Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Sommario

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Abstract

I tumori colorettali sono caratterizzati da eterogeneità e da un'organizzazione gerarchica che comprende una popolazione di cellule staminali tumorali (CSC) responsabili dello sviluppo, del mantenimento e della resistenza ai farmaci del tumore. Una migliore comprensione delle proprietà CSC per il loro targeting specifico è, quindi, un prerequisito per una terapia efficace. Tuttavia, vi è una scarsità di modelli preclinici adatti per indagini approfondite. Sebbene le linee cellulari tumorali bidimensionali (2D) in vitro forniscano preziose informazioni sulla biologia tumorale, non replicano l'eterogeneità fenotipico e genetico del tumore. Al contrario, i modelli tridimensionali (3D) affrontano e riproducono la complessità quasi fisiologica del cancro e l'eterogeneità cellulare. Lo scopo di questo lavoro era quello di progettare un sistema di coltura 3D robusto e riproducibile per studiare la biologia CSC. La presente metodologia descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione delle condizioni per generare sferoidi 3D, di dimensioni omogenee, dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2, un modello che può essere utilizzato per la coltura a lungo termine. È importante sottolineare che, all'interno degli sferoidi, le cellule che erano organizzate attorno a strutture simili a lume, erano caratterizzate da schemi di proliferazione cellulare differenziale e dalla presenza di CSC che esprimevano un pannello di marcatori. Questi risultati forniscono la prima prova del concetto per l'appropriatezza di questo approccio 3D allo studio dell'eterogeneità cellulare e della biologia CSC, inclusa la risposta alla chemioterapia.

Introduzione

Il cancro del colon-retto (CRC) rimane la seconda causa principale di decessi associati al cancro nel mondo¹. Lo sviluppo del CRC è il risultato di una progressiva acquisizione e accumulo di mutazioni genetiche e/o alterazioni epigenetiche^2,3,compresa l'attivazione di oncogeni e l'inattivazione dei geni soppressori del tumore^3,4. Inoltre, i fattori non genetici (ad esempio il microambiente) possono contribuire e promuovere la trasformazione oncogenica e quindi partecipare all'evoluzione dei^{CPC 5}. È import....

Protocollo

NOTA: I dettagli di tutti i reagenti e materiali sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Formazione di sferoidi

1. Mezzi di coltura sferoide
   1. Preparare il mezzo basale costituito dal Mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con dipeptide L-alanil-L-glutammina da 4 mM.
   2. Preparare il mezzo completo DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (Pen/Strep) in mezzo basale a partire dal passo 1.1.1.
   3. Preparare il mezzo a matrice di membrana DMEM/seminterrato contenente il 2,5% di matrice di membrana basale, il 10% di FBS e l'1% di Penn....

Risultati

Poiché la mancanza di omogeneità nelle dimensioni degli sferoidi è uno dei principali svantaggi dei sistemi di coltura 3D sferoide^{attualmente disponibili 13, lo}scopo di questo lavoro era quello di creare un protocollo affidabile e riproducibile per ottenere sferoidi omogenei. In primo luogo, per stabilire condizioni di lavoro ideali, sono stati testati diversi numeri di cellule Caco2, che vanno da 50 a 2.000 cellule per microwell/sferoide utilizzando piastre dedica.......

Discussione

I modelli 3D in vitro superano i principali svantaggi sperimentali delle colture di cellule tumorali 2D, in quanto sembrano essere più affidabili nel ricapitolare le caratteristiche tumorali tipiche tra cui microambiente ed eterogeneità cellulare. I modelli 3D comunemente usati di sferoidi sono senza impalcature (coltivati in condizioni di basso attacco) o basati su impalcature (usando biomateriali per coltura di cellule). Questi metodi presentano diversi svantaggi in quanto dipendono dalla natura dell'impalcatura utiliz.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
37 µ m Filtro reversibile, grande	STEMCELL Technologies	27250	Da utilizzare con provette coniche da 50 mL
5-Fluorouracile	Regalo dalla Farmacia del Centro Leon Berard (CLB)	-	soluzione madre, 5 mg/100 mL; concentrazione finale, 50 & micro; g/mL
di agarosio	Sigma	A9539
Aggrewell 400 piastre a 24 pozzetti	STEMCELL Technologies	34411	1.200 micropozzetti per pozzetto per la formazione e la crescita di sferoidi
Anti Caspasi3 - Segnalazione	cellulare di coniglio	9661	diluizione 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	diluizione 1:500
Soluzione di risciacquo antiaderente x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat	Invitrogen	14-133-82	diluizione 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	diluizione 1:2000
Anti-PCNA - Topo	Dako	M0879	diluizione 1:1000
Anti-β-catenina - Topo	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	diluizione 1:50
Nero piastre multipozzetto	Thermo Fisher Scientific	237108
Acido Citrico Monoidrato	Sigma	C1909
CLARIOstar apparato	Lettore di micropiastre	BMG Labtech
Dako pen			per marcare cerchi su vetrini per creare barriere per i liquidi
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo d'asino, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	diluizione 1:1000
Anticorpo secondario anti-IgG (H+L) anti-topo d'asino, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	diluizione 1:1000
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	diluizione 1:1000
Anticorpo secondario altamente adsorbito IgG (H+L) anti-coniglio d'asino, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	diluizione 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanil-L-glutammina dipeptide)	Gibco	10569010
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel con DAPI	Interchim	FP-DT094B
Anticorpo secondario crossadsorbito anti-ratto di capra (H+L), Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	diluizione 1:1000
Software			delle immagini sferoidi
Irinotecan& nbsp;	Regalo dalla farmacia Soluzione madre CLB		, 20 mg/mL; concentrazione finale, 100 & micro; g/mL
di trascrittasi inversa iScript	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy Soluzione madre CLB		, 50 mg/mL; concentrazione finale, 25 & micro; g/mL
Matrigel Matrice della membrana basale	Corning	354234	Matrice della membrana basale
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatino	Regalo dalla farmacia Soluzione stock CLB		, 100 mg/20 mL;concentrazione finale, 10 &; g/mL
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140130
tampone fosfato soluzione salina (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Verde	Thermo Fisher Scientific	S7020	colorazione dell'acido nucleico; diluizione 1:5000
Tripsina-EDTA (0,05 %)	Gibco
		Zeiss-Axiovert	Microscopio invertito per l'acquisizione di immagini di sferoidi

PennarelloTerreno di montaggio ImageJ Analisi 25300062Microscopio