Questo protocollo fornisce strumenti sperimentali in vitro per valutare la trasformazione delle cellule mammarie umane. Vengono descritti i passaggi dettagliati per seguire il tasso di proliferazione cellulare, la capacità di crescita indipendente dall'ancoraggio e la distribuzione di lignaggi cellulari in colture 3D con matrice di membrana basale.
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Articolo metodologico
Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tumorigenesi è un processo in più fasi in cui le cellule acquisiscono capacità che consentono la loro crescita, sopravvivenza e diffusione in condizioni ostili. Diversi test cercano di identificare e quantificare questi tratti distintivi delle cellule cancerose; tuttavia, spesso si concentrano su un singolo aspetto della trasformazione cellulare e, di fatto, sono necessari più test per la loro corretta caratterizzazione. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire ai ricercatori una serie di strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro da un'ampia prospettiva, consentendo così di trarre conclusioni valide.
Un'attivazione prolungata della segnalazione proliferativa è la caratteristica principale dei tessuti tumorali e può essere facilmente monitorata in condizioni in vitro calcolando il numero di raddoppi della popolazione raggiunti nel tempo. Inoltre, la crescita delle cellule nelle colture 3D consente la loro interazione con le cellule circostanti, simile a ciò che accade in vivo. Ciò consente la valutazione dell'aggregazione cellulare e, insieme all'etichettatura immunofluorescente di marcatori cellulari distintivi, di ottenere informazioni su un'altra caratteristica rilevante della trasformazione tumorale: la perdita di una corretta organizzazione. Un'altra caratteristica notevole delle cellule trasformate è la loro capacità di crescere senza attaccamento ad altre cellule e alla matrice extracellulare, che può essere valutata con il saggio di ancoraggio.
Vengono fornite procedure sperimentali dettagliate per valutare il tasso di crescita cellulare, per eseguire l'etichettatura immunofluorescente dei marcatori di lignaggio cellulare nelle colture 3D e per testare la crescita delle cellule indipendenti dall'ancoraggio nell'agar morbido. Queste metodologie sono ottimizzate per le cellule epiteliali primarie del seno (BPEC) a causa della sua rilevanza nel cancro al seno; tuttavia, le procedure possono essere applicate ad altri tipi di celle dopo alcune regolazioni.
Introduzione
Sono necessari più eventi successivi per lo sviluppo della neoplasia. Nel 2011, Hanahan e Weinberg hanno descritto 10 capacità che consentono la crescita, la sopravvivenza e la diffusione delle cellule trasformate: i cosiddetti "Hallmarks of Cancer"1. La metodologia qui descritta compila tre diversi strumenti per valutare la trasformazione cellulare in vitro concentrandosi su alcune delle caratteristiche distintive delle cellule tumorali. Queste tecniche valutano il tasso di proliferazione cellulare, il comportamento delle cellule quando coltivate in 3D e la loro capacità di formare colonie con indipendenza di ancoraggio.
I modelli cellulari sono fondamentali per testare l'ipotesi in vitro. Diversi approcci sono stati sviluppati per generare modelli sperimentali di trasformazione cellulare per lo studio del cancro2,3,4. Poiché il cancro al seno è il cancro più comune tra le donne in tutto il mondo ed è responsabile di circa il 15% dei decessi per cancrotra le donne 5, fornire modelli cellulari adatti di cellule epiteliali mammarie è della massima importanza per ulteriori indagini. In questo articolo, abbiamo illustrato il potenziale di tre tecniche per valutare la trasformazione cellulare utilizzando un modello sperimentale di trasformazione delle cellule epiteliali primarie del seno (BPEC) inizialmente descritto da Ince e colleghi nel 20076 e successivamente implementato nel nostro laboratorio7. Questo modello sperimentale si basa sull'alterazione sequenziale di tre geni mirati (SV40 Large T e piccoli antigeni t qui indicati come Ttag, hTERTe HRAS) al genoma dei BPEC non trasformati. Inoltre, il metodo utilizzato per la derivazione dei BPEC favorisce il mantenimento di cellule epiteliali mammarie con marcatori luminali o mioepiteliali, risultando in una coltura cellulare eterogenea che conserva alcuni dei tratti fisiologici della ghiandola mammaria.
