È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

7.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/61774

⸱

16 gennaio 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.

Abstract

L'elevata domanda di anticorpi come interventi terapeutici per varie malattie infettive, metaboliche, autoimmuni, neoplastiche e altre malattie crea una crescente necessità nello sviluppo di metodi efficienti per la produzione di anticorpi ricombinanti. A dicembre 2019, c'erano più di 70 anticorpi monoclonali approvati dalla FDA e c'è un potenziale di crescita esponenziale. Nonostante la loro promessa, i fattori limitanti per un uso diffuso sono i costi di produzione e la complessità. Potenzialmente, le piante offrono strategie di produzione proteica a basso costo, sicure e facilmente scalabili. Piante come Nicotiana benthamiana non solo possono piegare e assemblare correttamente proteine mammifere complesse, ma possono anche aggiungere modifiche critiche post-tras traslazione simili a quelle offerte dalle colture cellulari dei mammiferi. In questo lavoro, utilizzando la GFP nativa e una variante stabile all'acido della proteina fluorescente verde (GFP) fusa agli anticorpi monoclonali umani, siamo stati in grado di visualizzare l'intera espressione anticorpale transitoria e il processo di purificazione dalle piante di N. benthamiana. A seconda dello scopo dell'esperimento, la fusione GFP nativa può garantire una visualizzazione più semplice durante la fase di espressione nelle piante, mentre la fusione GFP stabile all'acido consente la visualizzazione durante l'elaborazione a valle. Questa procedura scalabile e diretta può essere eseguita da un singolo ricercatore per produrre quantità di milligrammo di anticorpi altamente puri o proteine di fusione anticorpale in pochi giorni utilizzando solo poche piccole piante. Tale tecnica può essere estesa alla visualizzazione di qualsiasi tipo di processo di purificazione degli anticorpi e potenzialmente di molte altre proteine, sia nei sistemi vegetali che in altri sistemi di espressione. Inoltre, queste tecniche possono beneficiare di istruzioni virtuali ed essere eseguite in un laboratorio didattico da studenti universitari in possesso di una minima esperienza precedente con tecniche di biologia molecolare, fornendo una base per l'esplorazione basata su progetti con applicazioni del mondo reale.

Introduzione

I rapporti dell'industria indicano che tredici dei venti farmaci più incassi negli Stati Uniti erano biologici (prodotti farmaceutici a base proteica), di cui nove erano anticorpi. A dicembre 2019, c'erano oltre 570 terapie anticorpali (Ab) in varie fasi di sviluppoclinico 1,2,3. Le attuali vendite globali di Ab superano i 100 miliardi di dollari e il mercato terapeutico monoclonale Ab (mAb) dovrebbe generare fino a 300 miliardi di DOLLARI entro il 20251,4. Con una domanda così elevata e aumenti previsti delle entrate, i ricercatori hanno lavorato per sviluppare modi per produrre terapie Ab su scala sempre più ampia, con una qualità più elevata e costi inferiori. I sistemi di espressione a base vegetale hanno diversi vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari di mammiferi per la produzione economica e su larga scala di terapie Ab5,6. La produzione di terapie proteiche nelle piante ("pharming molecolare") non richiede costosi bioreattori o strutture di coltura cellulare, così come le tecniche tradizionali di coltura cellulare dei mammiferi7,8. Le piante non possono contrarre agenti patogeni umani, riducendo al minimo la potenzialecontaminazione 9. Sia l'espressione proteica transiente che transgenica a base vegetale può essere utilizzata come alternativa a basso costo ai sistemi di produzione di mammiferi o batteri10. Sebbene le piante transgeniche siano preferite per la produzione vegetale, la produzione di proteine ricombinanti utilizzando questo metodo può richiedere da settimane a mesi. I progressi nell'espressione transitoria utilizzando vettori virali attraverso siringa o agroinfiltrazione sottovuoto consentono, rispettivamente, la produzione su piccola e grande scala della proteina desiderata neigiorni 11,12,13,14. La produzione di mAb contro Ebola, Dengue e, Zika, e numerose altre proteine ricombinanti, sono stati prodotti e purificati in modo rapido ed efficiente utilizzando l'espressione transitoria negli impianti N. benthamiana 15,16,17,18,19. Queste circostanze rendono l'espressione transitoria a base vegetale un'opzione interessante per lo sviluppo di più terapie Ab e dei metodi dimostrati in questo protocollo20.

