Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Sommario

La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L'sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell'RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.

Abstract

Sebbene i piccoli RNA regolatori (sRNA) siano diffusi tra il dominio batterico della vita, le funzioni di molti di loro rimangono scarsamente caratterizzate in particolare a causa della difficoltà di identificare i loro obiettivi di mRNA. Qui, abbiamo descritto un protocollo modificato della purificazione ms2-affinity accoppiato con la tecnologia RNA Sequencing (MAPS), con l'obiettivo di rivelare tutti i partner RNA di uno specifico sRNA in vivo. In generale, l'aptamero MS2 è fuso all'estremità 5 ' dell'sRNA di interesse. Questo costrutto viene quindi espresso in vivo, permettendo all'MS2-sRNA di interagire con i suoi partner cellulari. Dopo la raccolta batterica, le cellule vengono leccate meccanicamente. L'estratto grezzo viene caricato in una colonna cromatografica a base di amilosio precedentemente rivestita con la proteina MS2 fusa alla proteina legante del maltosio. Ciò consente l'acquisizione specifica di MS2-sRNA e RNA interagenti. Dopo l'eluizione, gli RNA co-purificati sono identificati dal sequenziamento dell'RNA ad alta produttività e dalla successiva analisi bioinformatica. Il seguente protocollo è stato implementato nell'agente patogeno umano Gram-positivo Staphylococcus aureus ed è, in linea di principio, trasponibile a qualsiasi batterio Gram-positivo. In sintesi, la tecnologia MAPS costituisce un metodo efficiente per esplorare a fondo la rete normativa di un particolare sRNA, offrendo un'istantanea dell'intero targetome. Tuttavia, è importante tenere presente che gli obiettivi putativi identificati da MAPS devono ancora essere convalidati da approcci sperimentali complementari.

Introduzione

Centinaia, forse anche migliaia di piccoli RNA (SRNA) normativi sono stati identificati nella maggior parte dei genomi batterici, ma le funzioni della stragrande maggioranza di essi rimangono insolito. Nel complesso, gli sRNA sono molecole brevi e non codificanti, che svolgono ruoli importanti nella fisiologia batterica e nell'adattamento agli ambienti^{fluttuanti1,2,3}. Infatti, queste macromolecole sono al centro di numerose reti normative complesse, che hanno un impatto sulle vie metaboliche, sulle risposte allo stress ma anche sulla virulenza e sulla resistenza agli antibiotici. Logicamente, la loro sintesi è innescata da specifici stimoli ambientali (ad esempio, fame di nutrienti, stress ossidativi o di membrana). La maggior parte degli sRNA regola più mRNA di destinazione a livello post-trascrizionale attraverso l'accoppiamento di base breve e non contiguo. Di solito impediscono l'avvio della traduzione competendo con i ribosomi per le regioni di iniziazione alla^{traduzione 4}. La formazione di duplex sRNA:mRNA spesso si traduce anche nella degradazione attiva dell'mRNA bersaglio mediante reclutamento di specifiche RNasi.

La caratterizzazione di un targetome di sRNA (cioè l'intero insieme dei suoi RNA bersaglio) consente l'identificazione delle vie metaboliche in cui interviene e del potenziale segnale a cui risponde. Di conseguenza, le funzioni di uno specifico sRNA possono generalmente essere dedotte dal suo targetome. A tal fine, sono stati sviluppati diversi strumenti di previsione del silico come IntaRNA e CopraRNA^5,6,7. In particolare si basano sulla complementarità delle sequenze, sull'accoppiamento dell'energia e sull'accessibilità del potenziale sito di interazione per determinare i partner di sRNA putativi. Tuttavia, gli algoritmi di previsione non integrano tutti i fattori che influenzano l'accoppiamento di base in vivo come il coinvolgimento degli RNA chaperones⁸ favorendo interazioni non ottimali o la co-espressione di entrambi i partner. A causa dei loro limiti intrinseci, il tasso falso positivo di strumenti di previsione rimane elevato. La maggior parte degli approcci sperimentali su larga scala si basano sulla co-purificazione delle coppie sRNA:mRNA che interagiscono con una proteina taggata di legame RNA (RBP)^6,9. Ad esempio, il metodo RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) ha identificato duplex di RNA co-purificati con chaperones di RNA come Hfq e ProQ in Escherichia coli^10,11. Una tecnologia simile chiamata UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) è stata applicata agli SRNA associati a RNasi E- e Hfq in E. coli^12,13. Nonostante i ruoli ben descritti di Hfq e ProQ nella regolazione mediata da sRNA in più batteri^8,14,15, la regolazione a base di sRNA sembra essere indipendente dall'RNA in diversi organismi come S. aureus^16,17,18. Anche se la purificazione dei duplex RNA in associazione con le RNasi è fattibile come dimostrato da Waters e colleghi¹³, questo rimane difficile poiché le RNasi innescano il loro rapido degrado. Pertanto, l'approccio MS2-Affinity Purification accoppiato con RNA Sequencing (MAPS)^19,20 costituisce una solida alternativa in tali organismi.