Nella ghiandola mammaria, le cellule epiteliali mammarie luminali, che sono responsabili della produzione di latte, si trovano vicino al lume, mentre le cellule mioepiteliali vengono smaltite intorno alle cellule luminarie e si prendono cura dei movimenti di contrazione che portano il latte al capezzolo. La perdita di una corretta organizzazione tra questi lignaggi cellulari è una caratteristica dellatrasformazione tumorale 8 che può essere valutata in vitro dopo il rilevamento immunofluorescente di marcatori di lignaggio distintivi nelle colture cellulari 3D. Un'altra caratteristica importante delle cellule tumorali è la loro capacità di crescere senza attaccamento ad altre cellule e alla matrice extracellulare1. Quando le cellule sane sono costrette a crescere in sospensione, meccanismi come anoikis \u2012 un tipo di morte cellulare indotta in risposta al distacco dalla matrice extracellulare \u2012vengono attivati 9. L'evasione della morte cellulare è uno dei tratti distintivi del cancro e quindi, le cellule trasformate sono in grado di inattivare l'anoikis e sopravvivere in modo indipendente dall'ancora. Questa capacità può essere valutata in vitro con il saggio indipendente dall'ancoraggio utilizzando l'agar morbido. Inoltre, una caratteristica intrinseca dei tessuti tumorali è la loro capacità di segnalazione proliferativa sostenuta, che può essere facilmente monitorata in condizioni in vitro misurando l'aumento del numero di cellule nel tempo, non solo nei test di sospensione ma anche monitorando il tasso di crescita delle colture aderenti monostrato.
Nonostante il miglior modello per testare il potenziale tumorigenico sia l'inoculazione delle cellule tumorali nei modelli murini e la valutazione dello sviluppo tumorale in situ, è importante ridurre al minimo il più possibile il numero di animali impiegati nelle procedure sperimentali. Pertanto, avere test adeguati per valutare la trasformazione in vitro è una priorità assoluta. Qui, forniamo una serie di strumenti per valutare il potenziale tumorigenico delle cellule epiteliali del seno parzialmente e completamente trasformate che possono essere facilmente implementate nella maggior parte dei laboratori che lavorano con modelli di trasformazione cellulare.
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Protocollo
Campioni umani utilizzati nei seguenti esperimenti sono stati ottenuti da mammoplastiche di riduzione effettuate a Clínica Pilar Sant Jordi (Barcellona) con il consenso di procedura standard. Tutte le procedure sono eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II, salvo diversa indicazione.
1. Coltura in vitro di cellule epiteliali mammarie umane e accumulo della trama della curva di crescita
-
Coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del seno (BPCC): passaging cellulare
NOTA: Per la derivazione del BPEC e la coltura cellulare seguire le istruzioni descritte da Ince et al., 20076.- Preparazione media.
- Integrare wit supporto definito basale con integratori P o T, fornito dal produttore, a seconda che i BPEC primari o trasformati siano coltivati.
- Aggiungere la tossina colera al mezzo WIT integrato fino ad una concentrazione finale di 100 ng/mL per il primario o di 25 ng/mL per i BPEC trasformati.
ATTENZIONE: La tossina colera è fatale se ingerita. Utilizzare dispositivi di protezione individuale. Evitare il suo rilascio nell'ambiente.
- Manutenzione e passamento della coltura cellulare.
NOTA: Per i seguenti passaggi tenere presente che le cellule crescono in un pallone T25. Tuttavia, i volumi possono essere adattati ad altri formati di coltura cellulare mantenendo la proporzionalità in termini di superficie.- Controlla la confluenza cellulare ogni giorno. Quando le impostazioni cultura sono confluenti al 90%, eseguire la passaging delle celle.
- Acquisire 1x PBS, 3x tripside, medio e un tubo conico da 15 ml contenente 2 ml di siero bovino fetale (FBS) per ogni pallone.
- Rimuovere il mezzo dal pallone e tenerlo nel tubo conico da 15 ml contenente FBS.
- Risciacquare le cellule con 1x PBS.
- Staccare le celle dalla superficie aggiungendo 1 mL di tripside 3x. Incubare per 5 minuti a 37 °C.