I mAb di prima generazione erano di derivazione murina, il che ha portato a immunogenicità non specifica se utilizzati in studi sull'uomo21. Nel corso del tempo, gli Abs chimerici, umanizzati e, infine, completamente umani sono stati prodotti per ridurre l'immunogenicità indotta dalle terapie Ab. Sfortunatamente, alcuni di questi Abs causano ancora immunogenicità dell'ospite a causa delle differenze nella glicosilazione21. Gli sviluppi nell'ingegneria impiantistica hanno permesso la modifica degli glicani ab, che è essenziale poiché la stabilità e la funzione di ab possono essere significativamente influenzate dal suo stato di glicosilazione22. I progressi hanno permesso la produzione in sistemi vegetali di espressione di alto livello di mAb umanizzati, contenenti glicani umani e di conseguenza i tratti biologici desiderati di un farmaco umano prodotto inserie 19,21.

Oltre agli Abs ricombinanti, le molecole di fusione Ab (fusioni Ab) sono state esplorate per vari scopi negli ultimi decenni. Le fusioni ab spesso consistono in un frammento ab o ab fuso a una molecola o proteina e sono progettate per suscitare risposte dalle cellule dell'effettore immunitario23. Queste molecole sono state create come potenziali interventi terapeutici per trattare varie patologie come il cancro e le malattie autoimmuni24,25,26,27. I complessi immunitari ricombinanti (RIC) sono un'altra classe di fusioni Ab che sono state impiegate come candidati al vaccino28. I RIC sfruttano la capacità del sistema immunitario di riconoscere le regioni Fc delle fusioni Ab e sono stati trovati per migliorare l'immunogenicità se combinati con altre piattaformevaccinali 29,30,31.

La proteina fluorescente verde (GFP) è una proteina bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea Victoria, che emette luce verde quando eccitata dalla luceultravioletta 32,33. Nel corso degli anni, l'uso della GFP come marcatore visivo dell'espressione genica si è esteso dall'espressione in Escherichia coli a numerosi sistemi di espressione proteica, tra cui le piante di N. benthamiana 34,35,36,37,38. I marcatori visibili, come la FPG, hanno abbondanti implicazioni nell'insegnamento e nell'apprendimento di concetti scientifici. Numerosi studenti entry-level descrivono difficoltà a cogliere concetti scientifici quando l'idea insegnata non è visibile ad occhio nudo, come i concetti di biologia molecolare e campi correlati39. I marcatori visivi, come la GFP, possono così contribuire all'elaborazione delle informazioni relative ai processi scientifici e potrebbero contribuire a ridurre le difficoltà che gli studenti segnalano nell'apprendimento di numerosi concetti scientifici.

Sebbene la GFP sia spesso usata come marcatore per indicareil gene e l'espressione in vivo , è difficile visualizzarlo nei processi a valle se si utilizzano condizioni acide. Questa circostanza è principalmente perché GFP non mantiene la sua struttura e la fluorescenza risultante a un basso pH40. Gli ambienti acidi temporanei sono spesso richiesti in vari processi di purificazione, come la proteina G, la proteina A e la cromatografia proteina L, spesso utilizzate per la purificazione Ab41,42,43,44. I mutanti GFP sono stati utilizzati per trattenere la fluorescenza in condizioniacide 45,46.

