Articolo metodologico

Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

DOI:

10.3791/61783

⸱

22 gennaio 2021

 ,  ,  , 
1Département de la recherche, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR5286, Université de Lyon, Université Lyon 1, Centre Léon Bérard, 2UMR-S1113 - IRFAC INSERM, Université de Strasbourg

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Abstract

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I tumori colorettali sono caratterizzati da eterogeneità e da un'organizzazione gerarchica che comprende una popolazione di cellule staminali tumorali (CSC) responsabili dello sviluppo, del mantenimento e della resistenza ai farmaci del tumore. Una migliore comprensione delle proprietà CSC per il loro targeting specifico è, quindi, un prerequisito per una terapia efficace. Tuttavia, vi è una scarsità di modelli preclinici adatti per indagini approfondite. Sebbene le linee cellulari tumorali bidimensionali (2D) in vitro forniscano preziose informazioni sulla biologia tumorale, non replicano l'eterogeneità fenotipico e genetico del tumore. Al contrario, i modelli tridimensionali (3D) affrontano e riproducono la complessità quasi fisiologica del cancro e l'eterogeneità cellulare. Lo scopo di questo lavoro era quello di progettare un sistema di coltura 3D robusto e riproducibile per studiare la biologia CSC. La presente metodologia descrive lo sviluppo e l'ottimizzazione delle condizioni per generare sferoidi 3D, di dimensioni omogenee, dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2, un modello che può essere utilizzato per la coltura a lungo termine. È importante sottolineare che, all'interno degli sferoidi, le cellule che erano organizzate attorno a strutture simili a lume, erano caratterizzate da schemi di proliferazione cellulare differenziale e dalla presenza di CSC che esprimevano un pannello di marcatori. Questi risultati forniscono la prima prova del concetto per l'appropriatezza di questo approccio 3D allo studio dell'eterogeneità cellulare e della biologia CSC, inclusa la risposta alla chemioterapia.

Introduzione

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Il cancro del colon-retto (CRC) rimane la seconda causa principale di decessi associati al cancro nel mondo1. Lo sviluppo del CRC è il risultato di una progressiva acquisizione e accumulo di mutazioni genetiche e/o alterazioni epigenetiche2,3,compresa l'attivazione di oncogeni e l'inattivazione dei geni soppressori del tumore3,4. Inoltre, i fattori non genetici (ad esempio il microambiente) possono contribuire e promuovere la trasformazione oncogenica e quindi partecipare all'evoluzione deiCPC 5. È importante sottolineare che i CPC sono composti da diverse popolazioni cellulari, tra cui CSC indifferenziati e cellule tumorali di massa che mostrano alcuni tratti di differenziazione, che costituiscono una struttura gerarchica che ricorda l'organizzazione dell'epitelio in una normale cripta del colon6,7.

I CSC sono considerati responsabili dell'aspettotumorale 8,del suo mantenimento e crescita, della capacità metastatica e della resistenza alle terapieconvenzionali 6,7. All'interno dei tumori, le cellule tumorali, comprese le CSC, mostrano un alto livello di eterogeneità e complessità in termini di profili mutazionali ed epigenetici distinti, differenze morfologiche e fenotipiche, espressione genica, metabolismo, tassi di proliferazione e potenziale metastatico9. Pertanto, per comprendere meglio la biologia del cancro, la progressione del tumore e l'acquisizione della resistenza alla terapia e la sua traduzione in trattamenti efficaci, i modelli preclinici umani che catturano questa eterogeneità e gerarchia del cancrosono importanti 10,11.

Le linee cellulari tumorali 2D in vitro sono state utilizzate per molto tempo e forniscono preziose informazioni sullo sviluppo del tumore e sui meccanismi alla base dell'efficacia delle molecole terapeutiche. Tuttavia, la loro limitazione rispetto alla mancanza di eterogeneità fenotipico e genetica riscontrata nei tumori originali è ora ampiamentericonosciuta 12. Inoltre, i nutrienti, l'ossigeno, i gradienti di pH e il microambiente tumorale non vengono riprodotti, poiché il microambiente è particolarmente importante per il mantenimento di diversi tipi di cellule tra cui CSC11,12. Per superare questi principali inconvenienti, sono stati sviluppati diversi modelli 3D per affrontare e riprodurre sperimentalmente la complessità e l'eterogeneità dei tumori. In effetti, questi modelli ricapitolano l'eterogeneità cellulare tumorale, le interazioni cellula-cellula e l'architettura spaziale, simili a quelle osservate in vivo12,13,14. Gli organoidi tumorali primari stabiliti da tumori freschi, così come gli sferoidi derivati dalla linea cellulare, sono in granparte impiegati 15,16.

