Ottimizzazione della crescita del cristallo per la cristallografia macromolecolare neutronica

Sommario

Gli studi strutturali sulle biomacromolecole mediante cristallografia richiedono cristalli di alta qualità. Qui dimostriamo un protocollo che può essere utilizzato da OptiCrys (uno strumento completamente automatizzato sviluppato nel nostro laboratorio) e/o pulsanti di microdialisi per la coltivazione di cristalli di grande qualità basati sulla conoscenza del diagramma di fase di cristallizzazione.

Abstract

L'uso della cristallografia macromolecolare neutronica (NMX) si sta espandendo rapidamente con la maggior parte delle strutture determinate nell'ultimo decennio grazie alla costruzione di nuove linee di fascio NMX e ad una maggiore disponibilità di software di perfezionamento della struttura. Tuttavia, le sorgenti di neutroni attualmente disponibili per nmx sono significativamente più deboli delle sorgenti equivalenti per la cristallografia a raggi X. Nonostante i progressi in questo campo, per gli studi di diffrazione neutronica saranno sempre necessari cristalli significativamente più grandi, in particolare con la tendenza a studiare macromolecole e complessi sempre più grandi. Ulteriori miglioramenti nei metodi e nella strumentazione adatti a far crescere cristalli più grandi sono quindi necessari per l'espansione dell'uso di NMX.

In questo lavoro, introduciamo strategie razionali e un banco di crescita dei cristalli (OptiCrys) sviluppato nel nostro laboratorio che combina l'osservazione in tempo reale attraverso una videocamera montata al microscopio con un preciso controllo automatizzato delle soluzioni di cristallizzazione (ad esempio, concentrazione precipitante, pH, additivo, temperatura). Dimostriamo quindi come questo controllo della temperatura e della composizione chimica faciliti la ricerca di condizioni ottimali di cristallizzazione utilizzando proteine solubili modello. Una conoscenza approfondita del diagramma della fase di cristallizzazione è fondamentale per selezionare la posizione iniziale e il percorso cinetico per qualsiasi esperimento di cristallizzazione. Mostriamo come un approccio razionale possa controllare le dimensioni e il numero di cristalli generati in base alla conoscenza dei diagrammi di fase multidimensionali.

Introduzione

Comprendere la relazione struttura-funzione delle proteine e il meccanismo delle vie fisiologiche spesso si basa sulla conoscenza delle posizioni degli atomi di idrogeno (H) e di come la carica viene trasferita all'interno di una^{proteina 1,2}. Poiché gli atomi di idrogeno disperdono debolmente i raggi X, le loro posizioni possono essere determinate solo con dati di diffrazione a raggi X ad altissima risoluzione (>1 Å)^3,4. Al contrario, la cristallografia neutronica può essere utilizzata per ottenere una posizione accurata degli atomi di idrogeno nelle macromolecole biologiche come atomi di idrogeno e deuterio (H², isotopo dell'idrogeno) hanno lunghezze di dispersione di magnitudine approssimativamente uguale a ossigeno, azoto e carbonio⁵. Tuttavia, il flusso neutronico proveniente dalle sorgenti di neutroni disponibili è più debole di quello dei fasci di raggi X, per cui questo deve spesso essere^{compensato per 2,3}. Ciò può essere ottenuto scambiando H con H² e/o aumentando il volume dei cristalli per ridurre la dispersione incoerente degli idrogeno e aumentare il rapporto segnale-rumore delle immagini di diffrazione.

Esistono vari approcci di cristallizzazione (il corrispondente diagramma di fase schematico è mostrato nella figura 1) per ottenere cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità sia per la cristallografia bio-macromolecolare a raggi X che per quella neutronica^6. Nella diffusione del vapore, una goccia preparata da una miscela di una proteina e una soluzione di cristallizzazione viene equilibrata nel tempo, per evaporazione dell'acqua o di altre specie volatili, contro un serbatoio contenente una maggiore concentrazione di precipitante della stessa soluzione di cristallizzazione. L'aumento della concentrazione di proteine e precipitanti nella goccia porta alla supersaturazione necessaria per la nucleazione spontanea seguita dalla crescita cristallina a questi nuclei^6,7. Sebbene la diffusione del vapore sia la tecnica più frequentemente utilizzata per la coltivazione^{dei cristalli 4}, il processo di cristallizzazione non può essere controllato con^{precisione 8}. Nel metodo di diffusione dell'interfaccia libera, la soluzione di cristallizzazione si diffonde in una soluzione proteica concentrata, indirizzando molto lentamente il sistema verso la supersaturazione. Questo metodo può essere considerato un metodo batch con una velocità di miscelazione^{lenta 6,9,10,11,12}. Nel metodo batch, la proteina viene rapidamente miscelata con una soluzione di cristallizzazione che porta a una rapida supersaturazione e a sua volta nucleazione^{uniforme con molti cristalli 3,7}. Questo metodo rappresenta circa un terzo di tutte le strutture attualmente depositate nella Protein Data Bank. Il metodo della dialisi viene utilizzato anche per la coltivazione di cristalli proteici di alta qualità e ben diffratti. Nel metodo della dialisi, le molecole di precipitante si diffondono da un serbatoio attraverso una membrana semi-permeabile in una camera separata con la soluzione proteica. La cinetica dell'equilibrazione dipende da vari fattori, come la temperatura, la dimensione dei pori di membrana e il volume e la concentrazione di campioni proteici e agenti di^{cristallizzazione 6}.

I diagrammi di fase di cristallizzazione possono essere usati per descrivere diversi stati di una proteina in funzione della diversa variabile fisica o chimica³. Come illustrato nella figura 1, ogni tecnica di cristallizzazione può essere vista come utilizzando una traiettoria cinetica diversa per raggiungere le zone nucleazione e metastabili di tale diagramma^6,10,13. Ciò fornisce informazioni sulla solubilità proteica e sulla concentrazione proteica alla quale si osserva un equilibrio termodinamico tra cristallo e soluzione, trovando così le condizioni ottimali per la nucleazione^{e la crescita 3,14}. In un diagramma di fase bidimensionale, la concentrazione proteica viene tracciata in funzione di una variabile e le altre variabili sono mantenute costanti¹⁵. In tale diagramma di fase, quando la concentrazione proteica è inferiore alla curva di solubilità, la soluzione si trova nella regione sottosatura e non si verifica nucleazione o crescita cristallina. Al di sopra di questa curva si trova la zona di supersaturazione in cui la concentrazione proteica è superiore al limite di^{solubilità 3,14}. Questo è ulteriormente diviso in tre regioni: la zona metastabile, la zona di nucleazione spontanea e la zona di precipitazione. Nella zona metastabile, la supersaturazione non è sufficiente perché la nucleazione avvenga entro un tempo ragionevole, ma può avvenire la crescita dei cristalli seminati. Aggregazione e precipitazioni sono favorite nella zona di precipitazione, dove la supersaturazione è^{troppo alta 14,15}.

Quando si ottiene una supersaturazione sufficiente per la nucleazione spontanea, i primi nuclei appariranno¹⁰. La crescita dei cristalli porta ad una riduzione della concentrazione proteica fino al raggiungere il limite di solubilità. Finché la supersaturazione rimane in prossimità della curva di solubilità, non ci saranno cambiamenti significativi nelle dimensioni dei cristalli. Tuttavia, è stato dimostrato che le variazioni nella temperatura e nella composizione chimica della soluzione di cristallizzazione (ad esempio, la concentrazione del precipitante) influenzeranno la solubilità proteica e possono portare all'inizio di un'ulteriore crescita^{cristallina 8,13,16}.