A differenza dei metodi sopra menzionati, MAPS utilizza uno sRNA specifico come esca per catturare tutti gli RNA interagenti e quindi non si basa sul coinvolgimento di un RBP. L'intero processo è illustrato nella figura 1. In breve, l'sRNA viene taggato a 5' con l'aptamero di RNA MS2 che è specificamente riconosciuto dalla proteina del mantello MS2. Questa proteina è fusa con la proteina legante del maltosio (MBP) da immobilizzare su una resina amilosio. Pertanto, MS2-sRNA e i suoi partner RNA vengono mantenuti sulla colonna cromatografica di affinità. Dopo l'eluizione con maltosio, gli RNA co-purificati vengono identificati utilizzando il sequenziamento dell'RNA ad alta produttività seguito da analisi bioinformatiche (Figura 2). La tecnologia MAPS alla fine disegna una mappa interattiva di tutte le potenziali interazioni che si verificano in vivo.

La tecnologia MAPS è stata originariamente implementata nel batterio Gram-negativo non patogeno E. coli²¹. Sorprendentemente, MAPS ha aiutato a identificare un frammento derivato dal tRNA che interagisce specificamente con gli sRNA RyhB e RybB e prevenire qualsiasi rumore trascrizionale di sRNA per regolare gli obiettivi di mRNA in condizioni non induttivo. Successivamente, MAPS è stato applicato con successo ad altri E. coli sRNA come DsrA²², RprA²³, CyaR²³ e GcvB²⁴ (tabella 1). Oltre a confermare obiettivi precedentemente noti, MAPS ha esteso il targetome di questi noti SRNA. Recentemente, MAPS è stato eseguito in Salmonella Typhimurium e ha rivelato che SraL sRNA si lega a rho mRNA, codificando per un fattore di terminazione di trascrizione²⁵. Attraverso questo accoppiamento, SraL protegge rho mRNA dalla terminazione prematura della trascrizione innescata da Rho stessa. È interessante notare che questa tecnologia non è limitata agli sRNA e può essere applicata a qualsiasi tipo di RNA cellulare, come esemplificato dall'uso di un frammento derivato da tRNA²⁶ e di una regione non tradotta di 5'di mRNA²² (Tabella 1).

Il metodo MAPS è stato adattato anche al batterio gram-positivo patogeno S. aureus¹⁹. In particolare, il protocollo di lysis è stato ampiamente modificato per rompere efficacemente le cellule a causa di una parete cellulare più spessa rispetto ai batteri Gram-negativi e per mantenere l'integrità dell'RNA. Questo protocollo adattato ha già svelato l'interactome di RsaA^27,RsaI²⁸ e RsaC²⁹. Questo approccio ha fornito approfondimenti sul ruolo cruciale di questi sRNA nei meccanismi regolatori delle proprietà della superficie cellulare, dell'assorbimento del glucosio e delle risposte allo stress ossidativo.

Il protocollo sviluppato e implementato in E. coli nel 2015 è stato recentemente descritto in dettaglio³⁰. Qui, forniamo il protocollo MAPS modificato, che è particolarmente adatto per lo studio delle reti normative sRNA nei batteri Gram-positivi (parete cellulare più spessa) sia non patogeni che patogeni (precauzioni di sicurezza).