Nel presente documento descriviamo un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione delle proteine di fusione IgG ricombinanti nelle piante di N. benthamiana. Abbiamo prodotto la GFP tradizionale fusa all'N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione GFP-IgG. Contemporaneamente, abbiamo sviluppato la fusione di una sequenza ottimizzata per il codone vegetale per una GFP acido-stabile (asGFP) al N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione asGFP-IgG. I vantaggi della produzione di GFP-IgG includono la capacità di visualizzare la presenza di una proteina bersaglio durante l'espressione, mentre asGFP-IgG consente di vedere la presenza di proteine ricombinanti non solo nelle fasi di espressione ed estrazione ma anche nelle fasi di purificazione della proteina. Questo protocollo può essere adattato per la produzione, la purificazione e la visualizzazione di una gamma di proteine di fusione GFP prodotte in N. benthamiana e purificate utilizzando tecniche di cromatografia che richiedono un basso pH. Il processo può anche essere adattato a varie quantità di materiale fogliare. Mentre l'Abs e le proteine di fusione contrassegnate con GFP o asGFP non sono destinate ad essere utilizzate per le terapie, questi metodi possono essere utili come controlli durante gli esperimenti e possono anche essere ulteriormente utilizzati come strumento di insegnamento per la biologia molecolare e cellulare e la biotecnologia, sia di persona che virtualmente.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Coltivare n. piante di benthamiana

  1. Posizionare i pellet di torba del terreno su un vassoio e versare in precedenza bolliti, ancora caldi (~ 40-45 °C), acqua sui pellet di torba per una piena espansione. Dopo che i pellet sono stati completamente espansi, posizionare 2-3 N. semi di benthamiana su ogni pellet di torba utilizzando una pinzetta.
  2. Versare circa 0,5 in acqua per coprire il fondo del vassoio. Etichettare il vassoio con la data di semina. Continuare ad annaffiare le piantine ogni giorno con quantità appropriate di fertilizzante. La concentrazione di fertilizzanti (alimenti vegetali solubili in acqua per tutti gli scopi) è generalmente di 2,5-2,8 g/L.
  3. Coprire il vassoio con un piano umidioma quando posizionato nella camera di crescita. Conservare i pellet di torba seminati nella camera di crescita a 23-25 °C, con un fotoperiodo di 16 ore e un'umidità relativa del 60%.
  4. Dopo una settimana, rimuovere le piante extra lasciando ogni pellet con una sola piantina.
  5. Quando le piante hanno 2-3 settimane, trasferire ogni pellet di torba in una singola pentola contenente terreno di controllo dell'umidità. Questa dimostrazione ha utilizzato il terreno di invaso di controllo dell'umidità Miracle-Gro.
  6. Acqua al giorno con fertilizzante da 1 g/L. Non lasciare mai il terreno completamente asciutto. Le piante sono pronte per l'infiltrazione quando hanno 5-6 settimane.