Poiché la dialisi è vantaggiosa per una buona crescita cristallina, il banco di cristallizzazione OptiCrys illustrato nella Figura 2,è stato progettato e sviluppato nel nostro laboratorio per controllare la cristallizzazione in modo completamente^{automatizzato 8.} A tal fine, è stato scritto un software con LabVIEW che consente il controllo e il monitoraggio della temperatura di una configurazione di dialisi del serbatoio che scorre a contatto con elementi Peltier, tramite un controller elettronico e un refrigeratore. Lo stesso software regola automaticamente anche la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione (ad esempio lo scambio di agenti di cristallizzazione) utilizzando un sistema fluido multicanale. Inoltre, una fotocamera digitale e un microscopio invertito vengono utilizzati per visualizzare e registrare il processo di cristallizzazione. Due camere di cristallizzazione con volumi di 15 μL e 250 μL sono disponibili per la coltivazione di cristalli per scopi diversi. Poiché il processo di cristallizzazione è reversibile, lo screening per diverse condizioni è possibile con pochi microlitri della soluzione proteica purché il campione non sia^{danneggiato 8}. Di conseguenza, l'utilizzo di questo metodo riduce al minimo la quantità di materiale proteico utilizzato.

Dal lavoro precedente⁸, è evidente che durante il processo di crescita del cristallo, le osservazioni in situ devono essere effettuate a intervalli di tempo regolari. Questi possono variare da pochi secondi a diversi giorni, a seconda dell'evento sotto osservazione (precipitazioni, nucleazione o crescita cristallina).

L'ottimizzazione della crescita cristallina con OptiCrys si basa su diagrammi di fase di concentrazione precipitanti di temperatura. Nel caso di proteine con solubilità in funzione diretta della temperatura, è possibile utilizzare il regime di salatura¹⁸. È qui che l'aumento della forza ionica della soluzione, che può essere visualizzato usando diagrammi di fase proteina-precipitante, diminuisce la solubilità della proteina. Allo stesso modo, le proteine con solubilità inversa possono fare uso del regime di salatura¹⁸. La nucleazione avviene nella zona di nucleazione, in prossimità della zona metastabile, e la crescita del cristallo avviene quindi nella zona metastabile del diagramma di fase fino a quando la concentrazione proteica raggiunge il limite di solubilità. Come mostrato nella figura 3A, con una temperatura di composizione chimica costante può essere ridotta per mantenere la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile per prevenire nuove nucleazioni. I cristalli crescono fino a raggiungere il secondo equilibrio cristallo/soluzione e, successivamente, non si osserva un ulteriore aumento delle dimensioni dei cristalli. La temperatura viene ridotta più volte fino a quando i cristalli raggiungono la dimensione desiderata. Nella figura 3B, a temperatura costante, l'aumento della concentrazione del precipitante mantiene la soluzione nella zona metastabile. Questo processo può quindi essere ripetuto più volte per ottenere cristalli di grandi dimensioni. Cambiare la temperatura e manipolare le condizioni della soluzione di cristallizzazione, controllando i livelli di supersaturazione, sono due potenti strumenti per separare la nucleazione e la crescita di cristalli controllati con precisione e automaticamente da OptiCrys^5,8,14.

Esempi di cristalli proteici coltivati mediante cristallizzazione controllata dalla concentrazione controllata dalla temperatura, o dalla temperatura e precipitante, così come i relativi dati di diffrazione ottenuti sono disponibili in letteratura e PDB. Tra questi ci sono γ-cristallina E umana, lectina PA-IIL, pirofosfatasi inorganica del lievito, urarato ossidasi, anidrasi carbonica umana II, YchB chinasi e lattato deidrogenasi^5,14,17,18.

Sebbene OptiCrys sia stato commercializzato da NatX-ray, ci sono molti laboratori che non hanno accesso a questo strumento o all'approccio seriale che offre. L'alternativa a questa tecnica è utilizzare bottoni di microdialisi plastica disponibili in commercio con vari volumi. Utilizzando questi, la temperatura e la composizione chimica possono essere regolate e varie manualmente. L'ispezione dei pulsanti di microdialisi non può essere effettuata in situ e deve invece essere eseguita manualmente con un microscopio ottico. Il controllo della temperatura può essere ottenuto mantenendo il campione in un incubatore a temperatura controllata senza vibrazioni. È essenziale mantenere costante la temperatura per garantire che gli esperimenti di cristallizzazione siano riproducibili. Variazioni significative di temperatura possono anche portare a danni o distruzione di cristalli⁵.

Qui forniamo un protocollo dettagliato che descrive la preparazione del campione e l'uso di software di controllo per la crescita di cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità adatti alla cristallografia delle proteine neutroni. Questa procedura passo-passo è stata progettata per sfruttare il diagramma della fase di cristallizzazione al fine di selezionare una posizione iniziale e un percorso cinetico per controllare le dimensioni e la qualità dei cristalli generati. Inoltre, viene presentato un protocollo dettagliato per la coltivazione di cristalli con pulsanti di microdialisi che utilizza la stessa logica per ottenere cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità.