Protocollo

1. Buffer e supporti

1. Per gli esperimenti MAPS, preparare i seguenti buffer e supporti:
   - Tampone A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)
   - Tampone E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosio, 0,1% Tritone, 1 mM MgCl₂ e 1 mM DTT)
   - Tampone di carico dell'RNA (0,025% cianolo di xilene e 0,025% blu bromofenolo in urea 8 M)
   - Mezzo per infusione di cuore cerebrale (BHI) (12,5 g di cervello di vitello, 10 g di peptone, 5 g di cuore di manzo, 5 g di NaCl, 2,5 g di Na₂HPO₄ e 2 g di glucosio per 1 L)
   - Lysogeny Broth (LB) medium (10 g di peptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di NaCl per 1 L)
2. Per i test northern blot, preparare i seguenti buffer:
   - Soluzione di blocco (1x acido maleico e 1% reagente bloccante)
   - Soluzione di ibridazione (50% formamide, 5x SSC, 7% SDS, 1% soluzione di blocco e 0,2% N-lauril sarcosina, 50 mM fosfato di sodio). Riscaldare con agitazione per dissolversi.
   ATTENZIONE: Seguire attentamente le precauzioni di sicurezza relative a ciascun prodotto.
   - 1 M fosfato di sodio (58 mM dibasico fosfato di sodio e 42 mM di fosfato di sodio monobasico)
   - Tampone di citrato salino, citrato di sodio (SSC), concentrato 20x (3 M NaCl e citrato trisodico da 300 mM)

2. Problemi di sicurezza

1. Eseguire tutte le fasi che coinvolgono batteri patogeni vitali in un laboratorio di contenimento di livello 2.
   NOTA: Solo gli estratti di cellule possono essere prelevati all'esterno dopo la llisi (fase 5).
2. Indossa un camice da laboratorio e guanti.
3. Assicurarsi che i polsi siano coperti.
4. Pulire l'armadio di sicurezza biologico (Classe II) con una soluzione disinfettante.
5. Smaltire i rifiuti solidi esposti ai batteri nell'apposito contenitore biomedico.
6. Trattare i contenitori contenenti liquidi contaminati con una soluzione disinfettante. Quindi, scartalo in un lavandino.
7. Lavare accuratamente mani e polsi con sapone e rimuovere il camice da laboratorio prima di lasciare il laboratorio di contenimento di livello 2.

3. Costruzione plasmide

NOTA: Ai fini della clonazione, è fondamentale identificare prima i confini dello sRNA endogeno. I plasmidi pCN51-P3 e pCN51-P3-MS2 sono descritti in Tomasini etal. Il promotore P3 permette un'alta espressione dello sRNA in modo dipendente dalla densità cellulare (cioè quando i batteri entrano nella fase stazionaria di crescita). Molti sRNA stafilococco si accumulano durante questa fase di crescita.

1. Amplificare la sequenza di sRNA mediante PCR utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedeltà e una macchina PCR. Seguire attentamente le istruzioni del produttore e leggere Garibyan e Avashia (2013)³¹ per maggiori dettagli.
2. Utilizzare i modelli seguenti per progettare i primer specifici:
   
