Constrizione aortica trasversale operativa con sutura assorbibile per ottenere ipertrofia miocardica transitoria

Summary

Questo protocollo presenta un metodo migliorato per ottenere ipertrofia miocardica transitoria con sutura assorbibile, simulando la diminuzione dell'ipertrofia ventricolare sinistra dopo aver rimosso il sovraccarico di pressione. Potrebbe essere prezioso per gli studi sulla precondizione ipertrofica miocardica.

Abstract

Sulla base di costrizioni aortiche due volte trasversali (TAC) nei topi, è dimostrato che il precondizione ipertrofica miocardica (MHP) potrebbe attenuare l'ipertrofia cardiomiocitaria e rallentare la progressione all'insufficienza cardiaca. Per i principianti, tuttavia, il modello MHP è solitamente abbastanza difficile da stabilire a causa degli ostacoli tecnici nel funzionamento del ventilatore, aprendo ripetutamente il torace e sanguinando causato dallo scioglimento. Per facilitare questo modello, per aumentare il tasso di successo chirurgico e ridurre l'incidenza del sanguinamento, siamo passati a suture assorbibili per la prima pettinatura TAC con una tecnica senza ventilatore. Utilizzando una sutura assorbibile di 2 settimane, abbiamo dimostrato che questa procedura potrebbe causare una significativa ipertrofia miocardica in 2 settimane; e 4 settimane dopo l'intervento chirurgico, l'ipertrofia miocardica è stata quasi completamente regredito alla linea di base. Utilizzando questo protocollo, gli operatori potrebbero padroneggiare facilmente il modello MHP con una minore mortalità operativa.

Introduction

Il precondizione ischemica è un fenomeno che induce brevi episodi non letali di ischemia e riperfusione al cuore e ha la capacità di ridurre drasticamente la lesione miocardica¹. Date le ovvie implicazioni cliniche della precondizione ischemica, come la limitazione della dimensione dell'infarto del miocardio² e la soppressione delle tachiaritmie ventricolari dopo la rivascolarizzazione del miocardio^3,ci sono state molte ricerche per sezionare i meccanismi alla base degli effetti cardioprotettivi indotti dalla precondizione^4,5. Al contrario, altri tipi non ischemici di precondizione hanno ricevuto relativamente poca attenzione. L'ipertrofia cardiaca può essere smussata in pazienti con stenosi aortica sottoposta a sostituzione della valvola aortica⁶. Ovunque esista lo stato di ipertrofia miocardica patologica, il principio della precondizione è raramente riportato.

Nel 1991, Rockman et al. Operando il TAC due volte nei topi, abbiamo precedentemente dimostrato che la precondizione ipertrofica miocardica (MHP) porta a una stimolazione ipertrofica transitoria nel cuore rendendo così il cuore più resistente allo stress ipertrofico sostenuto in futuro⁸. Le caratteristiche del modello MHP sono state convalidate dal biomicroscopio ad ultrasuoni e dalla valutazione emodinamica⁹. I punti chiave nella costruzione del modello sono stati l'esecuzione della toracotomia tre volte, del TAC per una settimana, dello scioglimento per una settimana e del TAC secondario per 6 settimane. Tuttavia, lo scioglimento potrebbe causare sanguinamento, il che ha reso difficile essere padroneggiati dai novizi e difficile da popolare. Inoltre, è anche una sfida tecnica per intubare i topi. Un'intubazione impropria potrebbe causare lesioni tracheali, pneumotorace e persino morte nei topi. Pertanto, è necessario e prezioso migliorare alcune procedure durante la costruzione del modello MHP.

Per ridurre la difficoltà del modello e aumentarne il successo, siamo passati alle suture assorbibili per il primo TAC e monitorato il successo del modello misurando il gradiente di pressione attraverso la costrizione aortica sotto ecocardiografia¹⁰. Sulla base del nostro esperimento preliminare, sarebbe difficile indurre un'ipertrofia miocardica sufficiente nei topi con gradiente di pressione troppo bassa, mentre i topi con gradiente di pressione troppo alta svilupperanno insufficienza cardiaca acuta o addirittura morirebbero. Il gradiente di pressione ideale per il modello varia da 40 a 80 mmHg¹¹. Inoltre, questo esperimento non si basava su un ventilatore, che poteva effettivamente evitare manipolazioni tecniche associate al ventilatore e lesioni¹².

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le linee guida della cura e dell'uso degli animali da laboratorio pubblicate dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione n. 85-23 del NIH, rivista nel 1996). I topi maschi C57BL/6J (8-10 settimane, 20-25 g) sono stati forniti dall'Animal Center della South Medical University.