Protocollo

1. Metodo di dialisi con pulsanti di microdialisi

1. Preparazione del campione
   1. Preparare la soluzione proteica sciogliendo 30 mg di lisozima bianco uovo di gallina come polvere liofilizzata in 1 mL di tampone CH₃COONa (acetato di sodio da 100 mM, pH 4) al fine di ottenere una soluzione con una concentrazione finale di 30 mg·mL^-1.
   2. Centrifugare il campione a 13.000 × g per 10 min a 277 K. Questo processo consente di rimuovere eventuali aggregati prima di avviare il processo di cristallizzazione.
   3. Controllare l'assorbanza del campione a 280 nm e calcolare la concentrazione proteica usando l'equazione di Beer-Lambert (A= εcl).
      NOTA: Secondo l'equazione di Beer-Lambert, l'assorbanza elettronica (A) è direttamente proporzionale alla concentrazione (c, mg·mL^-1)di una specie assorbente data una lunghezza costante del percorso ottico (l, cm). Il gradiente di questa relazione lineare è il coefficiente di estinzione molare (ε, per il gliozima a 280 nm è 2,64 mL·mg⁻¹·cm⁻¹)¹⁹. Le sideche degli amminoacidi aromatici (tirosina, triptofano e fenilalanina) e i legami disolfuro tra i residui di cisteina hanno una forte assorbanza a ~280 nm derivante da transizioni π - π* consentite spettroscopicamente. Poiché la maggior parte delle proteine contiene questi residui, la concentrazione proteica può tipicamente essere calcolata facilmente misurando l'assorbanza a 280 nm, data la conoscenza del coefficiente di estinzione.
   4. Preparare soluzioni di cristallizzazione come illustrato nella figura 4. Filtrare tutte le soluzioni stock con filtri millipore da 0,22 μm prima di preparare la soluzione di cristallizzazione.
2. Crescita del cristallo
   1. Tagliare una membrana di dialisi della cellulosa con un adeguato taglio del peso molecolare (6-8 kDa) e immergerla in acqua distillata.
      NOTA: I dischi a membrana di dialisi sono disponibili in commercio per i pulsanti di microdialisi, ma se viene utilizzato il tubo di dialisi, non dimenticare di tagliare i bordi per separare i due strati di membrana dal tubo per avere solo membrane a strato singolo.
   2. Riempire i pozzatti di un vassoio da 24 porsi con 2 mL di soluzione di cristallizzazione nello stesso ordine indicato nella figura 4.
      NOTA: Se vengono utilizzati pulsanti con volumi maggiori (ad esempio, 200 μL), riempire tubi da 50 ml con una soluzione di cristallizzazione minima di 5 ml al fine di garantire uno scambio efficiente.
   3. Aggiungere/pipettare 35 μL di soluzione di lysozima alla camera del pulsante di microdialisi, come illustrato nella figura 5A.
      NOTA: Per evitare la formazione di bolle d'aria in un pulsante di dialisi da 30 μL quando è chiuso, deve essere aggiunto un volume extra (volume morto) di 5 μL di proteine aggiuntive, il che significa un totale di 35 μL di campione proteico. Questo campione proteico aggiuntivo crea una forma leggermente a cupola sopra la camera, come mostrato nella figura 5B, che impedisce la formazione di bolle d'aria.
   4. Prendere un applicatore delle dimensioni appropriate e posizionare l'O-ring elastico alle sue estremità (Figura 5C). Quindi posizionare la membrana, precedentemente leggermente asciugata/drenato utilizzando un pezzo di carta priva di fibre, sopra la camera del pulsante di dialisi. Fare attenzione a non mettere polvere nella camera quando si applica la carta. Impostare la membrana di dialisi in posizione trasferendo l'O-ring elastico dall'applicatore alla scanalatura del pulsante di dialisi (Figura 5C).
      NOTA: Il momento critico della manipolazione è il fissaggio della membrana di dialisi sulla parte superiore della camera trasferendo l'O-ring elastico dall'applicatore nella scanalatura del pulsante di dialisi. Tutti i movimenti devono essere perfettamente sincronizzati per evitare di racchiudere bolle d'aria con il campione nella camera proteica. È utile esercitarsi a allungare l'O-ring elastico prima della sua applicazione per conoscerne la rigidità, utilizzare una pinzetta per tenere parte della membrana durante la sua applicazione ed eseguire i primi esperimenti di prova con una proteina modello.
   5. Trasferire il pulsante nel pozzo o nel tubo da 50 mL utilizzando una pinzetta(Figura 5D).
   6. Coprire il pozzo con un coverslip, premendolo delicatamente sul grasso per sigillare il pozzo(Figura 5E).
      NOTA: Se non c'è grasso sopra i pozzetti, assicurati di aggiungerlo prima di iniziare l'esperimento o utilizzare un pezzo di nastro al posto del copripazzo in vetro. Il principio della cristallizzazione delle proteine mediante pulsanti di microdialisi è illustrato nella figura 5.
   7. Conservare il campione a 293 K in un incubatore termoregolato. Possono essere necessarie temperature diverse in base alle condizioni proteiche e di cristallizzazione utilizzate.
      NOTA: La stessa griglia di condizioni di cristallizzazione mostrata nella figura 4 (che consente di variare la concentrazione del precipitante) può essere schermata in funzione della temperatura. In tal caso, la stessa piastra di cristallizzazione deve essere riprodotta e ogni copia deve essere collocata in un incubatore regolato a una temperatura diversa. Ciò richiede la tà di disporre di diversi incubatori termoregolati senza vibrazioni.
   8. Controllare il vassoio o i tubi alla ricerca di cristalli (Figura 4) e prendere appunti su base regolare, tipicamente quotidianamente, per distinguere ciò che c'è in ogni vassoio. Buone note sono essenziali per evitare risultati falsi positivi e per discriminare la polvere dai cristalli.