   e 5'-CGCGGATCC(N)-3' rispettivamente per primer avanti e indietro.
   NOTA: Questi oligonucleotidi consentono di fondere la sequenza MS2 (in grassetto) all'estremità 5' dell'sRNA di interesse. Pst I siti di restrizione I e BamHI (sottolineati) vengono aggiunti alle estremità 5' e 3' del costrutto MS2-sRNA per clonare l'amplicon nel plasmide pCN51-P3²⁷. (N) corrisponde alla sequenza specifica del gene (15-20 nucleotidi).
3. Digerire 1 μg di pCN51-P3 plasmide e 1 μg del prodotto PCR MS2-sRNA con 2 U di PstI e 1 U di BamHI nel tampone appropriato secondo le raccomandazioni del produttore.
4. Incubare 1 h a 37 °C e purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR (vedi Tabella dei materiali).
5. Mescolare il plasmide pCN51-P3 digerito (300 ng) e l'amplicon MS2-sRNA (rapporto molare per vettore:inserto = 1:3) in un tubo da 1,5 ml. (1988) 32 per massimizzare^l'efficienza della legatura. Aggiungere 1 μL del Ligase Buffer e 10 U di T4 Ligase in ogni tubo. Regolare il volume a 10 μL con acqua ultrapura.
6. Incubare a 22 °C per almeno 2 ore.
7. Aggiungere 5 μL di miscela di lisciviazione a 50 μL di cellule E. coli congelate DH5α chimicamente competenti. (2001) 33 per^{saperne di} più sulla trasformazione plasmide e sulle cellule chimicamente competenti.
8. Incubare 30 minuti sul ghiaccio.
9. Shock termico (45 s a 42 °C) il tubo di trasformazione utilizzando un blocco termico o un bagno d'acqua.
10. Aggiungere 900 μL di mezzo LB e incubare a 37 °C per 30 min.
11. Piastra 100 μL della sospensione batterica su una piastra di agar LB integrata con ampicillina (100 μg/μL).
    NOTA: il vettore pCN51-P3 codifica un gene di resistenza all'ampicillina, che consente di selezionare solo cloni E. coli che trasportano il plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA.
12. Estrarre il pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide da una coltura batterica notturna (5 mL) coltivata in presenza di ampicillina (100 μg/μL) utilizzando un kit di miniprep del DNA plasmide (vedi Tabella dei materiali).
13. Verificare il costrutto sequenziando Sanger³⁴ utilizzando il seguente primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
14. Trasformare il plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA in cellule E. coli chimicamente competenti dc10B. Ripetere i passaggi da 3.7 a 3.11.
15. Estrarre il pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide (vedi fase 3.12) e trasformare 1-5 μg di DNA plasmide in cellule elettrocompetenti S. aureus HG001 ΔsRNA utilizzando un apparato elettroporazione. Seguire attentamente le istruzioni del produttore. Leggi Grosser e Richardson (2016)^{35 per saperne} di più sui metodi per preparare l'elettrocompetente S. aureus.
    ATTENZIONE: Questo passaggio comporta la manipolazione di batteri patogeni (vedere fase 2).
16. Aggiungere 900 μL di mezzo BHI e incubare a 37 °C per 3 ore.
17. Centrifuga 1 min a 16.000 x g. Scartare il supernatante.
18. Rimostrare il pellet in 100 μL di BHI e placcare la sospensione batterica su piastre di agar BHI integrate con eringomicina (10 μg/μL).
    NOTA: Il vettore pCN51-P3 codifica anche un gene di resistenza all'eringomicina, che consente di selezionare solo cloni S. aureus che trasportano il plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA.

4. Raccolta dei batteri

ATTENZIONE: Questo passaggio comporta la manipolazione di batteri patogeni (vedere fase 2).

1. Coltivare una colonia di ceppi che trasportano pCN51-P3-MS2-sRNA o pCN51-P3-MS2²⁷ plasmidi in 3 mL di mezzo BHI integrati con eringomicina (10 μg/μL) in duplicati.
2. Diluire ogni coltura notturna in 50 mL (≈1/100) di mezzo BHI fresco integrato con eringomicina (10 μg/μL) per raggiungere un OD_600nm di 0,05. Utilizzare flaconi sterilizzati da 250 ml (rapporto tra pallone 5:1 e medio).
   NOTA: Le condizioni medie e di crescita devono essere impostate in base al modello di espressione dello sRNA studiato.
3. Coltiva colture a 37 °C con scuotimenti a 180 giri/min per 6 h.
4. Trasferire ogni coltura in un tubo di centrifuga da 50 ml.
5. Centrifuga a 2.900 x g per 15 min a 4 °C. Scartare il supernatante.
6. Tenere i pellet sul ghiaccio ed eseguire direttamente la lisi meccanica delle celle (fase 5) o congelare e conservare pellet a -80 °C.

5.Lisi a celle meccaniche

ATTENZIONE: I seguenti passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio e i tamponi devono essere a 4 °C. Utilizzare guanti e prendere tutte le precauzioni per proteggere i campioni dalle RNasi.