- Verificare se le celle sono state staccate. Applicare uno scuotimento vigoroso se le cellule non sono completamente staccate.
- Inattivare la tripina aggiungendo il supporto riservato integrato con FBS.
- Raccogliere la sospensione cellulare e posizionarla nel tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare a 500 x g per 5 minuti, eliminare il supernatante e rimescolare le cellule pellettate facendo scorrere il fondo del tubo con un dito.
- Aggiungere 1-2 mL di mezzi freschi al pellet e misurare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore automatico delle celle o un emocitometro. Questi dati saranno successivamente utilizzati per calcolare il raddoppio della popolazione e disegnare la curva di crescita. Seme 12.000 cellule/cm2 (ad esempio, 300.000 cellule per un pallone T25) in contenitori di superficie di coltura cellulare modificati (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: Diluire la soluzione di sospensione cellulare se la concentrazione è troppo alta per garantire una corretta quantificazione. - Aggiungere il medio a un volume finale di 5 mL e incubare le cellule a 37 °C e al 5% di ATMOSFERA di CO2.
- Sostituire il mezzo di coltura cellulare ogni 48 ore.
- Preparazione media.
-
Calcolo del raddoppio della popolazione e visualizzazione dei dati
- Utilizzando i dati del conteggio delle celle ottenuto nel passaggio 1.1.2.10, applicare la formula seguente per ottenere i valori di raddoppio della popolazione accumulata (PD):
Dove, PDi denota il numero di raddoppi della popolazione raggiunti dalle cellule fino alla sottocoltura precedente (si riferisce al PD accumulato nella sottocoltura precedente), Nh è il numero di cellule raccolte, e Nsè il numero di cellule sementi. - Rappresentare i dati per un intervallo di tempo specifico utilizzando un grafico XY in cui sono rappresentati il numero di giorni nelle impostazionicultura (asse x)e il PD accumulato (asse y).
- Ottieni la linea più adatta e l'equazione del raccordo:
NOTA: Una pendenza maggiore (b) significa un aumento del tasso di proliferazione.
- Utilizzando i dati del conteggio delle celle ottenuto nel passaggio 1.1.2.10, applicare la formula seguente per ottenere i valori di raddoppio della popolazione accumulata (PD):
2. Coltura tridimensionale (3D) nella matrice della membrana basale e nel rilevamento di proteine immunofluorescenti
- Coltura 3D nella matrice a membrana basale
NOTA: Questo protocollo è stato adattato da Debnath et al., 200310 ed è ottimizzato per 24 piastre di pozzo (vedi Tabella dei materiali).- Preparare il materiale un giorno prima dell'esperimento: pre-raffreddare la matrice della membrana basale durante la notte a 4 °C e lasciare raffreddare punte di pipette, tubi di microcentrifugo e piastre di pozzo nel congelatore.
NOTA: La matrice deve essere mantenuta a -20 °C per la conservazione a lungo termine. Creare aliquote per evitare più cicli di congelamento-scongelamento. - Il giorno dell'esperimento, posizionare il materiale pre-raffreddato sul ghiaccio.
- Risciacquare i pozzi con 1x PBS sterile a freddo al fine di ridurre la tensione superficiale.
- Coprire il fondo di ogni pozzo con 100 μL di matrice di membrana basale.
NOTA: Distribuire lentamente la matrice e diffonderla in tutto il pozzo; è fondamentale evitare la formazione di bolle nello strato inferiore per evitare la crescita della coltura cellulare monostrato. - Posizionare la piastra nell'incubatore, a 37 °C, per lasciare che lo strato della matrice si solidifichiamo.
NOTA: Di solito ci vogliono circa 20 minuti per solidificarsi. - Nel frattempo, tripinare le cellule come spiegato in precedenza nel passaggio 1.1. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti e rimosi in mezzo. Preparare una sospensione di 400.000 celle/mL e disaggregare delicatamente qualsiasi ciuffo di cellule mediante pipettaggio.
- Preparare il mezzo con matrice di membrana basale dell'8% e mescolare 1:1 (v/v) con sospensione cellulare per ottenere una soluzione di 200.000 cellule/mL in matrice al 4%.