2. Processo di crescita del cristallo con OptiCrys

1. Preparazione del campione
   1. Preparare una soluzione proteica e una membrana di dialisi come descritto nella sezione 1.1.
   2. Preparare soluzioni stock di NaCl (4 M) e di CH₃COONa pH 4 (1 M) e filtrarle in tubi da 50 mL.
   3. Aggiungere la soluzione proteica (15 μL di glisozima con 30 mg·mL^-1)alla camera di dialisi della configurazione della dialisi del serbatoio a flusso a temperatura controllata. Fare riferimento alla figura 6 per informazioni dettagliate sull'impostazione della dialisi del serbatoio scorrevole a temperatura controllata. OptiCrys ha due camere di dialisi, il volume minimo è di 15 μL e il volume massimo è di 250 μL.
   4. Coprire l'overchamber con una membrana di dialisi e fissare la membrana con l'O-ring elastico (Figura 6B).
      NOTA: Questa configurazione è diversa dai pulsanti di microdialisi in cui ogni camera è sigillata direttamente da una membrana di dialisi. Nella cella di flusso, la membrana di dialisi è invece fissata alla sovracamera permettendo il montaggio di cristalli senza la sua rimozione. A questo scopo, la sovracamera può semplicemente essere svitata dal serbatoio.
   5. Capovolgere la sovracamera e posizionarla sopra la camera di dialisi. Premerlo lentamente e delicatamente per rimuovere tutta l'aria intrappolata tra i due pezzi ed evitare bolle nella camera (Figura 6C). La pratica con una proteina modello può essere vantaggiosa quando ci si allena per evitare bolle d'aria e perdita di campioni.
   6. Fissare il serbatoio nella sua posizione avvitarlo delicatamente sopra la sovracamera, essendo di nuovo consapevole di evitare di intrappolare bolle d'aria. Il serraggio eccessivo del serbatoio può anche formare bolle nella camera di cristallizzazione (Figura 6D).
   7. Aggiungere la soluzione di cristallizzazione e coprire la camera del serbatoio con il tappo ermetico. (Figura 6G). Il volume massimo del serbatoio è di 1 mL.
   8. Trasferire questo assieme e inserirlo nel supporto in ottone. Questo supporto è in contatto con elementi Peltier che vengono utilizzati per controllare la temperatura.
   9. Come illustrato nella figura 6, il cappuccio ermetico è dotato di una finestra ottica per consentire l'illuminazione superiore della camera di dialisi. Mettere la sorgente luminosa (Figura 2) sulla finestra permettendo alla luce di passare attraverso la camera.
   10. La camera del serbatoio può essere collegata a una pompa per consentirgli di funzionare come una cella a flusso continuo. Collegare il tubo sopra i tubi da 50 ml che contengono le soluzioni di stoccaggio e l'acqua distillata alla valvola rotante, come illustrato nella figura 7.
       NOTA: Se durante l'esperimento non si desidera la preparazione automatica e la modifica delle soluzioni di cristallizzazione, omettere il passaggio 2.1.10. In tal caso, la soluzione di cristallizzazione deve essere preparata e il serbatoio precompilato manualmente.
2. Software
   1. Accendere il computer e avviare il software Croissance cristalline [Crystal growth]. Questo software di controllo è scritto con LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) e offre un'interfaccia grafica intuitiva. Include 4 diverse interfacce grafiche (Accueil [Benvenuto], Paramétrage [Impostazione], Essai [Test] e Manutenzione [Manutenzione]) (Figura 8).
      NOTA: Le traduzioni dal francese sono tra parentesi.
   2. Selezionare la visualizzazione Manutenzione facendo clic sul pulsante illustrato nella figura 8. Questa vista è attualmente la più utilizzata e consente agli utenti di controllare la maggior parte dei parametri durante l'esperimento.
      NOTA: dopo aver fatto clic sulla vista Manutenzione, apparirà una nuova finestra con diverse sezioni per il controllo di parametri come temperatura o luce. Nella figura 8 diverse parti di questa vista vengono visualizzate con frecce e fotogrammi. Nei passaggi seguenti viene illustrato come ogni parametro viene controllato utilizzando il software.
   3. La sezione Régulateur de température consente il controllo e il monitoraggio della temperatura. Fare clic sul pulsante, il numero uno (1) nella figura 8, per attivarlo.
      NOTA: l'intervallo di temperatura in OptiCrys è di 233,0 - 353,0 ± 0,1 K.
   4. Impostare la temperatura nella sezione del destinatario [setpoint] e premere INVIO (Figura 8(2)). Sotto questo pulsante, c'è un grafico con 2 tracce (rosso e giallo). La traccia rossa mostra la temperatura finale (ordinata) e la traccia gialla mostra la temperatura corrente. Come mostrato nella figura8(2),la temperatura è impostata a 20 °C.
      NOTA: Per far crescere un cristallo, come spiegato nella sezione di crescita del cristallo, dovranno essere scelte molte temperature. Per modificare la temperatura, aggiungere ogni nuova temperatura nella sezione del destinatario [setpoint] e premere il pulsante INVIO sulla tastiera.
   5. Accendere la luce aumentando la luminosità dalla sezione Lumières [Lights] nella figura 8. La luminosità varia da 0 a 100, "0" indica che la luce è spenta e a "100" la luce è impostata al massimo di intensità e luminosità. Aumentando la luce, nella sezione Microscopio, si può vedere all'interno della camera di dialisi. Durante l'esperimento, la luminosità nella cella può variare; regolare i parametri per visualizzare chiaramente all'interno della camera di dialisi. L'ingrandimento può anche essere aumentato o ridotto utilizzando i pulsanti + e - davanti allo "zoom" per una migliore visualizzazione.
   6. Sul lato destro della sezione Microscopio, ci sono diverse sezioni per memorizzare informazioni rilevanti per ogni esperimento di cristallizzazione. Ogni utente può creare una cartella per memorizzare informazioni sulle condizioni di cristallizzazione, sui nomi delle proteine e sul taglio del peso molecolare della membrana di dialisi utilizzata (Figura 8(3)).
   7. L'utente può definire un nome per l'esperimento semplicemente digitandolo sul Dossier Nom [Nome cartella]. Facendo clic sul pulsante Dossier [Folder] (visualizzato con una cornice verde nella figura 8) viene aperta una nuova finestra. In questa finestra, ci sarà un file di testo che contiene tutte le informazioni definite per l'esperimento. Inoltre, le immagini con timestamp vengono salvate in questa cartella per un'elaborazione futura.
   8. Nella sezione Immagini NB selezionare il numero di immagini che devono essere scattate nel corso dell'esperimento. Specificare il numero di immagini nel pannello di destra insieme all'intervallo di tempo desiderato tra queste (ad esempio, min, ora, giorno). La figura 8 mostra la configurazione del software per registrare zero immagini in un minuto.
      NOTA: Utilizzare la sezione Pompe [Pump] per miscelare soluzioni di stock e iniettare soluzione di cristallizzazione nella camera del serbatoio. Cfr. sezione 2.1.10 e figura 7 per una spiegazione del principio del sistema di miscelazione dei fluidi.
   9. Concentrazioni di input delle soluzioni stock in Etape 1 [Fase 1]: soluzioni stock. Per l'esperimento di cristallizzazione nella sezione successiva, verranno utilizzati NaCl 4 M e CH₃COONa 1 M pH 4.
      NOTA: Le concentrazioni di soluzioni stock sono in unità molare.
   10. Definire la concentrazione finale di ogni soluzione. Ad esempio 0,75 M per nacl e 0,1 M per CH₃COONa pH 4. Inserire questi elementi nella sezione finale di concentrazione (Figura 8) nell'Etape 2 [Fase 2]: soluzione à préparer [soluzione da preparare]. Premere il tasto Calcolo [Calcolo], visualizzato con una cornice rossa nella figura 8. Il volume finale di ogni soluzione stock che verrà utilizzata nella miscelazione verrà visualizzato nel pannello del volume davanti a ciascun pannello di concentrazione.
   11. Premere il tasto Lancer préparation [Launch preparation] (Figura 8). Come illustrato nella figura 7, la valvola rotante prende ogni soluzione stock e le inietta al tubo di miscelazione tramite un interruttore.
   12. Dopo aver preparato la soluzione di cristallizzazione, fare clic sul pulsante Soluzione Entrée [Entrata soluzione] in Etape 3 [Fase 3]: Flusso della sezione della pompa (telaio giallo nella figura 8). L'interruttore cambia per iniettare la nuova soluzione di cristallizzazione dal tubo di miscelazione nella camera del serbatoio. Per interrompere il processo di scambio, premere il pulsante Arrêt distribution [Distribution Stop].
       NOTA: Osservare il processo di cristallizzazione durante l'esperimento e modificare parametri come temperatura, soluzione di cristallizzazione e zoom, nella corrispondente interfaccia grafica del software di supervisione. Utilizzando il software non è necessario rimuovere il tappo ermetico o la cella di flusso durante l'esperimento, quindi l'unica variabile sarà quella che l'utente cambia attraverso il software.
3. Grande crescita dei cristalli
   1. Aggiungere 15 μL di glisozima con una concentrazione di 30 mg·mL^-1 alla camera di dialisi(figura 6A).
      NOTA: Preparare il campione proteico come descritto al punto 1.1.
   2. Assemblare l'impostazione della dialisi del serbatoio scorrevole a temperatura controllata come descritto nella sezione 2.1 e nella figura 6.
   3. Preparare la soluzione di cristallizzazione. Non dimenticare di filtrare tutte le soluzioni stock prima della preparazione del campione con filtri da 0,22 μm. Per questo esperimento, la soluzione di cristallizzazione contiene 0,75 M NaCl e 0,1 M CH₃COONa pH 4. Questo può essere aggiunto manualmente o utilizzando la camera del serbatoio e il sistema di pompaggio come descritto nelle sezioni da 2.2.10 a 2.2.12.