1. Resuspend pellets (fase 4.6) in 5 mL di Tampone A.
2. Trasferire le celle rimorsi in tubi di centrifuga da 15 ml con 3,5 g di perline di silice (0,1 mm).
3. Inserire tubi in uno strumento meccanico di lisi cellulare (vedi Tabella dei materiali). Eseguire un ciclo di 40 s a 4,0 m/s.
   NOTA: Se un ciclo non è sufficiente per rompere le cellule, lasciare raffreddare il dispositivo per 5 minuti mantenendo i campioni sul ghiaccio. Quindi, ripetere un altro ciclo di 40 s a 4,0 m/s. L'efficienza della llisi cellulare può essere testata placcando il supernatante sulla piastra BHI-agar.
4. Centrifuga a 15.700 x g per 15 min. Recupera il supernatante e tienilo sul ghiaccio.

6. Preparazione della colonna

ATTENZIONE: Fare attenzione a non lasciare asciugare la resina amilosio. Se necessario, sigillare la colonna con un tappo finale. Preparare tutte le soluzioni prima di iniziare la purificazione dell'affinità.

1. Inserire una colonna cromatografica in un rack di colonne (vedere Tabella dei materiali).
2. Rimuovere la punta della colonna e lavare la colonna con acqua ultrapura.
3. Aggiungere 300 μL di resina amilosio.
4. Lavare la colonna con 10 mL di Buffer A.
5. Diluire 1.200 pmol di proteine MBP-MS2 in 6 mL di Buffer A e caricarlo nella colonna.
6. Lavare la colonna con 10 mL di Buffer A.

7. Purificazione dell'affinità MS2 (Figura 1)

1. Caricare il lysate della cella nella colonna.
   NOTA: Conservare 1 mL del llysato cellulare (estratto grezzo, CE) per estrarre l'RNA totale (fase 8) ed eseguire analisi northern blot (fase 9) e trascrittomica (fase 10).
2. Raccogliere la frazione flow-through (FT) in un tubo di raccolta pulito.
3. Lavare la colonna 3 volte con 10 mL di Tampone A. Raccogliere la frazione di lavaggio (W).
4. Elute la colonna con 1 mL di Buffer E e raccogliere la frazione di eluizione (E) in un microtubo da 2 mL.
5. Conservare tutte le frazioni raccolte sul ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA (fase 8) o congelarle a -20 °C per un uso successivo.

8. Estrazione dell'RNA delle frazioni raccolte (CE, FT, W ed E)

1. Utilizzare 1 mL di ogni frazione (inclusi FT e W) per l'estrazione dell'RNA.
2. Aggiungere 1 volume di fenolo. Mescolare vigorosamente.
   ATTENZIONE: Il fenolo è volatile e corrosivo, presta attenzione e lavora in sicurezza sotto una cappa aspirante.
3. Centrifuga a 16.000 x g per 10 min a 20 °C.
4. Trasferire la fase superiore in un microtubo pulito da 2 mL.
5. Aggiungere 1 volume di alcol cloroformio/isoamil (24:1) e ripetere i passaggi da 8.3 a 8.4.
   ATTENZIONE: Lavorare in sicurezza sotto una cappa aspirante.
6. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo freddo 100% e 1/10 volume di 3 M di acetato di sodio (NaOAc) pH 5,2.
7. Precipitare durante la notte a -20 °C.
   NOTA: Le precipitazioni possono anche essere eseguite in un bagno di etanolo / ghiaccio secco durante 20 min o a -80 °C durante 2 ore.
8. Centrifuga a 16.000 x g per 15 min a 4 °C. Rimuovere lentamente l'etanolo con una pipetta facendo attenzione a non disturbare il pellet.
   ATTENZIONE: Il pellet di RNA non è sempre visibile e a volte è sciolto in presenza di etanolo.
9. Aggiungere 500 μL di etanolo freddo all'80%.
10. Centrifuga a 16.000 x g per 5 min a 4 °C.
11. Scartare l'etanolo tubazione lentamente. Asciugare il pellet utilizzando un concentratore sottovuoto, 5 minuti in modalità di corsa.
12. Rimescolare il pellet in un volume appropriato (15-50 μL) di acqua ultrapura. Congelare il pellet a -20 °C per un uso successivo.
13. Valutare la quantità di RNA (260 nm) e la qualità (rapporti di lunghezza d'onda 260/280 e 260/230) utilizzando uno spettrofotometro/fluorometro (vedi Tabella dei materiali). Seguire attentamente le istruzioni del produttore.
    NOTA: 3-4 μg sono generalmente ottenuti nella frazione di eluizione (E). Ciò dipende principalmente dalle condizioni testate.