NOTA: Calcolare la quantità di mezzo necessaria per evitare sprechi inutili della matrice. - Posizionare 500 μL di sospensione cellulare in soluzione matriciale sopra lo strato di matrice già solidificato per seminare una quantità totale di 100.000 cellule in mezzo con matrice di membrana basale al 4%.
- Incubare le cellule a 37 °C per alcuni minuti e quindi aggiungere 500 μL del mezzo con matrice di membrana basale al 4%. Incubare le cellule a 37 °C in un'incubatrice con 5% di CO2 per 14 giorni. Le cellule sementi si raggruppano e proliferano per originare le strutture simili agli acini.
NOTA: La motilità e l'aggregazione cellulare possono essere monitorate per time-lapse durante il processo di formazione 3D. Utilizzare il software di analisi delle immagini (ad esempio, Fiji/ImageJ o Imaris) per valutare questi eventi. Il numero e le dimensioni degli acini dipendono dal processo di aggregazione e dal tasso di proliferazione e possono variare tra i tipi di cella. Regolare la concentrazione della matrice della membrana basale e le cellule sementi per ottenere le strutture 3D desiderate. - Aggiungere 500 μL del mezzo con il 4% di matrice di membrana basale 2-3 volte a settimana.
NOTA: Evitare il disturbo degli strati che trasportano delicatamente la piastra durante la manipolazione. - Se lo si desidera, il numero e le dimensioni di acini possono essere misurati durante il periodo di coltura. Per fare ciò, scatta foto casuali in momenti diversi dopo la semina usando un contrasto di fase o un microscopio invertito DIC. Utilizzare il software di analisi delle immagini per misurare il diametro delle strutture 3D 100-200.
- Preparare il materiale un giorno prima dell'esperimento: pre-raffreddare la matrice della membrana basale durante la notte a 4 °C e lasciare raffreddare punte di pipette, tubi di microcentrifugo e piastre di pozzo nel congelatore.
- Immunostaining
NOTA: Non sono richieste condizioni sterili durante questa parte del protocollo.- Rimuovere il supporto per le impostazioni cultura.
- Strappare la matrice della membrana del seminterrato utilizzando una punta della pipetta p200 con l'estremità tagliata. Posizionare ~50 μL di matrice disaggregata sopra uno scivolo di vetro e spalmarlo in un'area di 1-2 cm2.
- Lasciare asciugare completamente il campione a temperatura ambiente o utilizzare una piastra riscaldante a 37 °C per accelerare il processo. Fissare i campioni con metanolo:acetone (1:1, v/v) a -20 °C per 30 min.
NOTA: Il segnale fluorescente dei marcatori precedenti, come quello delle proteine fluorescenti espresse dalle cellule, verrà cancellato.
ATTENZIONE: Il metanolo è infiammabile, tossico se inalato, ingerito o nel caso in cui venga a contatto con la pelle. Indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare all'interno di una cappa aspirante. - Scartare la soluzione di fissazione e rimuovere l'eventualità in eccesso reclinando la diapositiva su carta da filtro.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Una volta asciutti, i vetrini possono essere conservati a -20 °C per diversi mesi. - Campioni di blocchi epitopi con siero di capra normale al 5% e 0,1% tritone-X-100 in 1x PBS (soluzione di blocco) per 2 ore a temperatura ambiente.
- Nel frattempo, preparare le soluzioni di lavoro degli anticorpi diluire gli anticorpi primari o secondari alla concentrazione desiderata nella soluzione di blocco.
NOTA: La concentrazione di anticorpi deve essere regolata con precisione a seconda del tipo di cellula e del riferimento anticorpale. Come guida, per identificare le cellule da lignaggi luminali e mioepiteliali nel BPEC, è possibile utilizzare anticorpi anti-citocheratina 14 primaria e anti-claudina-IV (vedi Tabelladei materiali). La concentrazione raccomandata della soluzione di lavoro è 1:100 per questi anticorpi primari e 1:500 per gli anticorpi secondari anti-topo e anti-coniglio (vedi Tabella dei materiali). - Aggiungere 30 μL di soluzione di lavoro degli anticorpi primari e coprirlo con una striscia di pellicola da imballaggio di laboratorio per evitare l'evaporazione. Incubare durante la notte a 4 °C in una camera umida.