2. Preparazione di Agrobacterium tumefaciens per l'infiltrazione

NOTA: I costrutti di fusione GFP-IgG possono essere ottenuti come descritto in questo documento31. Il gene asGFP è stato ottenuto e ottimizzato per le piante da questo studio45. I seguenti passaggi devono essere eseguiti accanto a un bruciatore Bunsen e devono essere applicate tecniche asettiche di base per evitare la contaminazione.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 che ospita il virus della nana gialla dei fagioli (BeYDV)19 vettore di espressione delle piante per ogni costrutto (asGFP-IgG, GFP-IgG, catena leggera) da uno stock di glicerolo su agar LB (10 g/L Tripptone, 10 g/L NaCl, 5 g di estratto di lievito, 15 g/L di agar, 50 μg/mL di kanamicina).
  2. Crescere per un giorno in un incubatore in piedi a 30 °C. Isolare una singola colonia per la verifica in base al protocollo PCR standard dello schermo colonia.
  3. Usa la colonia verificata per ogni costrutto. Riempire il tubo conico con 10 ml di mezzi LB (10 g/L di triptono, 10 g/L NaCl, 5 g di estratto di lievito, 50 μg/mL). Aggiungere quindi 10 μL di 100 μg/mL di kanamicina. Aggiungere 10 μL di rifampicina da 2,5 μg/mL per evitare la contaminazione da E. coli. Incubare a 30°C e 120-150 giri/min durante la notte.
  4. Il giorno dopo, se la coltura di Agrobacterium viene coltivata a OD600 = 0,6-0,9, può essere utilizzata per l'infiltrazione. Se è ricoperto di vegetazione (OD600 > 1), 1-2 mL deve essere trasferito in LB fresco con antibiotici e coltivato all'OD600 richiesto. A seconda della concentrazione della coltura iniziale, potrebbero potenzialmente essere necessario due giorni per crescere fino a600 OD = 0,6-0,9.
  5. Una volta appropriato OD600, mettere le colture in una centrifuga e pelletare i batteri per centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti, temperatura ambiente (RT).
  6. Decanto supernatante da entrambi i campioni, quindi rimescolare ogni pellet in 1x tampone di infiltrazione (10 mM 2-(N-morpholino) acido etanolfonico, solfato di magnesio da 10 mM, regolato a pH 5,5 con KOH) per ottenere l'ODfinale 600 = 0,4. Questo dovrebbe richiedere circa 15-45 mL di tampone di infiltrazione, a seconda della densità iniziale della coltura. Combina volumi uguali di ogni costrutto di fusione IgG con il costrutto della catena di luce per ottenere l'ODfinale 600 = 0,2 per costrutto in ogni tubo.

3. Agroinfiltrazione di siringhe senza ago

  1. Prendi una graffetta raddrizzare e piante di N. benthamiana di 5-6 settimane dal passaggio 1. Utilizzando il bordo affilato della graffetta, fare una piccola puntura nel primo strato epidermico della foglia sulla superficie adassiale. Evita di forarla fino in fondo.
    NOTA: Le foglie inferiori sono più facili per l'infiltrazione, mentre le foglie sulla parte superiore della pianta sono più dure. Generalmente, l'espressione delle proteine ricombinanti è più alta nelle foglie situate nel mezzo di una pianta, e queste foglie divengono anche meno necrotiche.
  2. Riempire una siringa da 1 ml, senza un ago attaccato, con la soluzione agrobatterio preparata del passo 2. Coprire il foro fatto nel passaggio precedente con l'estremità della siringa e spingere lentamente per iniettare i batteri nella foglia mentre si applica una delicata contropressione da dietro la foglia. Guarda la foglia scurirsi mentre la soluzione viene iniettata senza applicare troppa pressione sulla siringa.
  3. Cerca di infiltrarti nella maggior parte dell'area fogliare a un massimo di 3-4 volte: un danno eccessivo alle foglie può ostacolare la resa proteica. La foglia vegetale infiltrata apparirà per lo più scura dalla vista inferiore.
    NOTA: Questa soluzione batterica dovrebbe essere sufficiente per almeno 3-4 piante per costrutto. Autoclavare qualsiasi soluzione batterica rimanente prima di scartare.

4. Crescere e osservare l'infiltrato N. benthamiana

  1. Riposizionare le piante infiltrate nella camera di crescita e continuare ad annaffiare ogni giorno.
  2. Osservare le foglie per la clorosi e la necrosi nelle aree infiltrate. Osservare le piante per la fluorescenza GFP (se gfp è presente) sotto una lampada UV a onde lunghe e corte.
  3. Il giorno 4-5 mostra la più alta fluorescenza di entrambi i costrutti GFP nelle foglie. Raccogliere tutte le foglie a 4-5 dpi (giorni post-infiltrazione) e pesare il materiale fogliare totale.
  4. Utilizzarlo immediatamente per la lavorazione a valle o conservare a -80 °C fino a quando non è pronto per l'uso.