   4. Impostare la temperatura su 295 K come spiegato nelle sezioni 2.2.3 e 2.2.4 e mostrato nell'immagine 8. In condizioni iniziali, l'equilibrio tra la camera di dialisi e il serbatoio sarà raggiunto dopo circa 90 minuti e i primi nuclei visibili appariranno dopo 22 ore.
   5. Lasciare crescere i cristalli fino a quando non si osservano più cambiamenti visibili nelle dimensioni dei cristalli(Figura 9, pannello 1).
      NOTA: Per determinare il tempo di nucleazione e misurare la variazione delle dimensioni dei cristalli, registrare immagini ogni 15 o 20 minuti, che è rispettivamente 4 o 3 immagini all'ora nella sezione Immagini NB. Per l'osservazione in situ della denaturazione, dell'aggregazione e delle precipitazioni proteiche o della dissoluzione o nucleazione del cristallo, in genere tra pochi secondi e poche decine di minuti sono necessari. Tuttavia, per la crescita del cristallo, questo intervallo è compreso tra pochi minuti e poche ore.
   6. Dopo tre giorni, abbassare la temperatura a 291 K per riavviare la crescita del cristallo. Mantenere costante la temperatura e lasciare che il cristallo si sviluppi(Figura 9,pannello 2). Per questa fase dell'esperimento, sarà sufficiente registrare le immagini ogni 2 ore e controllare ogni 10-12 ore per qualsiasi cambiamento nelle dimensioni dei cristalli. L'esperimento può essere continuato se non si osserva alcun cambiamento nelle dimensioni dei cristalli.
      NOTA: A seconda delle concentrazioni proteiche e precipitanti nella soluzione di cristallizzazione e dei volumi di proteine utilizzate, il tempo necessario per raggiungere l'equilibrio per ogni passo può variare.
   7. Ridurre la temperatura a 288 K per riavviare la crescita del cristallo. Nelle condizioni sperimentali del caso qui presentato, un giorno è sufficiente per raggiungere l'equilibrio(figura 9,panel 3).
   8. Controllare le dimensioni dei cristalli e mantenere una temperatura costante finché il cristallo continua a crescere.
   9. Dopo 4 giorni, ridurre la temperatura a 275 K per riavviare la crescita del cristallo(Figura 9,pannello 4).
      – Nelle condizioni sperimentali del caso presentato, dopo circa 10 giorni si oserà un cristallo di 500 μm in una dimensione (Figura 9).
4. Controllo delle dimensioni del cristallo
   1. Preparare una soluzione proteica e la dialisi del serbatoio scorrevole a temperatura controllata impostata come descritto ai punti 2.3.1 e 2.3.2.
   2. Preparare soluzioni di cristallizzazione con NaCl da 0,9 M e 0,1 M CH₃COONa pH 4.
   3. Impostare la temperatura su 291 K e lasciare crescere i cristalli. Nelle condizioni iniziali, il primo evento di nucleazione inizierà dopo circa un'ora e numerosi cristalli cresceranno nella camera di dialisi per tre ore(Figura 10,passaggi: 1 e 2). Registra le immagini ogni 20 minuti per controllare le dimensioni dei cristalli durante il processo di crescita.
      NOTA: L'ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione è fondamentale per controllare la maggior parte delle proprietà finali dei cristalli generati. La temperatura e la composizione chimica delle soluzioni di cristallizzazione possono essere modificate per sciogliere e riumentare cristalli di dimensioni uniformi. Va anche notato che un campione proteico non viene consumato in un tale esperimento, in quanto le condizioni possono essere invertite per sciogliere di nuovo il campione purché non sia denaturato. Quando si dissolvono i cristalli cambiando temperatura e mantenendo una composizione chimica costante, continuare l'esperimento come segue:
   4. Una volta che i cristalli sono cresciuti a 291 K, questi possono essere sciolti per riumentare di meno cristalli più grandi. Aumentare gradualmente la temperatura oltre i 20 minuti per raggiungere i 313 K. Ci vuole circa un'ora per sciogliere tutti i cristalli all'interno della camera di dialisi(Figura 10,passaggi: 3-5). Registra le immagini ogni 5-15 minuti per monitorare il processo di dissoluzione.
      NOTA: Molte proteine sono sensibili alle alte temperature. Assicurarsi di lavorare entro l'intervallo di temperatura in cui la proteina è stabile per evitare danni / denaturazione. Oltre alla solubilità proteica, la temperatura influisce anche sulla soluzione tampone. Ad esempio, il pH del buffer può cambiare con la temperatura, specialmente nel buffer Tris. In tal caso, è fondamentale impostare il pH in base alla temperatura alla quale viene eseguito l'esperimento¹⁸. Va anche notato che la dissoluzione proteica richiede molto meno tempo (da pochi minuti a poche ore) rispetto alla crescita del cristallo proteico (da poche ore a pochi giorni). In generale, durante la dissoluzione dei cristalli, la temperatura aumenta gradualmente e lentamente (rispettando il breve tempo totale di dissoluzione), principalmente in caso di parziale dissoluzione dei cristalli per evitare l'aumento della mosaicità cristallina. Quando i cristalli crescono, la temperatura può diminuire rapidamente (in meno di un minuto) alla temperatura impostata (rispettando il lungo tempo di crescita totale). Il monitoraggio regolare della camera di cristallizzazione registrando le immagini è consigliabile per prevenire danni alla proteina e aiutare a definire il tempo ottimale per la dissoluzione o la crescita dei cristalli per ogni proteina studiata.
   5. Dopo che tutti i cristalli si sono sciolti, impostare la temperatura a 295 K per avviare un secondo evento di nucleazione(Figura 10, passaggi: 6,7). Registra le immagini ogni 5 minuti per monitorare il secondo processo di nucleazione. In questo passaggio, i primi nuclei appaiono dopo circa 18 minuti.
      NOTA: A questa temperatura, la soluzione si trova nella zona di nucleazione, in prossimità della zona metastabile. Di conseguenza, solo pochi nuclei appariranno nella camera di cristallizzazione.
   6. Continuare l'esperimento ripetendo il flusso di lavoro di ottimizzazione descritto nella sezione 2.3 per la crescita di cristalli più grandi. La durata totale dell'esperimento rappresentato nella figura 10 è di pochi giorni.
      NOTA: Se durante la fase di nucleazione i cristalli appaiono in momenti diversi, cristalli di diverse dimensioni si ottengono nella camera di cristallizzazione. In tal caso, l'aumento della temperatura (nel caso di proteine con solubilità diretta) si tradurrà in una più rapida dissoluzione dei cristalli più piccoli. A seconda dell'effetto di maturazione cinetica, la proteina extra (ottenuta dalla dissoluzione) può quindi essere utilizzata per la crescita dei cristalli più grandi.
      Quando si dissolvono i cristalli a temperatura costante modificando la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione, continuare l'esperimento come segue:
      È anche possibile sciogliere i cristalli coltivati in precedenza modificando la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione durante l'esperimento per riumentare una popolazione di cristalli di dimensioni uniformi in nuove condizioni.
   7. Preparare la soluzione proteica (2.3.1), l'impostazione della dialisi del serbatoio scorrevole a temperatura controllata (2.1) e la soluzione di cristallizzazione (2.4.2) come descritto sopra. In condizioni iniziali nella zona di nucleazione lontana dalla zona metastabile, numerosi piccoli cristalli appariranno nella camera di cristallizzazione e inizieranno a crescere(Figura 11, passaggi: 1,2).
   8. Dopo tre ore, quando molti cristalli di medie dimensioni sono visibili nella camera di cristallizzazione(Figura 11,passo: 3), diminuire gradualmente la concentrazione di NaCl (0,9 M) per raggiungere lo zero. Per questo, preparare una nuova soluzione di cristallizzazione contenente solo soluzione tampone con 0,1 M CH₃COONa pH 4. Utilizzare il sistema di pompaggio per scambiarlo con la soluzione di cristallizzazione nella camera del serbatoio. Seguire i passaggi da 2.2.10 a 2.2.12 per la preparazione e l'iniezione di una nuova soluzione nella camera del serbatoio. Con questa nuova soluzione, quando le soluzioni vengono scambiate, la concentrazione di NaCl diminuisce nella camera fino a quando la soluzione finale nella camera del serbatoio non contiene più di 0,1 M di CH₃COONa pH 4 e nessun NaCl. Acquisisci le immagini ogni 10 minuti per registrare il processo di dissoluzione.
   9. Lasciare che i cristalli si dissolvanocompletamente (Figura 11, passaggi: 4,5). Il tempo di dissoluzione è di circa due ore per questo esperimento. Come accennato in precedenza, il tempo di dissoluzione dipende dal sistema proteico, dalle condizioni di cristallizzazione e dal volume della camera di dialisi utilizzato. L'osservazione regolare della camera di cristallizzazione (vedi sezione Microscopio) e la registrazione di immagini e note durante l'esperimento sono essenziali.
   10. Quando tutti i cristalli all'interno della cameravengono sciolti (Figura 11, fase: 5), utilizzare nuovamente il sistema di pompaggio per preparare una nuova soluzione di cristallizzazione iniettando NaCl a una concentrazione inferiore a quella precedente (0,75 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4).
   11. Iniettare la nuova soluzione nella camera del serbatoio(Figura 11, passaggi: 6,7) e ripetere il flusso di lavoro di ottimizzazione della crescita della cristallizzazione come descritto nella sezione 2.3. Verrà generata una popolazione uniforme di cristalli più grandi. I risultati riportati nella figura 11 sono stati ottenuti dopo alcuni giorni.