- Lavare tre volte con 1 PBS per 1 h ciascuno.
- Ripetere il passaggio 2.2.7 per gli anticorpi secondari. L'incubazione deve essere eseguita nell'oscurità.
- Lavare con 1x PBS per 2 ore.
NOTA: Regolare la concentrazione degli anticorpi, il tempo di incubazione e la durezza di lavaggio per migliorare il rapporto segnale/rumore per campioni specifici. - Rimuovere il PBS rimanente e, una volta asciutto, controsostenire con DAPI a 0,25 μg/mL diluito in mezzo di montaggio antifade. Coprire le diapositive con un coverslip lasciandolo depositare senza applicare pressione. Sigillare con smalto per unghie.
NOTA: I campioni possono essere conservati a 4 °C per diverse settimane. Per la conservazione a lungo termine, conservarli a -20 °C. - Analizzare la distribuzione del segnale fluorescente per ogni acinus utilizzando un microscopio confocale.
NOTA: La configurazione del microscopio confocale deve essere determinata con precisione a seconda dell'apparecchiatura utilizzata e degli anticorpi applicati al campione. Come guida, con le apparecchiature e i reagenti dettagliati nella tabella dei materiali,utilizzare un obiettivo 40x e le seguenti impostazioni laser e rivelatori: per DAPI utilizzare l'eccitazione con un laser 405 (3%-5%), rilevamento con rilevatore PMT (800V, Offset: -9) e una banda spettrale da 410 nm a 500 nm; per A488 (Claudin-IV) utilizzare eccitazione con un laser 488 (7%-10%), rilevamento con rilevatore PMT (800V, Offset: -20) e una banda spettrale da 490 nm a 550 nm; e per Cy3 (Citokeratina 14) utilizzare eccitazione con un laser 555 (2%-10%), rilevamento con rilevatore PMT (800V, Offset: -35) e una banda spettrale da 560 nm a 600 nm.
3. Test indipendente dall'ancoraggio, colorazione MTT e quantificazione automatica della colonia
- Test indipendente dall'ancoraggio: placcatura agar e sospensione cellulare
NOTA: Il protocollo è stato adattato da Borowicz et al., 201411 per eseguire esperimenti in BPEC.- Preparare una soluzione di agar all'1,2% diluita in acqua ultrapura in una bottiglia sterile. Autoclavare la soluzione e mantenerla a 42 °C durante l'esperimento. La soluzione di agar può essere conservata a 4 °C; quando necessario, riscaldare la soluzione di agar fino a quando non è di nuovo liquido.
ATTENZIONE: Utilizzare guanti resistenti al calore per evitare ustioni dopo l'autoclave.
NOTA: D'ora in ora in su, le condizioni sterili devono essere mantenute. - Preparare una soluzione di agar dello 0,6% mescolando 1:1 (v/v) mezzo prerifapidto completo con soluzione di agar all'1,2%. Mantenere a 42 °C per evitare la solidificazione prematura.
NOTA: Il mezzo può essere precedentemente doppio integrato per ottenere una soluzione agar + media completamente integrata allo 0,6% una volta miscelata. - Coprire il fondo di un pozzo di 35 mm con 1,5 mL di agar 0,6% in soluzione media e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente. Assicurarsi che il fondo della piastra sia completamente coperto prima della solidificazione dell'agar, altrimenti le cellule possono aderire alla piastra e crescere in monostrato.
NOTA: È possibile utilizzare piastre di superficie aderenti e non aderenti. - Nel frattempo, tripinare le cellule e, una volta centrifugate e rimescolate in mezzo, preparare una soluzione di 50.000 cellule/ml e disaggregare delicatamente qualsiasi ciuffo cellulare tubazionando ripetutamente.
- Preparare una sospensione agar + cellulare dello 0,3% nel mezzo a una concentrazione finale di 25.000 cellule /mL.
NOTA: La concentrazione ottimale delle cellule può differire tra i tipi di cellule. Prova diverse concentrazioni fino a formare colonie individualizzate.- Posizionare un filtro filtrante da 40 μm sopra un tubo sterile da 50 ml e filtrare la soluzione da 50.000 celle/ml lasciandola cadere nella parte inferiore del tubo.