5. Estrazione di proteine

  1. Conservare tamponi e tazze di frullatore sul ghiaccio o a 4 °C prima dell'uso.
  2. Preparare 2-3 mL di tampone di estrazione ghiaccio-freddo (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 con HCl) per 1 g di materiale vegetale. Aggiungere 2 mM di fenilmetilsolfonil fluoruro (PMSF) dallo stock (100 mM) e 50 mM di ascorbato di sodio al tampone di estrazione poco prima dell'estrazione.
  3. Posizionare il tessuto vegetale dal passaggio 4 nella tazza del frullatore prechilled. Aggiungere una quantità misurata di tampone di estrazione refrigerato alla tazza del frullatore (come indicato al passaggio 5.2). Posizionare la tazza del frullatore sul frullatore. Prendi un foglio di parafilm pretagliato e allungalo sopra la parte superiore della tazza del frullatore. Frullare all'omogeneità con intervalli di 20 secondi, mescolando bene tra i cicli di miscelazione in base alle esigenze.
  4. Trasferire il materiale miscelato in un becher. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare a 4 °C per 30 min per migliorare la solubilità proteica e consentire la precipitazione dei solidi.
  5. Posizionare 2 strati di Miracloth su un becher pulito sul ghiaccio e versare l'estratto attraverso di esso per rimuovere grandi detriti fogliari. Dopo aver versato tutto l'estratto, piegare il Miracloth per spremere l'estratto residuo delle foglie. L'estratto dovrebbe apparire verde scuro senza particelle visibili.
  6. Trasferire 50 μL di questo campione su un nuovo tubo da 1,5 ml ed etichettare "estratto totale" per un'analisi successiva. Trasferire l'estratto in tubi di centrifuga. Centrifugare il resto dell'estratto vegetale a 16.000 x g per 20 min, 4 °C e trasferire il supernatante in un tubo conico.
  7. Filtrare l'estratto solubile utilizzando una siringa da 50 ml e un filtro in fibra di vetro per siringhe (0,75 μm).
  8. Raccogliere 50 μL di un campione dopo la centrifugazione, etichettare "estratto solubile" per un'analisi successiva.

6. Procedura di cromatografia della colonna G proteica

NOTA: Il protocollo qui descritto è per la cromatografia a flusso gravitazionale utilizzando la resina di agarosio Pierce Protein G. Se si utilizza una resina diversa, fare riferimento alle istruzioni del produttore per le regolazioni. Non lasciare mai asciugare la resina e impedire che tutto il liquido si scarichi. Riacquisiamo l'uscita in base alle esigenze.