Gli sferoidi possono essere coltivati in modo privo di impalcature o impalcature per costringere le cellule a formarsi e crescere in aggregati cellulari. I metodi senza impalcature si basano sulla coltura di cellule in condizioni non aderenti (ad esempio, il metodo della caduta sospesa o piastre di fissaggio ultra-basse), mentre i modelli a base di impalcature si basano su biomateriali naturali, sintetici o ibridi percoltura delle celle 12,13,14. Gli sferoidi a base di impalcature presentano diversi svantaggi in quanto la formazione finale dello sferoide dipenderà dalla natura e dalla composizione del (bio)materiale utilizzato. Sebbene i metodi sferoidi senza impalcature disponibili finora non si affidino alla natura del substrato, generano sferoidi che variano nella struttura enelle dimensioni 17,18.

Questo lavoro era finalizzato alla progettazione di un robusto e riproducibile sistema di coltura 3D di sferoidi, di dimensioni omogenee, composto da cellule adenocarcinoma del colon Caco2 per studiare la biologia CSC. Le cellule Caco2 sono di particolare interesse per la loro capacità di differenziarsinel tempo 19,20, suggerendo fortemente un potenziale simile a quello delle staminali. Di conseguenza, la cultura a lungo termine degli sferoidi ha rivelato la presenza di diverse popolazioni CSC con diverse risposte alla chemioterapia.

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Protocollo

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NOTA: I dettagli di tutti i reagenti e materiali sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Formazione di sferoidi