Risultati

Nelle sezioni 2.3 e 2.4 vengono presentati tre esempi di crescita ottimizzata dei cristalli, che mostrano l'uso dello strumento e un progetto sperimentale per la coltivazione di cristalli di grandi dimensioni. Per questa dimostrazione, abbiamo usato il lisozima come proteina modello, anche se gli esperimenti di crescita del cristallo sono stati eseguiti con successo con molti altri sistemi proteici utilizzando questo metodo (vedi sopra). Utilizzando e padroneggiando il protocollo qui presentato si può adattarlo ad altri candidati proteici.

Nella sezione 2.3 abbiamo dimostrato che le strategie di cristallizzazione razionale stabilite potrebbero essere utili nella coltivazione di cristalli con volumi di dispersione sufficienti per la cristallografia delle proteine neutroni. Qui dimostriamo che le strategie di ottimizzazione razionale proposte consentono anche la generazione di una popolazione uniforme di cristalli di qualsiasi dimensione specifica necessaria per approcci di determinazione della struttura a valle.

Questi due esperimenti sono progettati per sottolineare l'importanza dei diagrammi di fase nel controllo della nucleazione e della crescita dei cristalli. Qui, il controllo della temperatura e della composizione chimica delle soluzioni di cristallizzazione in combinazione con il monitoraggio del processo di cristallizzazione in tempo reale vengono utilizzati per studiare il diagramma di fase qualitativo. Utilizzando questo metodo, la nucleazione e la crescita del cristallo possono essere ottimizzate razionalmente in modo reversibile. L'uso di un tale approccio seriale riduce anche la quantità di proteine e il tempo necessario per controllare le dimensioni e la qualità dei cristalli.

Nel metodo della dialisi, una^soluzione proteica è separata da una soluzione di cristallizzazione da una membrana semi-permeabile 6 (Figura 5). Questa membrana di dialisi consente a piccole molecole come additivi, buffer e ioni di passare attraverso la membrana ma non macromolecole come proteine^6,20. Questa funzione consente di modificare la soluzione di cristallizzazione nel corso dell'esperimento⁶. Lo scambio della soluzione può essere effettuato manualmente, ad esempio in pulsanti di microdialisi, o in modo automatizzato utilizzando uno strumento sviluppato a questo scopo, OptiCrys⁸.

Nella prima serie di esperimenti, i pulsanti di microdialisi sono stati utilizzati per la cristallizzazione del lysozima bianco uovo di gallina. I pulsanti di microdialisi sono stati immersi in soluzioni di cristallizzazione con diverse concentrazioni di sale. In questo semplice esperimento di griglia di cristallizzazione, l'unica variabile è la concentrazione precipitante mentre la temperatura è mantenuta costante (293 K). Come mostrato nella figura 4, lievi variazioni nella concentrazione di sale inducono una variazione delle dimensioni e del numero di cristalli osservati, consentendo di investigare il diagramma della fase di cristallizzazione. Nella figura 4, pannello 1, la soluzione di cristallizzazione contiene 0,7 M NaCl e un numero limitato di cristalli più grandi sono apparsi nei pulsanti. Aumentando la concentrazione di sale da 0,7 a 1,2 M, la supersaturazione aumenta e la soluzione nella zona di nucleazione si allontana dalla zona metastabile(Figura 4,pannelli da 1 a 6). Di conseguenza, il numero di cristalli aumenta e le loro dimensioni diminuiscono.

Nel primo esperimento con uno strumento completamente automatizzato che consente la cristallizzazione della dialisi a temperatura controllata, OptiCrys (Figura 9), l'esperimento di crescita del cristallo è stato progettato per generare una grande crescita cristallina. L'esperimento è stato avviato ad una temperatura iniziale di 295 K con una soluzione di cristallizzazione contenente 0,75 M NaCl e 0,1 M Na acetato tampone pH 4. In queste condizioni sperimentali, la soluzione di cristallizzazione ha raggiunto la zona di nucleazione in prossimità della zona metastabile del diagramma di fase(figura 9, freccia 1). Di conseguenza, solo pochi nuclei sono stati generati durante la prima fase dell'esperimento. Per far crescere ulteriormente cristalli selezionati (mostrato nella figura 9),il flusso di lavoro di ottimizzazione della crescita del cristallo è stato spinto verso la zona metastabile variando la temperatura non appena è stato raggiunto l'equilibrio cristallo-soluzione.

Ogni volta che è stato raggiunto l'equilibrio tra cristallo e soluzione, la temperatura è stata abbassata, prima a 291 K, poi a 288 K e infine a 275 K, per mantenere la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile. Il risultato di questo esperimento è un singolo grande cristallo adatto sia per la radiografia macromolecolare che per la cristallografia neutronica.

Per la maggior parte delle proteine, il preciso diagramma di fase quantitativa (o solo un diagramma qualitativo) non è stato ancora ottenuto a causa della mancanza di dispositivi sperimentali in grado di misurare con precisione la concentrazione proteica (o semplicemente di osservare / rilevare il processo di cristallizzazione in tempo reale) durante gli esperimenti di cristallizzazione¹⁸. Di conseguenza, spesso non è possibile progettare l'esperimento in modo tale che la cristallizzazione inizi nell'area ottimale del diagramma di fase, in prossimità della zona metastabile.

Pertanto, uno studio di ottimizzazione della cristallizzazione deve avvenire prima che l'esperimento dedicato alla crescita di un cristallo di grande volume sia intrapreso. In questo studio, utilizzando variazioni di temperatura (a composizione chimica costante) da un lato e variazioni nella composizione chimica (a temperatura costante) dall'altro, sono necessari per identificare la zona metastabile e delineare le condizioni ottimali per l'avvio di un grande esperimento di crescita cristallina.

A tal fine, vengono presentati altri due esperimenti su misura per dimostrare la reversibilità degli esperimenti di cristallizzazione della dialisi a temperatura controllata con OptiCrys per nucleazione, crescita cristallina, dissoluzione e ri-crescita. Il flusso di lavoro di ottimizzazione della crescita dei cristalli è stato controllato in modo da umentare una popolazione uniforme di meno cristalli di lisozima più grandi, utilizzando variazioni di temperatura o concentrazione precipitante.

Nel secondo esperimento con OptiCrys, la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione è stata mantenuta costante durante l'esperimento (0,9 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4) a temperatura variabile. La temperatura iniziale è stata fissata a 291 K. I risultati di questo esperimento sono riassunti nella figura 10. A causa dell'elevata sovrasaturazione, un gran numero di piccoli cristalli apparve nella camera di cristallizzazione(Figura 10,pannelli 1 e 2). Secondo il concetto di solubilità diretta delle proteine, aumentando gradualmente la temperatura a 313 K, tutti i cristalli sono stati sciolti(figura 10,pannelli 3, 4 e 5). Infine, abbassando la temperatura a 295 K, la seconda nucleazione è stata avviata in prossimità della zona metastabile e ha permesso la formazione controllata di un numero inferiore di nuclei. Un'ulteriore crescita dei cristalli ha portato alla generazione uniforme di una popolazione di cristalli più grandi(figura 10, pannello 7).