  1. Impostare una colonna di polipropilene contenente 20 mL di campione.
  2. Stimare la quantità di liquami necessari a seconda del tipo di immunoglobulina bersaglio e della sua affinità con la resina. Generalmente, 3 mL di liquame totale con volume del letto di 1,5 mL sono sufficienti per la purificazione di diversi milligrammi di Ab.
  3. Versare con cura la quantità richiesta di liquami rimorsi nella colonna limitata. Aprire la presa di colonna dalla parte inferiore della colonna e lasciare che si scarichi fino a quando la maggior parte del buffer non è sparita.
  4. Versare immediatamente 10 mL di tampone di lavaggio 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 con HCl) in cima. Lasciare scolare e ripetere questo passaggio di lavaggio 2x.
  5. Applicare il campione filtrato dal passaggio 5 alla colonna e raccogliere il flusso- aliquota 50 μL di flusso per un'analisi successiva. Salvare il resto del flusso nel caso in cui l'Ab non si sia legato alla resina.
    NOTA: la riapplicazione del flusso a una nuova colonna di solito non si traducono in una buona resa; quindi si consiglia di iniziare con nuovo materiale fogliare.
  6. Lavare la resina due volte con 10 mL di 1x PBS per ridurre la legatura non specifica. Se lo si desidera, aliquota 50 μL di lavaggio mentre il tampone scorre attraverso la colonna per verificare che il target Ab non sia eluitato con un tampone di lavaggio.
  7. Impostare ed etichettare cinque tubi con 125 μL di Tris-HCl sterile da 1 M a pH 8. Questo per neutralizzare gli Abs nel tampone di eluizione acida per evitare potenziali cambiamenti strutturali. In alternativa, aggiungere 30 μL di base Tris da 2 M per ottenere un campione meno diluito.
    ATTENZIONE: Durante l'eluizione, la luce UV può essere utilizzata per la visualizzazione. Ciò non deve essere fatto per tutta la durata dell'eluizione. Se si utilizza l'UV, assicurarsi di indossare DPI appropriati per evitare danni agli occhi e alla pelle. Non è necessario utilizzare una luce UV durante la fase di eluizione.
  8. Elute gli Abs applicando 5 ml di tampone di eluizione (glicina da 100 mM, pH 2,5 con HCl) alla colonna e raccogliere 1 mL di frazioni a ciascun tubo designato dal passo precedente.
  9. Rigenerare immediatamente la colonna applicando 20 mL di tampone di lavaggio, seguiti da 10 mL di tampone di lavaggio. Assicurarsi che la resina non sia lasciata in un ambiente acido per un lungo periodo di tempo. Le eluizioni dovrebbero apparire fluorescenti, spesso la fluorescenza più alta è vista nella seconda eluizione ma può variare dall'estrazione all'estrazione.
  10. Per lo stoccaggio, lavare la resina con 10 mL di 20% di etanolo in PBS e lasciarla drenare a metà strada. Riacquisire la parte superiore, quindi la parte inferiore della colonna, e mantenere in posizione verticale a 4 °C.
    NOTA: Generalmente, le resine proteiche G possono essere riutilizzate fino a 10 volte senza una significativa perdita di efficienza. Fare riferimento alle linee guida del produttore per dettagli specifici.
  11. Determinare la concentrazione ab utilizzando uno spettrofotometro misurando l'assorbanza a 280 nm, utilizzando il buffer di eluizione come vuoto. Conservare gli eluati in -80 °C e aliquota 50 μL di ogni frazione in un tubo separato per ulteriori analisi.