  1. Mezzi di coltura sferoide
    1. Preparare il mezzo basale costituito dal Mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con dipeptide L-alanil-L-glutammina da 4 mM.
    2. Preparare il mezzo completo DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (Pen/Strep) in mezzo basale a partire dal passo 1.1.1.
    3. Preparare il mezzo a matrice di membrana DMEM/seminterrato contenente il 2,5% di matrice di membrana basale, il 10% di FBS e l'1% di Penna/Strep in mezzo basale dal passo 1.1.1.
  2. Preparazione di piastre per la formazione di sferoidi
    1. Mezzo a matrice basale calda e DMEM/membrana basale a temperatura ambiente (RT) per circa 20 min.
    2. Pretrattare i pozzali di una piastra da 24 poggia-porsi dedicata alla formazione di sferoidi aggiungendo 500μL di soluzione di risciacquo anti-aderenza ad ogni pozzo.
      NOTA: In queste piastre, ogni pozzo è costituito da 1.200 microligni.
    3. Centrifugare la piastra a 1.200 × g per 5 minuti in un rotore a secchiello oscillante con adattatori per piastre.
      NOTA: Se viene utilizzata una sola piastra, preparare una piastra standard aggiuntiva riempita d'acqua per controbilanciare il peso.
    4. Risciacquare ogni bene con 2 mL di mezzo basale caldo e aspirare il mezzo dai pozzi.
    5. Osservare la piastra al microscopio per assicurarsi che le bolle siano state completamente rimosse dai microli. Se le bolle rimangono intrappolate, centrifugare di nuovo a 1.200 × g per 5 minuti per eliminare le bolle.
    6. Ripetere i passaggi di risciacquo 1.2.4-1.2.5.
    7. Aggiungere 1 mL di mezzo caldo a matrice di membrana DMEM/seminterrato ad ogni pozzo.
  3. Generazione di sferoidi
    1. Far crescere le cellule Caco2 in un monostrato 2D in mezzo DMEM integrato con 10% FBS e 1% Pen/Strep a 37 °C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 (di seguito denominato 37 °C/5% CO2).
      NOTA: Il numero massimo di passaggi cellulari da utilizzare è 80.
    2. Quando si raggiunge l'80% della confluenza, lavare le cellule con saline tamponate con fosfato (PBS) 1x (5 mL per un piatto di 10 cm), aggiungere acido tetraacetico tripina-etilenediammina (EDTA) (2 mL per un piatto di 10 cm) e incubare per 2-5 min a 37 °C/5% CO2.
    3. Controllare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare la tripina aggiungendo 4 mL di terreno completo DMEM per piatto da 10 cm.
    4. Contare le cellule usando un emocitometro per determinare il numero totale di cellule.
    5. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.200 × g per 5 min. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un volume appropriato di mezzo a matrice di membrana DMEM/seminterrato.
    6. Fare riferimento alla tabella 1 per determinare il numero di celle necessarie per pozzo per ottenere il numero desiderato di cellule per microwell. In alternativa, calcolare il numero di celle utilizzando la seguente formula per una piastra da 24 porri, considerando che ogni pozzo contiene 1.200 microlicchi
      Numero richiesto di cellule per pozzo = Numero desiderato di cellule per microwell × 1.200
    7. Aggiungere il volume richiesto della sospensione cellulare a ciascun pozzo per ottenere il numero di cella desiderato in un volume finale di 1 mL.
    8. Aggiungere 1 mL di dmem/mezzo a matrice di membrana basale a ciascun pozzo per raggiungere il volume finale di 2 mL per pozzo (vedere anche il passaggio 1.2.7).
      NOTA: Fare attenzione a non introdurre bolle nei microligni.
    9. Centrifugare immediatamente la piastra a 1.200 × g per 5 minuti per catturare le cellule nei microli. Se necessario, controbilanciare la centrifuga con una piastra standard riempita d'acqua.
    10. Osservare la piastra al microscopio per verificare che le cellule siano distribuite uniformemente tra i microwell.
    11. Incubare la piastra a 37 °C/5% CO2 per 48 ore senza disturbare la piastra.
      NOTA: Secondo il protocollo originale21, sebbene molte linee cellulari possano formare sferoidi entro 24 ore, alcune richiedono un tempo di incubazione più lungo. In questo protocollo, 48 ore sono sufficienti per la formazione di sferoidi.