Come mostrato nella figura 11, la variazione della composizione chimica della soluzione di cristallizzazione, ad una temperatura costante di 291 K, può anche essere utilizzata per ottenere una popolazione uniforme di cristalli più grandi. Simile all'esperimento precedente, la condizione iniziale era di 0,9 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4. La concentrazione di NaCl è stata quindi gradualmente abbassata da 0,9 M a zero per sciogliere i cristalli(Figura 11,pannelli 4 e 5). A questo punto, NaCl è stato completamente sostituito da una soluzione tampone di 0,1 M CH₃COONa pH 4. La riduzione della concentrazione di sale mantiene la soluzione nella zona sottosatura del diagramma di fase, che porta alla dissoluzione dei cristalli. Quindi, una nuova soluzione di cristallizzazione con minore resistenza ionica, a 0,75 M NaCl in 0,1 M CH₃COONa pH 4, è stata iniettata nella camera del serbatoio. A questa concentrazione precipitante sono apparsi i primi nuclei(figura 11, pannello 6) dopo 90 minuti. Il numero di cristalli generati era inferiore e i cristalli raggiungono un volume maggiore(Figura 11, pannello 7) rispetto a prima.

Figura 1: Diagramma di fase schematico. Le traiettorie cinetiche per tre tecniche di cristallizzazione sono rappresentate in un regime di salatura. Ogni metodo raggiunge la nucleazione e la cristallizzazione in modo diverso, visualizzato da una diversa via cinetica attraverso il diagramma di fase per raggiungere le zone nucleazione e metastabili. La curva di solubilità separa le regioni di sottosaturazione e supersaturazione. La supersaturazione è divisa in tre zone: metastabile, nucleazione e precipitazione. Nella zona di nucleazione, la nucleazione spontanea si verifica mentre nella zona metastabile avviene la crescita del cristallo. Questa figura è adattata da Junius et al. ⁸Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rappresentazione schematica del banco di cristallizzazione (OptiCrys). La sorgente luminosa a LED si trova sopra la cella di flusso della dialisi a temperatura controllata. Un microscopio invertito e la fotocamera digitale sono mostrati in alto a destra dell'immagine con la freccia rossa. Il cerchio rosso rappresenta la posizione del tubo del refrigeratore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Schema schematico della fase di cristallizzazione delle proteine bidimensionali in funzione della temperatura (A) e della concentrazione precipitante (B). (A) Nel caso di una proteina con solubilità diretta, la diminuzione della temperatura mantiene la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile. La variazione di temperatura può essere ripetuta più volte per controllare il processo di crescita del cristallo fino a ottenere cristalli con il volume desiderato. (B) La modifica della concentrazione della soluzione precipitante può essere utilizzata anche per mantenere la soluzione di cristallizzazione nella zona metastabile per la coltivazione dei cristalli. Questa figura è adattata da Junius et al. ⁸Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Cristalli di lisozima ottenuti con il metodo della dialisi. Questo esperimento è stato eseguito ad una temperatura costante di 293 K in tampone di acetato di sodio 0,1 M pH 4. L'aumento della concentrazione di NaCl da 0,7 M a 1,2 M aumenta il tasso di nucleazione e si traduce in un maggior numero di cristalli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Panoramica del processo di cristallizzazione delle proteine con il metodo della dialisi. (A) Aggiungendo la proteina alla camera del pulsante di dialisi, (B) sulla parte superiore della camera viene creata una forma a cupola. (C) Un applicatore viene utilizzato per trasferire l'O-ring alla scanalatura del pulsante di dialisi al fine di fissare la membrana di dialisi in posizione. (D) Il pulsante di dialisi è pronto per l'immersione nella soluzione del serbatoio. (E) La soluzione di cristallizzazione passa attraverso la membrana semipermeabile e i cristalli iniziano a formarsi all'interno della camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Visione schematica dell'impostazione della dialisi fluida a temperatura controllata. (A) Il campione proteico viene aggiunto alla camera di dialisi. (B) La membrana di dialisi è fissata sulla sovracamera con un O-ring utilizzando un applicatore. (C) La sovracamera viene girata e fissata sulla parte superiore della camera di dialisi. Le frecce bianche indicano dove sono posizionate le viti sulla sovracamera. (D) La camera del serbatoio è girata in senso orario (E) e fissata sopra la sovracamera. (F) La camera del serbatoio è coperta da un tappo ermetico con connettori a un sistema di pompaggio e (G) la cella di flusso è posizionata nel supporto in ottone. Questa figura è adattata da Junius et al. ⁸Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Preparazione e iniezione della soluzione di cristallizzazione nel serbatoio da parte del sistema fluido (A). I tubi contenenti sale e acqua sono collegati al regolatore pressione/vuoto (B) e alla valvola rotante (C). Utilizzando la pressione, il regolatore pressione/vuoto crea un flusso costante dei liquidi dai tubi alla valvola rotante. Ogni liquido che passa attraverso il misuratore di portata (D) e l'interruttore viene iniettato nel tubo di miscelazione (F). Una volta che tutti i liquidi sono stati aggiunti al tubo di miscelazione, l'interruttore con alcune modifiche inietta la soluzione finale dal tubo di miscelazione nel serbatoio (G). Il liquido scorre attraverso il sistema nella direzione delle frecce nel diagramma contrassegnato in ordine crescente (da 1 a 6). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Visualizzazione della manutenzione del software di supervisione. Questa vista viene utilizzata per controllare diversi parametri come temperatura, luce, soluzione di cristallizzazione e zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Diagramma di fase in funzione della temperatura (le immagini selezionate devono essere tracciate in ordine crescente). Un singolo grande cristallo di lysozima si ottiene cambiando sistematicamente la temperatura da 295 K a 275 K. Ad ogni passo, la crescita del cristallo viene interrotta al raggiungimento della curva di solubilità. La riduzione della temperatura mantenendo la soluzione nella zona metastabile riavvia la crescita del cristallo. Le immagini hanno diversi livelli di ingrandimento. Questa figura è adattata da Junius et al. ^{8,18 Clicca}qui per vedere una versione più grande di questafigura.

Figura 10: Ottimizzazione della crescita dei cristalli a composizione chimica costante mediante controllo della temperatura (le immagini selezionate devono essere tracciate in ordine crescente). L'avvio del processo di nucleazione nella zona di nucleazione a 291 K, lontano dalla zona metastabile, si traduce nella formazione di numerosi cristalli. Aumentando la temperatura a 313 K quindi dissolve i cristalli fino a quando non si vedono nuclei visibili nella camera di dialisi. Infine, diminuendo la temperatura a 295 K si riavvia il processo di nucleazione per la seconda volta portando a un numero limitato di cristalli più grandi. Questa figura è adattata da Junius et al. ^{8,18 Clicca}qui per vedere una versione più grande di questafigura.

Figura 11: Ottimizzazione della crescita dei cristalli a temperatura costante utilizzando variazioni della concentrazione precipitante (le immagini selezionate devono essere tracciate in ordine crescente). Diminuendo la concentrazione del precipitante da 0,9 M a 0 M si sciolgono i cristalli ottenuti durante il primo evento di nucleazione. Il processo di cristallizzazione viene riavviato dall'iniezione dello stesso precipitante ma a minore resistenza ionica, 0,75 M, che porta alla formazione di alcuni cristalli più grandi. Questa figura è adattata da Junius et al. ^{8,18 Clicca}qui per vedere una versione più grande di questafigura.