- Rimuovere il filtro dal tubo sterile da 50 ml, inclinare il tubo contenente celle con un angolo di 45° e far cadere lo stesso volume dello 0,6% di agar + soluzione media versandolo attraverso la parete interna del tubo. Ciò consentirà alla soluzione di agar di raffreddarsi quanto basta per non danneggiare le cellule ed evitare la sua solidificazione prematura.
- Omogeneizzare la miscela e depositare 1 mL di 0,3% agar + sospensione cellulare nel mezzo (contenente 25.000 celle) sopra lo strato di agar inferiore precedentemente solidificato.
- Visualizzare le cellule sementi utilizzando un microscopio invertito per assicurarsi che le cellule siano individualizzate. In caso contrario, l'esperimento dovrebbe essere ripetuto.
- Attendere che lo strato di agar sia completamente solidificato, quindi aggiungere con cura 1 mL del mezzo fresco in cima senza disturbare i delicati strati di agar sottostanti.
- Incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 in un'incubatrice per 3 settimane.
NOTA: Il tempo necessario per la formazione della colonia può variare tra i diversi tipi di cellule, ma di solito sono sufficienti 3 settimane. - Cambiare mezzo due volte a settimana. Per fare ciò, inclinare delicatamente la piastra verso di te, aspirare il mezzo nell'angolo inferiore e aggiungere 1 mL di mezzo fresco.
NOTA: Evitare di toccare gli strati di agar mentre si staccano facilmente dalla piastra.
- Preparare una soluzione di agar all'1,2% diluita in acqua ultrapura in una bottiglia sterile. Autoclavare la soluzione e mantenerla a 42 °C durante l'esperimento. La soluzione di agar può essere conservata a 4 °C; quando necessario, riscaldare la soluzione di agar fino a quando non è di nuovo liquido.
- Colorazione MTT
- Preparare la soluzione stock di bromuro di tetrazolo blu tiazolo (MTT) a 6 mg/ml in acqua ultrapura in una bottiglia sterile e soluzione filtrante utilizzando filtri da 0,2 μm. Questa soluzione MTT può essere conservata fino a 6 mesi a -20 °C.
ATTENZIONE: MTT può causare irritazione ed è sospettato di causare difetti genetici. Utilizzare occhiali di sicurezza, guanti e un filtro respiratorio.
NOTA: Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. - Preparare una soluzione di lavoro di MTT a 1 mg/mL diluendo la soluzione stock con acqua ultrapura sterile.
- Una volta concluso il periodo di formazione della colonia, rimuovere il mezzo dalla piastra e aggiungere 1 mL di 1 mg / mL MTT ad ogni pozzo.
- Incubare per 24 ore nell'incubatrice. Rimuovere la soluzione MTT aspirandola delicatamente. Le piastre possono essere conservate a 4 °C per diverse settimane.
NOTA: Evitare l'esposizione alla luce per prevenire la formazione di cristalli non specifici.
- Preparare la soluzione stock di bromuro di tetrazolo blu tiazolo (MTT) a 6 mg/ml in acqua ultrapura in una bottiglia sterile e soluzione filtrante utilizzando filtri da 0,2 μm. Questa soluzione MTT può essere conservata fino a 6 mesi a -20 °C.
- Quantificazione della colonia
- Ottenere immagini di ogni lastra utilizzando un microscopio invertito. Regolare l'ingrandimento per acquisire il campo visivo massimo con meno immagini e essere ancora in grado di rilevare piccole colonie (di solito obiettivi 4x o 10x).
NOTA: assicurarsi che le immagini presentino uno sfondo omogeneo. Non è richiesto né il contrasto di fase né il contrasto di interferenza differenziale poiché le colonie non macchiate non saranno quantificate. - Carica le immagini sul software ImageJ / Fiji12 per contare il numero di colonie e l'area di ogni colonia positiva all'MTT.
NOTA: uno script per la quantificazione automatica è fornito come file supplementare. Per eseguire il codice, incollarlo nell'editor di macro (Plugins | Nuovo | Macro) e seguire le istruzioni.- Ottenere una maschera binaria attraverso la soglia dell'immagine originale (Image | Regolare | Soglia) per ottenere colonie ben delimitate (figura 1).