  4. Raccolta degli sferoidi dai microlibbi
    1. Riscaldare il mezzo basale e DMEM/matrice a membrana basale/basale a RT per circa 20 minuti.
    2. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere metà del mezzo di coltura (1 mL) da ogni pozzo.
    3. Aggiungere di nuovo il mezzo sulla superficie del pozzo per spodesare gli sferoidi dai microli.
      NOTA: Non toccare o triturare gli sferoidi.
    4. Posizionare un colino reversibile da 37 μm (o un colino standard da 40 μm) sulla parte superiore di un tubo conico da 15 ml per raccogliere gli sferoidi.
      NOTA: Se si utilizza un colino standard da 40 μm, posizionarlo capovolto.
    5. Aspirare delicatamente gli sferoidi slogati (dal passo 1.4.3) e passare la sospensione dello sferoide attraverso il colino.
      NOTA: Gli sferoidi rimarranno sul filtro; singole celle fluiranno attraverso il mezzo.
    6. Utilizzando una pipetta sierologica, erogare 1 mL del mezzo basale caldo su tutta la superficie del pozzo per spodestarli gli sferoidi rimanenti e recuperarli sul colino.
    7. Ripetere questa fase di lavaggio 1.4.6 due volte.
    8. Osservare la piastra al microscopio per assicurarsi che tutti gli sferoidi siano stati rimossi dai microli. Ripetere il lavaggio se necessario (passaggi 1.4.6-1.4.7).
    9. Invertire il filtro e posizionarlo su un nuovo tubo conico da 15 ml. Raccogliere gli sferoidi lavando il colino con mezzo a matrice di membrana DMEM/seminterrato.
      NOTA: Gli sferoidi raccolti sono pronti per applicazioni e analisi a valle.
  5. Cultura a lungo termine degli sferoidi
    1. Preparare la soluzione di agarosio all'1,5% in mezzo basale e sterilizzarla mediante autoclave (ciclo standard).
    2. Mentre la soluzione di agarosio è calda e ancora liquida, rivestire i pozzi di piatti o piatti di coltura standard, come descritto nella tabella 2.
      NOTA: Riscaldare il piatto / piatto nel forno faciliterà la fase di rivestimento. Piatti/piatti rivestiti possono essere lasciati a RT per un massimo di 10 giorni in un ambiente sterile e protetti dalla luce.
    3. Seminare gli sferoidi raccolti (dal passo 1.4.9) nelle piastre rivestite di agarosio e aggiungere dmem/ mezzo matrice a membrana seminterrata per ottenere il volume finale a seconda delle dimensioni della piastra.
      NOTA: Per evitare aggregati di sferoidi, seminarli alla densità ottimale di 22 sferoidi/cm2. Osservare che il rivestimento non è perfettamente piatto e si alza verso il bordo, creando una leggera concavità al centro della piastra. Se il numero di sferoidi è troppo alto, è più probabile che aderiscano l'uno all'altro.
    4. Incubare la piastra a 37 °C/5% CO2 fino al recupero degli sferoidi per analisispecifiche.
  6. Trattamento degli sferoidi con farmaci chemioterapici
    1. Sferoidi piastra dal passo 1.5.4, e farli crescere per 2 giorni. A partire dal giorno 3 (D3), trattarli con FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Irinotecan, 100 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) o con FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Oxaliplatino, 10 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) combinazioni di regimi chemioterapici abitualmente utilizzati per trattare i pazienti CRC22,23,24,25o mantenerli in condizioni (di controllo) non trattate (NT).
    2. Raccogliere gli sferoidi dopo 3 giorni di trattamento utilizzando una pipetta con la punta tagliata (punta di 1.000 μL), assicurando che ogni condizione sia rappresentata da almeno tre repliche. Centrifugarli a 1.000 × g per 3 minuti, quindi rimuovere il supernatante.
    3. Fissare i pellet in paraformaldeide al 2% (PFA) per l'analisi istologica (vedere sezione 3) o utilizzare i pellet per l'estrazione dell'RNA (vedere sezione 4).
    4. Per analizzare la morte cellulare, incubare gli sferoidi dal passo 1.6.1 in piastre di coltura nera in DMEM / mezzo matrice di membrana seminterrata per 30 minuti con una macchia di acido nucleico (diluizione 1:5000) che non permea le cellule vive, ma penetra nelle membrane compromesse delle cellule morte26. Misurare l'accumulo di fluorescenza con un lettore di micropiacpia.

