al seno MCF-7 (ATCC #HTB-22) in un pallone di coltura tissutale T75 con fenolo-rosso libero (richiesto solo per e....

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Risultati

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Per analizzare le risposte ormonali tramite smFISH, ad esempio, abbiamo scelto il modello del recettore degli estrogeni (ER) utilizzato nei saggi ad alto rendimento per determinare la presenza di sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino nei disastri ambientali nel contesto della partecipazione al NIEHS Superfund Research Program7. In questo esperimento, le cellule aderenti del cancro al seno MCF-7 sono state trattate con l'agonista ER 17β-estradiolo (E2, 10 nM) o veicolo (DMSO) per 24 o.......

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Discussione

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La metodologia smFISH descritta si basa sui protocolli7,12,14precedentemente pubblicati. In questo protocollo, spieghiamo i passaggi critici che sono stati ottimizzati dal wet-lab (tra cui densità di semina, tempo di fissazione, permeabilizzazione e concentrazione della sonda), all'imaging e all'analisi delle immagini, fornendo una pipeline sperimentale completa per i laboratori interessati a eseguire analisi a singola cellula d.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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MAM, FS e MGM sono finanziati da NIEHS (Progetto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM e PKS sono supportati dal GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719), finanziato dal CPRIT. L'imaging è anche supportato dall'Integrated Microscopy Core presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti da NIH (DK56338 e CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center e John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
17β EstradioloSigma-AldrichE2257Numero CAS 50-28-2
Ambion SSC (20X) Tampone, privo di RNASIThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM con L-glutammina e 4,5 g/L di glucosioFisher Scientific MT10017CVProdotto da Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417Senza piruvato di sodio
destrano solfato, soluzione sterile al 50%Sigma-Aldrich3730-100ML
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco Ca++/Mg++Corning21030CVProdotto da Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%)Fisher Scientific07-678-005
Falcon Piastra per coltura cellulare multipozzetto a fondo piatto trasparente a 24 pozzetti trattata con TCCorning353047prodotta da Decon Laboratories
Fetal Siero bovino (FBS), 500 mLFisher Scientific50-753-2978Prodotto da Gemini Bio Products
GE Healthcare Microscopio a deconvoluzione ad alta risoluzione DeltaVision LIVEGE Healthcare
Acqua di iclone, grado di biologia molecolareFisher ScientificSH3053802
Olio da immersione 1.516GE Healthcare Life Sciences29162940Prodotto da GE Healthcare Bio-Science
Soluzione di L-glutamminaFisher ScientificMT25005ClProdotto da Corning
MCF-7 celluleATCCHTB-22
Grado molecolare FormamidePromegaPAH5051
Olympus 60x/1.42 NA ObiettivoOlympus
ParafilmBemis Company, Inc.52858-076Distribuito da VWR
Paraformaldeide, soluzione al 16%,microscopia elettronica15710
Soluzione di penicilina-streptomicinaFisher ScientificMT3001ClProdotto da Corning
Ribonucleoside Vanadyl ComplexVWR101229-716Prodotto da New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780
Piruvato di sodio, 100 mMFisher Scientific11-360-070Prodotto da Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslist, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 mLFisher ScientificBP151-100Prodotto da Fisher BioReagents
Soluzione di tripsina-EDTA 0,25%Sigma-AldrichT4049-500ML
Vectashield Terreno di montaggio antifading 10 mLFisher ScientificNC9265087Prodotto da Vector Laboratories
di grado EM Sciences

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E.

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Ibridazione in situ a fluorescenza dell RNAsonde per introni ed esoni di GREB1trattamento con agonista del recettore degli estrogenimicroscopia epifluorescente a campo largopipeline di analisi delle immaginicolorazione di contrasto con DAPIrisciacquo con acqua priva di nucleasi

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