Articolo metodologico

Isolamento dell'istono dal tessuto fogliare di sorgo per la profilazione della spettrometria di massa dall'alto verso il basso dei potenziali marcatori epigenetici

DOI:

10.3791/61707

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4 marzo 2021

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1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo è stato sviluppato per estrarre efficacemente istoni intatti dai materiali fogliari di sorgo per la profilazione di modifiche post-tras trasunzionali istone che possono servire come potenziali marcatori epigenetici per aiutare le colture resistenti alla siccità ingegneristica.

Abstract

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Gli istoni appartengono a una famiglia di proteine altamente conservate negli eucarioti. Impacchettano il DNA in nucleosomi come unità funzionali di cromatina. Le modifiche post-trascizionali (PTM) degli istoni, che sono altamente dinamiche e possono essere aggiunte o rimosse dagli enzimi, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dell'espressione genica. Nelle piante, i fattori epigenetici, comprese le PTT istono, sono correlati alle loro risposte adattive all'ambiente. Comprendere i meccanismi molecolari del controllo epigenetico può portare opportunità senza precedenti per soluzioni innovative di bioingegneria. Qui descriviamo un protocollo per isolare i nuclei e purificare gli istoni dal tessuto fogliare di sorgo. Gli istone estratti possono essere analizzati nelle loro forme intatte mediante spettrometria di massa dall'alto verso il basso (MS) accoppiata con cromatografia liquida in fase inversa (RP) online (LC). Le combinazioni e la stechiometria di più PTM sullo stesso proteoforma istono possono essere facilmente identificate. Inoltre, il ritaglio della coda istonale può essere rilevato utilizzando il flusso di lavoro LC-MS dall'alto verso il basso, producendo così il profilo PTM globale degli istoni principali (H4, H2A, H2B, H3). Abbiamo applicato questo protocollo in precedenza per profilare le PLOM istone dal tessuto fogliare di sorgo raccolte da uno studio sul campo su larga scala, volto a identificare marcatori epigenetici di resistenza alla siccità. Il protocollo potrebbe potenzialmente essere adattato e ottimizzato per il sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq), o per lo studio delle PTM istonali in piante simili.

Introduzione

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Si prevede che la crescente gravità e frequenza della siccità influirà sulla produttività delle colturecerealicole 1,2. Il sorgo è una coltura alimentare ed energetica di cereali nota per la sua eccezionale capacità di resistere alle condizioni di limitazionedell'acqua 3,4. Stiamo perseguendo la comprensione meccanicistica dell'interazione tra stress da siccità, sviluppo delle piante ed epigenetica delle piante disorgo [Sorgo bicolore (L.) Moench]. Il nostro precedente lavoro ha dimostrato forti connessioni tra microbioma vegetale e rizosfera ....

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Protocollo

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1. Preparazione del materiale fogliare di sorgo

NOTA: Le piante di sorgo sono state coltivate nel suolo del settore a Parlier, CA.

  1. Raccogliere le foglie di sorgo dalle piante in tubi di centrifuga da 50 ml e congelare immediatamente il tubo in azoto liquido. Raccogli il tessuto fogliare strappando la terza e la quarta foglia completamente emersa dal timone primario.
    NOTA: Ulteriori dettagli sulle condizioni del campo, sulla crescita del campione e sulla raccolta sono disponibili nel reportpubblicato 18.
  2. Macinare le foglie con azoto liquido e trasferire immediatamente in un tubo di centrifuga.

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Risultati

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Seguendo il protocollo, gli istoni possono essere estratti e identificati utilizzando l'analisi LC-MS. I dati grezzi e i risultati elaborati sono disponibili presso MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) tramite l'adesione: MSV000085770. Sulla base dei risultati TopPIC del campione rappresentativo (disponibile anche da MassIVE), abbiamo identificato 303 proteoforme istone (106 proteoforme H2A, 72 H2B, 103 H3 e 22 proteoforme H4). Sono state rilevate anche proteoforme ribosomiali co-purificate, tipicamente eluizzanti all'ini.......

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Discussione

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Il protocollo presentato descrive come estrarre gli istoni da campioni di foglie di sorgo (o più in generale foglie vegetali). La resa media dell'istone dovrebbe essere di 2-20 μg per 4-5 g di materiale fogliare di sorgo. I materiali sono sufficientemente puri per l'analisi dell'istone a valle da parte di LC-MS (per lo più istoni con contaminazione da proteine ribosomiali ~20%). È possibile ottenere una resa inferiore a causa di variazioni del campione o potenziali errori di gestione/guasti in tutto il protocollo. Manten.......

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Ringraziamenti

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Ringraziamo Ronald Moore e Thomas Fillmore per aver aiutato con gli esperimenti di spettrometria di massa e Matthew Monroe per la deposizione dei dati. Questa ricerca è stata finanziata da sovvenzioni del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE) Biological and Environmental Research attraverso il progetto Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) con il numero di premio DE-SC0014081, del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), e attraverso il Joint BioEnergy Institute (JBEI), una struttura sponsorizzata da DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) tra Lawrence Berkeley National Laboratory e DOE. La ricerca è st....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetonitrileFisher ChemicalA955-4L
Ditiotreitolo (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, 500mM Soluzione, pH 8.0EMD Millipore Corp324504-500mL
Acido formicoThermo Scientific28905
Guanidina cloridratoSigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
Fosfato di potassio, bibasicoSigmaP3786-100G
Cocktail di inibitori della proteasi, compresse completeRoche5892791001
Butirrato di sodioSigma303410-5GUtilizzato per l'inibitore dell'istone deacetilasi
Cloruro di sodio (NaCl)SigmaS1888
Sodio FluoruroSigmaS7020-100GUtilizzato per l'inibitore della fosfatasi
Ortovanadato di sodioSigma450243-10GUtilizzato per l'inibitore della fosfatasi
SaccarosioSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Resina a scambio cationico debole, maglia 100-200 analitico (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Monouso
Colonna cromatografica (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Tessuto filtrante Mesh 100Millipore SigmaNY1H09000Fa parte del kit Sigma (catalogo # CELLYTPN1) per l'estrazione di nuclei vegetali. È possibile utilizzare filtri simili con la stessa dimensione della maglia.
Puntali per micropipette (P20, P200, P1000)Bilancia Sigma
, 50mL/15mL, Centrifuga, Provetta conicaGenesee Scientific28-103
, Microcentrifuga, 1,5/2 mLSigma
Equipment
Bilancia analiticaFisher Scientific01-912-401
Becher ( 50 ml – 2L)
Microcentrifuga con raffreddamentoFisher Scientific13-690-006
Micropipette
Centrifuga a secchiello oscillante con raffreddamentoFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
Sonicatore a bagnomariaFisher Scientific15-336-120

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
  2. Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....

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Isolamento degli istoniPurificazione dei nucleiCromatografia a scambio ionicoModifiche post traduzionaliCromatografia liquidaAnalisi delle proteoformeDesalazione delle proteine

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