2. Monitoraggio della crescita degli sferoidi

  1. Utilizzando un microscopio invertito, acquisire immagini rappresentative di sferoidi mantenuti in condizioni diverse durante i giorni in coltura.
  2. Analizzare le immagini misurando tre diversi diametri rappresentativi di ogni sferoide utilizzando un software appropriato.
  3. Utilizzare la formula seguente per ottenere il volume stimato della sfera.
    figure-protocol-1

    NOTA: I termini, d1, d2 e d3, sono i tre diametri dello sferoide.

3. Immunofluorescenza (IF) e colorazione istologica

  1. Fissazione e incorporamento di paraffina
    1. Raccogliere gli sferoidi in punti di tempo selezionati utilizzando una pipetta con la punta tagliata come descritto nel passaggio 1.6.2 e fissarli per 30 minuti a RT in PFA al 2%.
      NOTA: In alternativa, conservare i campioni in questa fase a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.
    2. Per l'incorporamento di paraffina, lavare gli sferoidi 3x con PBS 1x e riprenosi in etanolo al 70%. Dopo l'inclusione e il sessatura della paraffina, eseguire la colorazione ematossilina & eosina (H&E) per l'analisi istologica.
  2. Immunoetichettatura delle sezioni di paraffina
    NOTA: Utilizzare sezioni spesse 5 μm per l'immunosocienza indiretta.
    1. Incubare i vetrini a 60 °C per 2 ore per sciogliere la cera e migliorare la deparaffinizzazione.
    2. Lavare gli scivoli due volte per 3 minuti in metilcicloesano.
    3. Lavare gli scivoli per 3 minuti in 1:1 metilcicloesano:100% etanolo.
    4. Lavare i vetrini due volte per 3 minuti in etanolo al 100%.
      NOTA: Eseguire tutte le manipolazioni per il passaggio 3.2.2 al passaggio 3.2.4 in una cappa chimica.
    5. Lavare le diapositive per 3 minuti in etanolo al 90%.
    6. Lavare le diapositive per 3 minuti in etanolo al 75%.
    7. Lavare le diapositive per 3 minuti in 50% di etanolo.
    8. Lavare gli scivoli sotto l'acqua del rubinetto.
    9. Reidratare gli scivoli in acqua distillata per 5 minuti.
    10. Preparare 700 mL di tampone di citrato da 0,01 M, pH 6,0 e aggiungerlo a un contenitore adatto (larghezza: 11,5 cm, lunghezza: 17 cm, altezza: 7 cm); immergere le diapositive in esso. Riscaldare il contenitore nel microonde per 9-10 minuti a 700 W e, all'inizio dell'ebollizione, ridurre la potenza a 400-450 W. Incubare per altri 10 minuti.
    11. Lasciare raffreddare le diapositive nel tampone a RT per circa 30-40 minuti.
    12. Lavare gli scivoli due volte in PBS per 5 minuti.
    13. Disegna un cerchio intorno alle sezioni con una penna marcatore per creare una barriera per i liquidi applicati alle sezioni.
    14. Incubare ogni sezione con 50 μL di tampone di blocco (10% siero di capra normale, 1% di albumina di siero bovino (BSA) e 0,02% Triton X-100 in PBS) per almeno 30 minuti a RT.
    15. Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere 50 μL di anticorpi primari diluiti nel tampone di incubazione (1% siero di capra normale, 0,1% BSA e 0,02% Tritone X-100 in PBS). Incubare per 2 ore a RT o durante la notte a 4 °C.
    16. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare gli scivoli 3 volte in PBS per 5 minuti.
    17. Incubare i vetrini con 50 μL di anticorpi secondari fluorescenti diluiti nel tampone di incubazione per 1 h a RT.
    18. Rimuovere gli anticorpi secondari e lavare gli scivoli 3 volte in PBS per 5 minuti.
    19. Aggiungere 50 μL di mezzo di montaggio con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo ad ogni sezione, e posizionare un coverslip di vetro sulla sezione.

4. Estrazione dell'RNA, reazione a catena inversa trascrizione-polimerasi (RT-PCR) e RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)

  1. Raccogli sferoidi in diversi punti-tempo, ogni punto rappresentato da almeno tre repliche. Centrifugarli a 1.000 × g per 3 minuti, quindi rimuovere il supernatante.
    NOTA: I pellet possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione dell'RNA o conservati a -20 °C fino a un ulteriore utilizzo.
  2. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento dell'RNA commerciale, secondo le istruzioni del produttore.
  3. Trascrivere inversamente 500 ng di ogni campione di RNA in DNA complementare (cDNA) con un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore.
  4. Dopo la trascrizione inversa, eseguire un'analisi PCR su 1 μL di cDNA per amplificare un gene di pulizia con primer situati in diversi esoni.
    NOTA: Questo passaggio consente la verifica dell'assenza di contaminazione genomica del DNA nei preparati dell'RNA. Per questo protocollo sono stati utilizzati primer peptidilprolyl isomerasi B(PPIB).
  5. Eseguire l'amplificazione qPCR su 4 μL di cDNA precedentemente diluito (1:10 in acqua doppia distillata priva di RNAse) utilizzando primer specifici per i geni di interesse. In ogni campione, quantificare l'espressione specifica dell'mRNA usando il metodo ΔΔCt e i valori normalizzati rispetto a livelli genico di pulizia.
    NOTA: per questo protocollo, β-actin(ACTB). I primer utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella 3.

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Risultati

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Poiché la mancanza di omogeneità nelle dimensioni degli sferoidi è uno dei principali svantaggi dei sistemi di coltura 3D sferoideattualmente disponibili 13, loscopo di questo lavoro era quello di creare un protocollo affidabile e riproducibile per ottenere sferoidi omogenei. In primo luogo, per stabilire condizioni di lavoro ideali, sono stati testati diversi numeri di cellule Caco2, che vanno da 50 a 2.000 cellule per microwell/sferoide utilizzando piastre dedica...