9. Analisi della purificazione dell'affinità MS2 mediante macchia settentrionale³⁶

1. Diluire 5 μg di RNA di frazioni CE, FT, W e 500 ng di frazione E in 10 μL di acqua ultrapura e mescolare con 10 μL di tampone di carico dell'RNA.
2. Incubare 3 min a 90 °C.
3. Caricare campioni in pozzi di un gel di agarosio dell'1% integrato con 20 mM di tiocianato di guanidio ed eseguire il gel a 100-150 V in tampone TBE 1x a 4 °C. Leggi Koontz (2013)³⁷ per maggiori dettagli.
4. Trasferire gli RNA su una membrana di nitrocellulosa mediante trasferimento sottovuoto per 1h o trasferimento di capillarità durante la notte.
   NOTA: Il metodo di capillarità è più efficiente per gli RNA di grandi dimensioni.
5. RNA a collegamento incrociato UV sulla membrana (120 mJ a 254 nm) utilizzando un retino ultravioletto.
6. Inserire la membrana in una bottiglia di ibridazione con il lato RNA rivolto verso l'alto.
7. Aggiungere 10-20 mL di soluzione di ibridazione preriscaldata. Incubare 30 min a 68 °C.
8. Scartare la soluzione e aggiungere 10-20 mL di soluzione di ibridazione fresca integrata con 1 μL della sonda specifica dell'sRNA. Incubare durante la notte a 68 °C.
   NOTA: La sonda RNA marcata DIG viene sintetizzata utilizzando un kit di etichettatura DIG RNA e seguendo le istruzioni del produttore. In alternativa, è possibile utilizzare una sonda con etichetta radio.
9. Lavare la membrana con 10-20 mL di soluzione di lavaggio 1 (2x SSC e 0,1% SDS) per 5 min a 20 °C. Ripeti una volta.
10. Lavare la membrana con 10-20 mL di soluzione di lavaggio 2 (0,2x SSC e 0,1% SDS) per 15 min a 68 °C. Ripeti una volta.
11. Incubare con 10-20 mL di soluzione di blocco per almeno 30 min a 20 °C.
12. Scartare la soluzione e aggiungere 10-20 mL della soluzione di blocco integrata con l'anticorpo policlonale anti-digoxigenina (1/1000), coniugato alla fosfatasi alcalina. Incubare 30 min a 20 °C.
13. Lavare la membrana con 10-20 mL della soluzione di lavaggio 3 (1x acido maleico e 0,3% Tween 20) per 15 min a 20 °C. Ripeti una volta.
14. Incubare la membrana con 10-20 mL della soluzione di rilevamento (0,1 M Tris HCl e 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min a 20 °C.
15. Mettere la membrana su un film di plastica e immergerla con il substrato (vedere Tabella dei materiali). Incubare 5 minuti al buio.
16. Sigillare la membrana in un film di plastica. Metti la membrana in una cassetta per autorazione.
17. Esporre la membrana a un film di autorazione nella stanza buia dedicata.
    NOTA: Il tempo di esposizione dipende dalla potenza del segnale, da pochi secondi a minuti.
18. Rivelare la pellicola esposta in un dispositivo di sviluppo automatico.

10. Preparazione dei campioni per il sequenziamento dell'RNA

NOTA: Questo passaggio riguarda solo gli RNA estratti dalle frazioni E e CE.