7. SDS-PAGE per il rilevamento della fusione GFP-Ig

  1. Preparare tutti gli esempi prima di configurare SDS-PAGE.
    1. Aggiungere 4 μL di tampone del campione (6x tampone di campione riducente: 3,0 mL di glicerolo, 0,93 g di DTT, 1 g di SDS, 7 mL di Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg di blu bromofenolo); (6x tampone campione non riducente: 3,0 mL di glicerolo, 1 g di SDS, 7 mL di Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg di blu bromofenolo) a 20 μL di ciascun campione (estratto totale, estratto solubile, flusso, lavaggio, tutte le frazioni di eluizione) per l'analisi. Assicurarsi che i tappi dei tubi siano fissati saldamente.
    2. Trattare solo riducendo i campioni per 5 minuti in un bagno d'acqua bollente, quindi mettere campioni per 5 minuti sul ghiaccio. Spin campioni in un microcentrifugo per ~5 s e caricare 20 μL di ciascun campione nell'ordine di raccolta nei pozzi di gel. Caricare 3 μL di scala proteica a doppio colore in un pozzo separato.
  2. Eseguire il gel SDS-PAGE a una separazione costante da 100 V a banda proteica desiderata; ci vogliono circa 1,5 ore. Monitorare la scala come indicatore di separazione proteica.
  3. Visualizza il gel sotto l'UV per osservare la fluorescenza GFP.
  4. Se lo si desidera, macchiare il gel con la macchia di Coomassie per valutare la proteina totale in ogni campione. In alternativa, eseguire western blot per valutare le proteine bersaglio utilizzando abs specifici.
    NOTA: Sia la colorazione Coomassie che la macchia occidentale possono essere eseguite seguendo i protocolli standard47,48.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Questo studio dimostra un metodo facile e veloce per produrre proteine ricombinanti e visualizzarle durante i processi a valle. Utilizzando N. benthamiana e seguendo il protocollo fornito, la produzione di proteine ricombinanti qui descritta può essere raggiunta in meno di una settimana. Il flusso di lavoro complessivo dell'espressione, dell'estrazione e della purificazione dell'impianto è illustrato nella figura 1. Le fasi di crescita delle piante delle piantine di 2 settimane, del...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo protocollo può essere utilizzato per la verifica visiva di qualsiasi ab ricombinante o proteina ricombinante prodotta nelle piante di N. benthamiana, comprese quelle che richiedono un'esposizione temporanea ad ambienti acidi ai fini della purificazione dellecolonne 42,43,44. Inoltre, la fusione di asGFP con altre proteine in diversi sistemi di espressione può essere uno strumento utile per la visualizzazione sper...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Maria Pia DiPalma per aver modificato il video. Ringraziamo anche l'Office of Educational Outreach and Student Services dell'Arizona State University per la loro generosa assistenza alle tasse di pubblicazione. La ricerca per questo protocollo è stata supportata dalla School of Life Sciences, Arizona State University.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 5 mLqualsiasiN/A
Siringa da 50 mLqualsiasiN/A
AgarSIGMA-ALDRICHA5306
Frullatore con tazzequalsiasiN/A
Blu di bromofenoloBio-Rad1610404
DTT (DL-Ditiotreitolo)MP BIOMEDICALS219482101
EDTA ( Acido etilendinitrilo)tetraaceticoSIGMA-ALDRICHE-6760
EtanoloqualsiasiN/A
GliceroloG-BiosciencesBTNM-0037
GlicinaSIGMA-ALDRICHG7126-500G
HCl (Acido cloridrico)EMD MILLIPORE CORPORATIONHX0603-4
Blocco riscaldantequalsiasi fornitore rispettabileN/A
Jiffy-7 727 con pellet di torbaHummert International14237000
KanamycinGold Biotechnology IncK-120-100
KCl (cloruro di potassio)SIGMA-ALDRICHP9541-500G
KH2PO4 (fosfato di potassio)J.t.baker3248-05
KOH (idrossido di potassio)VWRBDH0262
Solfato di magnesio eptaidratoSIGMA-ALDRICHM2773
MES (acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico)SIGMA-ALDRICHM8250
MiraclothMillipore4 75855-1R
Miscela per il controllo dell'umiditàMiracle-Gro755783
Na2HPO4 (Fosfato di sodio)J.t.baker3827-01
NaCl (cloruro di sodio)Santa Cruz Biotechnologysc-203274C
Semi di nicotiana benthamianaqualsiasi fornitore rispettabileN/A
PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro)G-Biosciences786-787
Colonna in polipropilenequalsiasiN/A
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610394
Resina di proteina GThermo Fisher Scientific20399
RifampicinaGold Biotechnology IncR-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)G-BiosciencesDG093
Ascorbato di sodioSIGMA-ALDRICHA7631-500G
Spettrofotometroqualsiasi fornitore rispettabileN / A
Titan3 0,75 & micro; m filtro in fibra di vetroThermoScientific40725-GM
Vassoio per pellet di torba con cupolaqualsiasiN/A
TRIS BaseJ.t.baker4109-02
Tris-HClAmrescoM108-1KG
TryptoneSIGMA-ALDRICH17221
Lampada UVqualsiasiN/A
Solubile in acqua per tutti gli usi Alimento VegetaleMiracle-Gro2000992
Estratto di lievitoSIGMA-ALDRICH9182

Riferimenti

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755(2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600(2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472(2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81(2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141(2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41(2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200(2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974(2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Espressione transitoriafusione con GFPpurificazione delle proteinecromatografia su colonnainfiltrazione con Agrobacteriumestrazione di tessuto fogliareprocesso di centrifugazionequantificazione degli anticorpi
Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.