Discussione

Diverse variabili fisiche, chimiche e biologiche influenzano la cristallizzazione proteica influenzando la solubilità proteica²¹. Tra queste variabili, la temperatura e la composizione chimica della soluzione di cristallizzazione sono utilizzate qui in combinazione con la tecnica della dialisi per migliorare e far crescere grandi cristalli di alta qualità di biomacromolecole per studi di diffrazione neutronica. Utilizzando la conoscenza dei diagrammi di fase, la cristallizzazione è resa più prevedibile. Sebbene sia possibile anche lo screening di diverse condizioni di cristallizzazione in un approccio seriale, l'obiettivo principale dell'uso degli approcci razionali presentati è quello di separare e controllare la cinetica della nucleazione cristallina e della crescita.

Simili a tutti gli studi di cristallizzazione, campioni di proteine pure e omogenee di alta qualità e soluzioni di cristallizzazione senza polvere aumentano il tasso di successo dell'esperimento. La filtrazione e la centrifugazione delle soluzioni sono passaggi essenziali nei protocolli descritti. Conoscere le proprietà fisicochimiche delle proteine studiate come il peso molecolare (per scegliere la membrana di dialisi appropriata), il punto isoelettrico e la solubilità proteica sono cruciali per la progettazione di un esperimento ottimale di crescita cristallina. Inoltre, è necessario prendere in considerazione la stabilità delle proteine a temperature diverse o con sostanze chimiche diverse per prevenire la perdita del campione e aumentare la probabilità di successo. Considerando l'intervallo di temperatura di OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K), un'ampia gamma di proteine può essere cristallizzata usandolo. Ma vale la pena sottolineare che le proteine che sono principalmente termo-stabili, come le proteine provenienti da fonti termofile, trarrebbero il massimo beneficio dagli esperimenti di crescita cristallina a grande volume a temperatura controllata offerti da questo strumento.

Utilizzando una camera di dialisi a basso volume (quando si utilizzano OptiCrys) o pulsanti di microdialisi e vagliando diverse temperature e condizioni di cristallizzazione (ad esempio, griglie di concentrazione precipitante o pH), è possibile ottenere informazioni sulla posizione del limite della zona metastabile (equilibrio cinetico tra nucleazione e zone metastabili). Questo è inestimabile quando si progetta un esperimento di crescita cristallina di successo soprattutto per i nuovi candidati proteici nella cristallizzazione. Senza queste informazioni gli esperimenti possono partire da un'area del diagramma di fase ad alta sovrasaturazione, troppo lontano dal limite della zona metastabile per controllare facilmente la nucleazione cristallina. Sebbene si possa tentare di dissoluzione del precipitato proteico, ad esempio aumentando la temperatura in caso di solubilità diretta, per proteine con ridotta termostabilità, mantenere il campione ad alta temperatura per un periodo di tempo più lungo può rendere irreversibile la precipitazione proteica. Pertanto, la strategia migliore consiste nell'utilizzare una condizione iniziale con una minore supersaturazione situata vicino al limite di metastabilità, dove la nucleazione può essere controllata ed evitare precipitazioni proteiche. In linea con ciò, il prescreening di cristallizzazione riduce la possibilità di avere un precipitato proteico nella camera di dialisi e aumenta il tasso di successo dell'esperimento.

Dopo aver progettato un esperimento, la preparazione di camere di dialisi (OptiCrys) o pulsanti di microdialisi è un altro passo importante. Prevenire la formazione di bolle d'aria nella camera/pulsante di dialisi aumenta la possibilità di una cristallizzazione riuscita soprattutto quando vengono utilizzati piccoli volumi. La presenza di bolle d'aria nella camera di dialisi può anche cambiare la cinetica del processo di cristallizzazione e ridurre la riproducibilità dell'esperimento (perché la superficie di contatto proteina/soluzione è stata modificata). Non solo la proteina ma anche la soluzione di cristallizzazione possono influenzare il successo dell'esperimento. L'utilizzo di nuovi tubi da 50 mL per il sistema di pompaggio ogni volta che si vuole iniziare un nuovo esperimento e lavare i tubi dopo ogni esperimento riduce la possibilità di contaminazione ed evita la creazione di cristalli di sale nell'apparato.

L'uso di pulsanti di microdialisi è un'alternativa quando OptiCrys non è disponibile. Le strategie per ottimizzare la cristallizzazione e monitorare la crescita cristallina sopra menzionate, devono essere eseguite manualmente. In genere ciò richiede di essere al di fuori di un incubatore termoregolato, che può essere problematico quando la regolazione della temperatura è un passaggio critico nella metodologia descritta. Ciò non facilita la modifica della composizione chimica delle soluzioni di cristallizzazione o il monitoraggio della crescita dei cristalli mediante imaging, quindi il processo di crescita dei cristalli non può essere controllato in tempo reale.

La conoscenza del diagramma di fase è alla base dell'utilizzo del banco di cristallizzazione, OptiCrys, per far crescere sistematicamente cristalli di grandi dimensioni e di alta qualità in modo automatizzato. Il controllo di parametri fisicochimici come temperatura, concentrazione precipitante e pH durante la cristallizzazione sposta l'equilibrio proteina-soluzione in una traiettoria cinetica ben definita attraverso il diagramma di fase. Ciò è completato dall'uso di una membrana di dialisi per regolare il trasporto di massa e creare un gradiente controllato nella camera di cristallizzazione che influisce sulle dimensioni e sulla qualità dei cristalli. Pertanto, l'utilizzo sia di dati termodinamici che di traiettorie cinetiche è essenziale per controllare il processo di cristallizzazione al fine di far crescere cristalli di alta qualità. Grazie a OptiCrys, i diagrammi di fase sistematici in uno spazio multidimensionale possono essere studiati con un approccio seriale utilizzando molto meno materiale di prima. Per dimostrare questa metodologia, forniamo qui un caso di studio con una proteina modello, lisozima bianco uovo di gallina. Utilizzando e padroneggiando il protocollo qui presentato si può adattare per veri sistemi^{proteici 5,14,17,18}.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
200 µ l Pulsante per dialisi	Hampton Research	HR3-330	Pulsante per dialisi Piastre
a 24 pozzetti	Jena Bioscience	CPL-132	Piastra di cristallizzazione
a 2 interruttori	FLUIGENT	2SW001	Interruttore
30 μ l Pulsante per dialisi	Hampton Research	HR3-324	Pulsante per dialisi
50 mL Corning Provette per centrifuga	Sigma-Aldrich	CLS430828-500EA	Provette per centrifuga
Acido acetico	Sigma-Aldrich	S2889	Chimico
Albume d'uovo di gallina Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876	Proteina liofilizzata in polvere
Dischi a membrana per dialisi 6-8 kDa Spettro MWCO		132478	Membrana per dialisi
Membrana per dialisi Tubo 6-8 kDa MWCO	Spectrum	132650T	Membrana per dialisi
Microcentrifuga	Eppendorf	Minispin	Centrifuga da banco
Unità di flusso	FLUIGENT	FLU-XL	Misuratore di portata
Flowboard	FLUIGENT	FLB	Flowboard
Sistema di controllo del flusso microfluidico EZ	FLUIGENT	EZ-01000002	Regolatore di pressione/vuoto
MilliporeSigma 0.22 µ m siringa Filtri	Millipore	GSWP04700	0,22 μ m Filtro poroso
M-Switch	FLUIGENT	MSW002	Valvola rotativa
Opticrys	NatX-ray	PRT008	Banco di cristallizzazione
Vetrini con coperchio circolare siliconato	Hampton Research	HR3-231	Vetrini in vetro
Cloruro di sodio ≥ 99%	Sigma-Aldrich	746398	Quadro chimico
	FLUIGENT	SWB002	centralino
Incubatore termoregolato	Memmert	IPP30	Incubatore termoregolato