NOTA: le immagini a 8 o 16 bit sono in genere necessarie per eseguire questo passaggio. Si consiglia il metodo "Soglia minima". - Eseguire Extended Particle Analyzer dal plug-in Biovoxxel13 (plugin | BioVoxxel | Extended Particle Analyzer) per identificare le colonie positive MTT (Figura 2). Condizioni iniziali di guida: Dimensione (μm2) = 250–Infinito; Solidità = 0,75–1,00.
- Ottenere una maschera binaria attraverso la soglia dell'immagine originale (Image | Regolare | Soglia) per ottenere colonie ben delimitate (figura 1).
- Stimare il diametro medio (D) da ogni valore dell'area della colonia (A) in base alla formula:
- Filtra i risultati escludendo le colonie proliferative basse (ad esempio, di basso diametro).
- Scegliere un numero minimo di divisioni alla settimana (m) da prendere in considerazione (ad esempio, 1).
- Stimare il raggio di una colonia (R) con n cellule secondo la seguente formula:
Dove, r è il raggio medio delle singole cellule in sospensione, n è il numero di cellule che formano una colonia che ha sofferto di divisioni m ogni settimana durante w settimane in coltura. In crescita esponenziale: n = 2(m*w). ρ è l'efficienza dell'imballaggio. Si noti che, nel movimento casuale, l'efficienza di imballaggio è ~0,64 e la frazione di imballaggio più densa possibile per sfere identiche è 0,7414. - Scartare tutte le colonie che presentano un diametro inferiore a 2R in quanto le loro cellule non hanno raggiunto il numero minimo di divisioni considerate nel passaggio 3.3.4.1.
- Ottenere immagini di ogni lastra utilizzando un microscopio invertito. Regolare l'ingrandimento per acquisire il campo visivo massimo con meno immagini e essere ancora in grado di rilevare piccole colonie (di solito obiettivi 4x o 10x).
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Risultati
Un modello sperimentale di trasformazione cellulare con l'introduzione di tre elementi genetici nei BPEC è stato scelto per generare risultati rappresentativi della trasformazione oncogenica6,7 (Figura 3). I BPEC non trasformati(N)sono stati derivati da tessuti mammari indenne da malattie come descritto dall'Incee dai colleghi 6 e coltivati secondo il protocollo qui indicato. Dopo ave...
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Discussione
I protocolli sperimentali descritti in questo documento forniscono strumenti utili per valutare la trasformazione oncogenica delle cellule coltivate in vitro. Ogni tecnica valuta aspetti specifici del processo di trasformazione e, pertanto, occorre prestare particolare attenzione quando si vengono tratte conclusioni da una singola analisi. L'accumulo di curve di crescita è un approccio che richiede informazioni già disponibili quando si coltivano cellule per altri scopi. Ciò rende questa tecnica più economica e più facil...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il laboratorio AG è finanziato dal Consiglio spagnolo per la sicurezza nucleare. T.A. e A.G. sono membri di un gruppo di ricerca riconosciuto dalla Generalitat de Catalunya (2017-SGR-503). MT ha un contratto finanziato dalla Fondazione Scientifica Asociación Española Contra el Cáncer [AECC-INVES19022TERR]. Il contratto G.F. è finanziato da una sovvenzione della Fondazione Cellex.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 ml di pipette sierologiche | Labclinics | PLC91001 | |
| 1,5 ml di Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Gli eppendorf scuri sono preferiti per la conservazione a lungo termine MTT |
| 10 μ l Puntali per pipette senza filtro | Biologix | 20-0010 | |
| in vetro da 100 ml | Con tappo, autoclavabile | ||
| 1000 μ l Puntali per pipette con filtro | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μ l Puntali per pipette senza filtro | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Provette coniche | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Pipette sierologiche | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μ l Puntali per pipette con filtro | Labclinics | FTR200-96 | |
| Pipette sierologiche da 5 ml | Labclinics | PLC91005 | |
| Provette coniche da 50 ml | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Utilizzato per la fissazione della struttura 3D prima della marcatura con immunofluorescenza |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Utilizzato per il test di ancoraggio |
| Anticorpo anti-Claudina 4 | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Diluizione di lavoro 1:100, ospite: coniglio |