1. Aggiungere a ciascun campione 10 μL di tampone di 10x DNasi e DNasi I (1 U/μg di RNA trattati). Aggiungere acqua per un volume finale di 100 μL.
2. Incubare 1 h a 37 °C.
3. Estrarre e purificare gli RNA come descritto in precedenza (passaggi da 8.2 a 8.11).
4. Rimescolare il pellet di RNA in 20 μL di acqua ultrapura.
   NOTA: La presenza di DNA rimanente può essere controllata utilizzando PCR e primer specifici (ad esempio, gene 16S).
5. Valutare la quantità e la qualità dell'RNA utilizzando un sistema di analisi dell'elettroforesi basato su microfluidica (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: 1 μg è generalmente ottenuto nella frazione di eluizione (E) dopo il trattamento con DNasi.
6. Rimuovere gli RNA ribosomiali con un kit di esaurimento dell'rRNA batterico.
   NOTA: Gli RRNA grandi e abbondanti (cioè gli rRNA) tendono a interagire in modo non specifico con la colonna di affinità. Per eseguire questo passaggio sono necessari 500 ng di RNA estratto.
7. Valutare nuovamente la quantità e la qualità dell'RNA utilizzando un sistema di analisi dell'elettroforesi basato su microfluidici.
8. Preparare librerie cDNA con 10-20 ng di RNA ribodepleted utilizzando un kit di preparazione della libreria cDNA e seguendo le istruzioni del produttore.
9. Sequenziare le librerie ottenute utilizzando uno strumento di sequenziamento (ad esempio, single-end, 150 bp; vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: 5-10 milioni di letture per campione sono generalmente sufficienti.

11. Analisi dei dati RNAseq (figura2)

1. Scarica i file di sequenziamento FastQ dalla piattaforma di sequenziamento.
2. Accesso all'istanza Galaxy della stazione biologica Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) e accesso.
   NOTA: ogni algoritmo menzionato può essere facilmente trovato utilizzando la barra di ricerca. Per ogni strumento viene fornita una guida per l'utente.
   ATTENZIONE: la versione degli strumenti richiesti potrebbe differire dal server Galaxy pubblico³⁸.
3. Fare clic sull'icona Ottieni dati e quindi caricare file dal computer. Caricare il file di sequenziamento FastQ di ogni controllo MS2 e gli esempi ms2-sRNA. Caricare anche il file del genoma di riferimento FASTA e il file di annotazione GFF.
4. Eseguire i report FastQC Read Quality (Galaxy versione 0.69).
   NOTA: questo strumento fornisce una valutazione della qualità delle sequenze grezze (ad esempio, punteggio di qualità, presenza di sequenze di adattatori).
5. Eseguire lo strumento di taglio flessibile di lettura Trimmomatic (Galaxy versione 0.36.6) per rimuovere in particolare le sequenze di adattatori e le letture di scarsa qualità. Indicare le sequenze di adattatori utilizzate per la preparazione della libreria (ad esempio, TruSeq 3, single-ended). Aggiungete le seguenti operazioni trimmomatiche: SLIDINGWINDOW (Number of bases=4; Media quality=20) e MINLEN (lunghezza minima delle letture=20).
6. Eseguire di nuovo i report FastQC Read Quality (Galaxy versione 0.69).
7. Run Bowtie2 - la mappa legge sul genoma di riferimento (Galaxy Version 2.3.2.2). Utilizzare il file FASTA Riferimento genoma della cronologia per mappare le letture con le impostazioni predefinite (locali molto sensibili).
   NOTA: il file BAM generato dallo strumento Bowtie2 può essere visualizzato utilizzando l'Integrative Genomics Viewer (IGV). Sarà richiesto anche il file BAI associato.
8. Facoltativamente, eseguire Flagstat che compila le statistiche per il dataset BAM (Galaxy versione 2.0).
9. Esegui conteggio htseq - Count (Galaxy versione 0.6.1) che allinea le letture delle feature sovrapposte nel file di annotazione GFF. Utilizzare la modalità Intersezione (non vuota).
10. Archiviare tutti i file di conteggio non elaborati dall'analisi del conteggio htseq in un unico file Zip.
11. Eseguire SARTools DESeq2 per confrontare i dati (Galaxy versione 1.6.3.0). Fornire il file Zip contenente i file di conteggio non elaborati e il file di progettazione, un file delimitato da tabulazioni che descrive l'esperimento. Seguire attentamente le istruzioni fornite per generare il file di progettazione.

Risultati

I risultati rappresentativi derivano dallo studio del targetome RsaC in S. aureus²⁹. RsaC è uno sRNA non convenzionale lungo 1.116 nt. La sua estremità di 5' contiene diverse regioni ripetute mentre la sua estremità di 3 ' (544 nt) è strutturalmente indipendente e contiene tutti i siti di interazione previsti con i suoi obiettivi di mRNA. L'espressione di questo sRNA è indotta quando il manganese (Mn) è scarso, che si incontra spesso nel contesto della risposta immunitaria dell'ospite. Ut...