1. Preparazione preoperatoria

1. Pizzicare la punta di un ago da 25 G con un portaaghi e smussarlo con un oggetto duro come il supporto.
2. Passare una sutura assorbibile 5-0 attraverso l'ago e quindi curvarla a 90° con un supporto¹³.
   NOTA: Secondo diversi scopi di ricerca, gli investigatori potrebbero selezionare linee assorbibili con tempi di assorbimento diversi. In questo protocollo, abbiamo usato una sutura assorbibile di 2 settimane per restringere l'arco aortico.
3. Curvare un altro ago da 25 G a 120° e levigare la punta con un supporto da utilizzare come distanziale nella fase di legatura.
   NOTA: Un ago da 25 G è stato utilizzato come distanziale per topi con peso corporeo (BW) >25 g. Utilizzare un ago da 26 G per topi con 19-24 g di BW.
4. Disinfettare il sito operativo con il 75% di alcol.
5. Regolare la temperatura del pad di riscaldamento a 37 °C.
6. Preparare strumenti chirurgici sterilizzati (tra cui 1 forbice oftalmica, 1 micro forbici, 2 pinzette microchirurgiche al gomito, 1 portaaghi e 1 micro portaaghi).

2. Induzione di anestesia e rasatura

1. Anestetizzare un topo mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di xiazina (5 mg/kg) e chetamina (100 mg/kg) diluita in soluzione salina (0,9% NaCl). Confermare l'anestesia completa con il riflesso negativo di prelievo del pedale.
2. Mantenere il mouse in posizione supina fissando gli incisivi con una sutura e fissando gli arti con nastri adesivi.
3. Applicare la crema depilatoria per rimuovere i capelli sul collo e sullo xifoide. Disinfettare l'area con iodio seguito dal 75% di alcol.

3. Chirurgia

1. Fare un'incisione di oltre 10 mm nella posizione della linea mediana tra tacca sovra-sternale e petto con bisturi. Quindi, separare la pelle e la fascia superficiale.
2. Identificare il primo spazio intercostale contando le costole dall'angolo sternale. Eseguire l'incisione nel primo spazio intercostale e il più vicino possibile allo sterno. Penetralo senza mezzi termini con una pinzetta a gomito per aprire questo spazio.
3. Separare delicatamente il parenchima e il timo fino a quando l'arco aortico trasversale non è visibile.
   NOTA: Non danneggiare la pleura parietale per evitare lo pneumotorace.
4. Passa la sutura assorbibile 5-0 sotto l'arco aortico tra l'arteria brachiocefalica e l'arteria carotide comune sinistra con un ago di chiusura¹⁴. Assicurati che l'arteria brachiocefalica, l'arteria carotide comune sinistra e l'arteria succlavia sinistra siano visibili nel campo operativo.
5. Posizionare il distanziale, preparato nel passaggio 1.3, sull'aorta trasversale ed eseguire un doppio nodo sul distanziale con la sutura nel passaggio 3.4.
   NOTA: La punta del distanziale deve essere smussata per evitare di danneggiare l'aorta trasversale durante la rimozione.
6. Rimuovere il distanziale rapidamente ma delicatamente, quindi tagliare le estremità della sutura.
7. Chiudi il primo spazio intercostale e la pelle usando 5-0 suture di nylon. Disinfettare di nuovo la pelle con il 75% di alcol.
8. Posizionare il mouse sulla pastiglia riscaldante per favorire il recupero. Iniettare buprenorfina (0,1 mg/kg, q12h) per via intraperitoneale per i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
9. Riportare il mouse nella gabbia in una stanza a ciclo chiaro / scuro di 12 ore quando recupera conoscenza.
10. Eseguire un intervento chirurgico fittizio identico a tutti i passaggi precedenti ma senza la costrizione (passaggio 3.5).
11. Eseguire un intervento chirurgico per il gruppo di sutura di seta, identico a tutti i passaggi precedenti ma utilizzando una sutura di seta 5-0 nel passaggio 1.2.