| Anti-Citocheratina 14 [RCK107] anticorpo | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Diluizione di lavoro 1:100, ospite: topo |
| Anti-topo Anti-cianonina Cy3 anticorpo | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Diluizione di lavoro 1:500, ospite: capra |
| Anti-coniglio Alexa Fluor 488 anticorpo | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Diluizione di lavoro 1:500, ospite: |
| autoclave | |||
| di capra BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Coltura cellulare a 24 pozzetti Plate | Labclinics | PLC30024 | Utilizzato per le colture 3D in Matrigel. Coltura cellulare a fondo piatto |
| 6 pozzetti | Plate Labclinics | PLC30006 | Utilizzato per il saggio di ancoraggio |
| Incubatore cellulare (37 º C e 5 % CO2) | |||
| Filtri cellulari | Fisherbrand | 11587522 | Dimensioni della maglia: 40 μ m |
| Software CellSense | Olympus | Utilizzato per l'acquisizione di immagini | |
| Centrifuga | |||
| Colera Tossina da Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Utilizzato per integrare il terreno di coltura cellulare |
| Cabina di sicurezza biologica di classe II | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Microscopio confocale invertito | Leica | TCS SP5 | |
| Occhiali di copertura | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, spessore 0,13 - 0,17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinofenil)-1H -indolo-6-carbossamidina | ||
| Fetale Siero bovino Biowest | S1810 | Utilizzato per inattivare l'azione della tripsina | |
| Software Fiji (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Download gratuito, nessuna licenza necessaria |
| Pipette in vetro Pasteur Vetrini | |||
| Fisherbrand | 11844782 | ||
| Siero di capra | Biowest | S2000 | Utilizzato per l'immunofluorescenza di strutture 3D |
| Guanti | Utilizzato per la manipolazione dell'agar dopo l'autoclave | ||
| Bagno riscaldante (37 º C) | Utilizzato per temperare le soluzioni prima della subcoltura cellulare | ||
| Bagno riscaldante (42 º C) | Utilizzato per mantenere caldo l'agar | ||
| Piastra | Utilizzato per la disidratazione del Matrigel | ||
| Camera umida | Utilizzato per l'incubazione degli anticorpi durante l'immunofluorescenza | ||
| Ghiaccio | Utilizzato durante la manipolazione del Matrigel | ||
| Ghiacciaia | |||
| Microscopio ottico invertito | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | negozio a -20 º C e mantenere il freddo durante l'uso. Indicato come matrice della membrana basale |
| Metanolo | PanReac AppliChem | 131091 | Utilizzato per la fissazione 3D della struttura prima della marcatura immunofluorescente |
| Micropipetta | p1000, p200 e p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Utilizzato per calcolare il raddoppio della popolazione e per ottenere l'equazione del tasso di crescita |
| MilliQ acqua | Indicato come acqua ultrapura | ||
| unghie | Utilizzato per sigillare i campioni dopo il montaggio | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Utilizzato per coprire la soluzione anticorpale durante l'incubazione |
| PBS pH 7.4 (senza calcio e magnesio) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Utilizzato per la subcoltura cellulare |
| Compresse PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Diluire in acqua milliQ. Non è richiesta alcuna sterilità. Utilizzato per l'immunofluorescenza |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 fiasche | Corning | 353808 | Utilizzato per la coltura BPEC |
| Scettro Contatore cellulare automatizzato | Millipore | PHCC20060 | In alternativa, utilizzare un emocitometro |
| Forbici | Utilizzato per tagliare i puntali delle pipette e il parafilm | ||
| Filtri sterili 0,22 &; m | Millipore | SLGP033RS | Utilizzato per filtrare la soluzione MTT |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Conservare a -20 º C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Utilizzato per l'immunofluorescenza di strutture 3D |
| Tripsina-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Diluire in PBS per ottenere la soluzione 3X |
| Vectashield Antifade Mounting Medium Vector | Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture | Medium Stemgent | 00-0051 | Utilizzato per la coltura primaria di BPIC |
| WIT-T Terreno di coltura | Stemgent | 00-0047 | Utilizzato per la coltura BPEC trasformata |
Riferimenti
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