Discussione

Un protocollo modificato per i batteri Gram-positivi
Il protocollo iniziale di MAPS è stato sviluppato per studiare l'interactoma dello sRNA nell'organismo modello E. coli^20,30. Qui descriviamo un protocollo modificato adatto alla caratterizzazione di reti regolatorie dipendenti dall'sRNA nell'opportunistico agente patogeno umano S. aureus ed è certamente trasponibile ad altri batteri Gram-positivi, patogeni o meno.

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	Sarstedt	72.690.001
Provette per centrifuga da 15 mL	Falcon	352070
Provetta per microcentrifuga da 2 mL	Starstedt	72.691
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	RNA quantità e qualità
Pallone da coltura da 250 mL	Dominique Dutscher	2515074	Bacterial colture
Provette da centrifuga da 50 mL	Falcon	352051	Centrifugazione per colture
Etanolo assoluto	VWR Sostanze chimiche	20821.321	Estrazione e purificazione dell'RNA
Centrifuga Allegra X-12R	Beckman Coulter		Pellettatura batterica
Ampicilina (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Terreno di crescita
Resina di amilosio	Nuovo Inghilterra BioLabs	E8021S Purificazione	di affinità MS2
Frammento di AF Anti-diossigenina AP Fab	Sigma Aldrich	11093274910	Saggi di Northern blot
Cassetta per autoradiografia	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Saggi di Northern blot
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Costruzione plasmidica
BHI (Brain Heart Infusion) Brodo	Sigma-Aldrich	53286	Terreno di crescita
Reagente bloccante	Sigma Aldrich	11096176001	Saggi Northern blot
CDP-Star Sigma	Aldrich	11759051001	Saggi Northern blot (substrato)
Centrifuga 5415 R	Eppendorf		Estrazione e purificazione dell'RNA
Cloroformio	Dominique Dutscher	508320-CER	Estrazione dell'RNA e purificazione
Miscela di marcatura DIG-RNA	Sigma-Aldrich	11277073910	Saggi Northern blot
DNasi I	Roche	4716728001	DNase Trattamento con DNasi
Eritromicina (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Terreno di crescita
Dispositivo FastPrep	MP Biomedicals	116004500	Lisi meccanica
Tiocianato	di guanidioSaggi Sigma-Aldrich	G9277-250G	Northern blot
Ibridazione Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Saggi Northern blot
Provette di ibridazione	Techne	FHB16	Saggi Northern blot
Alcool isoamilico	Fisher Scientific	A/6960/08	Estrazione e purificazione dell'RNA
LB (brodo di lisogenia)	Sigma-Aldrich	L3022	Terreno di coltura
Matrice di lisi B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Lisi meccanica
MicroPulser Elettroporatore	BioRad	1652100	Costruzione di plasmidi
Dispositivo per l'acqua Milli-Q	Z00QSV0WW		Acqua ultrapura
Spettrofotometro NanoDrop	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA quantità e qualità
Membrana di nitrocellulosa	Dominique Dutsher	10600002	Saggi Northern blot
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Pulizia e decontaminazione
Fenolo	Carl Roth	38.2	Estrazione e purificazione dell'RNA
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	New England Biolabs	M0530	Costruzione di plasmidi
pMBP-MS2	Addgene	65104	Produzione MS2-MBP
Colonna per cromatografia Poly-Prep	BioRad	7311550	Purificazione di affinità MS2
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Costruzione plasmidi
Qubit 3 Fluorimetro	Invitrogen	15387293	Quantità di RNA
Soluzione	MP Biomedicals	6055050	Lisi meccanica
ScriptSeq Kit completo	Illumina	BB1224	Preparazione di librerie di cDNA
Spettrofotometro Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Colture batteriche
SpeedVac Savant Dispositivo per vuoto	ThermoFisher Scientific	DNA120	Estrazione e purificazione dell'RNA
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Saggi Northern blot
T4 DNA ligasi	ThermoFisher Scientific	EL0014	Costruzione del plasmide
TBE (Tris-Borato-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Saggi di Northern blot
ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Costruzione di plasmidi
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Saggi di Northern blot
Processore di pellicole a raggi X	hu.q	HQ-350XT	Saggi Northern blot
Pellicole a raggi X Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Saggi Northern blot