4. Valutazione ecocardiografica della legatura e delle misurazioni di successo

1. Eseguire la valutazione ecocardiografica il giorno (D) 7 dopo l'intervento chirurgico.
2. Anestetizzare il topo con il 3% di isoflurane per inalazione per induzione e l'1,5% per mantenere la profondità dell'anestesia, con una portata di ossigeno di 0,5-1 L/min.
3. Posizionare il mouse in posizione supina sulla piattaforma, mantenuto a 37 °C, e rastreliare gli arti sull'elettrodo.
4. Rimuovere i peli del petto con una crema depilatoria e applicare l'agente di accoppiamento ad ultrasuoni sul petto del topo.
5. Valutare la costrizione aortica trasversale con una sonda a 30 MHz.
   1. Inclinare la piattaforma all'estrema sinistra. Mantenere la sonda in posizione verticale e abbassarla sul petto lungo la linea parasternale destra. Quindi, manipolare l'asse X e l'asse Y in modalità B fino a quando l'arco aortico non è chiaramente visibile.
   2. Individuare la costrizione in modalità B per ottenere la vista ad arco aortico¹¹. Utilizzare la modalità Doppler a colori e l'onda pulsata per misurare la velocità del flusso di picco e selezionare i topi con una velocità superiore a 3.000 mm/s come gruppo TAC (i valori si basano su esperimenti preliminari).
   3. Calcolare il gradiente di pressione secondo la versione modificata dell'equazione^{11 di}Bernoulli:
      gradiente di pressione = 4 x V_max².
      NOTA: Il gradiente di pressione ideale per il modello di costrizione aortica trasversale varia da 40 a 80 mmHg¹¹.
   4. Salvare i dati e le immagini utilizzando Cine Store e Frame Store.
6. Valutare le dimensioni e la contrattilità del ventricolare sinistro (LV) con una sonda a 30 MHz.
   1. Reimpostare la piattaforma in posizione orizzontale. Mantenere la sonda a 30° in senso antiorario rispetto alla linea parasternale sinistra.
   2. Utilizzare la modalità B e manipolare X e Y per ottenere una vista dell'asse chiara e a lungo termine del cuore.
   3. Premere la modalità M per visualizzare la linea dell'indicatore. Acquisire immagini con Cine Store e Frame Store per una successiva misurazione della dimensione della camera LV, dell'accorciamento frazionato e dello spessore della parete LV.
7. Una volta fatto, interrompere l'inalazione di isoflurane e consentire al mouse di riprendersi dall'anestesia. Quindi, riportare l'animale nella sua gabbia in una stanza del ciclo chiaro / scuro di 12 ore.
8. Su D14 e D28 dopo l'intervento chirurgico, ripetere i passaggi precedenti per misurare i parametri cardiaci e quindi raccogliere il cuore per studi istologici.

Results

In questo studio, abbiamo diviso casualmente 45 topi in tre gruppi, la farsa, il gruppo di sutura di seta e il gruppo di sutura assorbibile (il numero di ogni gruppo su D0 (linea di base), D14 e D28 dopo il TAC era rispettivamente 15, 10 e 5). Su D7, D14, D21 e D28 dopo l'intervento chirurgico, la velocità di picco ristretta è stata determinata dall'ecocardiografia. La Corte ha riscontrato che la velocità del flusso sanguigno alla costrizione era ancora superiore a 3.000 mm/s nella seconda settimana dopo il TAC, anche se...

Discussion

C'è ancora un'area ampiamente sottoesplorato nella precondizione cardiaca non ischemica. Sulla base dei nostri studi precedenti, siamo passati all'uso di suture assorbibili per migliorare il modello di precondizione ipertrofica miocardica.

Nei rapporti precedenti, molti investigatori usavano la sutura di seta per restringere l'arco^{aortico 8,14,15}. La sutura di seta era facilmente disponibile ed era sp...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sutura assorbibile (5-0)	Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd	5-0	Legatura
Sistema ecografico per animali VEVO2100		Ecocardiografia	VEVO2100 sonica visiva
Illuminatore a luce fredda	Olympus	ILD-2	Light
Termoforo - sistema chirurgico termostatico (ALC-HTP-S1)	SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO	ALC-HTP-S1	Riscaldamento
Isoflurano	RWD scienze della vita	R510-22	Anestesia inalante
Matrx VIP 3000 Vaporizzatore di isofurano	Midmark Corporation	VIP 3000	Anestesia
Sutura medica in nylon (5-0)	Ningbo Medical Needle Co.	5-0	Chiudere la pelle
Pentobarbital sale sodico	Merck	25MG	Anestetizzazione
Bilancia elettronica di precisione	Denver Instrument	TB-114	Sensore di pesatura
Distanziatore			Ago calibro 25
Sutura di seta (5-0)	Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd.	5-0	Legatura Attrezzature
microchirurgia di piccoli animali	Napox	MA-65	Strumenti chirurgici
Gel di trasmissione	Guang Gong pai	250ML	Ecocardiografia
Veet crema depilatoria	Reckitt Benchiser	RQ/B 33 Tipo 2	Rimuovere i peli dei topi
Sterilizzatore a vapore a pressione elettrotermica automatica verticale	Hefei Huatai Medical Equipment Co.	LX-B50L	Pulizia automatica degli strumenti chirurgici