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Discussione

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I modelli 3D in vitro superano i principali svantaggi sperimentali delle colture di cellule tumorali 2D, in quanto sembrano essere più affidabili nel ricapitolare le caratteristiche tumorali tipiche tra cui microambiente ed eterogeneità cellulare. I modelli 3D comunemente usati di sferoidi sono senza impalcature (coltivati in condizioni di basso attacco) o basati su impalcature (usando biomateriali per coltura di cellule). Questi metodi presentano diversi svantaggi in quanto dipendono dalla natura dell'impalcatura utiliz...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo le piattaforme istografiche di imaging e Anipath recherche (CRCL, CLB). Siamo in debito con la farmacia del Centre Léon Bérard (CLB) Hospital per il tipo di regalo di FOLFOX e FOLFIRI. Ringraziamo anche Brigitte Manship per la lettura critica del manoscritto. Il lavoro è stato supportato dal FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) e dall'Inca (PLBIO19-289). MVG e LC hanno ricevuto il sostegno della FRM e della CF ricevuta dalla fondazione ARC e dal Centre Léon Bérard.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
37 µ m Filtro reversibile, grande STEMCELL Technologies27250Da utilizzare con provette coniche da 50 mL
5-FluorouracileRegalo dalla Farmacia del Centro Leon Berard (CLB)-soluzione madre, 5 mg/100 mL; concentrazione finale, 50 & micro; g/mL
di agarosioSigmaA9539
Aggrewell 400 piastre a 24 pozzettiSTEMCELL Technologies344111.200 micropozzetti per pozzetto per la formazione e la crescita di sferoidi
Anti Caspasi3 - Segnalazionecellulare di coniglio9661diluizione 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82diluizione 1:500
Soluzione di risciacquo antiaderente x 100 mLSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - RatInvitrogen14-133-82diluizione 1:100
Anti-CD44 -RabbitAbcamab157107diluizione 1:2000
Anti-PCNA - TopoDakoM0879diluizione 1:1000
Anti-β-catenina - TopoSanta Cruz Biotechnologysc-7963diluizione 1:50
Nero piastre multipozzettoThermo Fisher Scientific237108
Acido Citrico MonoidratoSigmaC1909
CLARIOstar apparato Lettore di micropiastreBMG Labtech
Dako penper marcare cerchi su vetrini per creare barriere per i liquidi
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo d'asino, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202diluizione 1:1000
Anticorpo secondario anti-IgG (H+L) anti-topo d'asino, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037diluizione 1:1000
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206diluizione 1:1000
Anticorpo secondario altamente adsorbito IgG (H+L) anti-coniglio d'asino, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042diluizione 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanil-L-glutammina dipeptide)Gibco10569010
Siero fetale bovino (FBS)Gibco16000044
Fluorogel con DAPIInterchimFP-DT094B
Anticorpo secondario crossadsorbito anti-ratto di capra (H+L), Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077diluizione 1:1000
Softwaredelle immagini sferoidi
Irinotecan& nbsp;Regalo dalla farmacia Soluzione madre CLB, 20 mg/mL; concentrazione finale, 100 & micro; g/mL
di trascrittasi inversa iScript Bio-Rad1708891
LeucovorinGift from Pharmacy Soluzione madre CLB, 50 mg/mL; concentrazione finale, 25 & micro; g/mL
Matrigel Matrice della membrana basaleCorning354234Matrice della membrana basale
Nucleospin RNA XS KitMacherey-Nagel740902 .250
OxaliplatinoRegalo dalla farmacia Soluzione stock CLB, 100 mg/20 mL;concentrazione finale, 10 &; g/mL
Penicillina-streptomicinaGibco15140130
tampone fosfato soluzione salina (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- VerdeThermo Fisher ScientificS7020colorazione dell'acido nucleico; diluizione 1:5000
Tripsina-EDTA (0,05 %)Gibco
Zeiss-AxiovertMicroscopio invertito per l'acquisizione di immagini di sferoidi
PennarelloTerreno di montaggio ImageJ Analisi 25300062Microscopio

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
  3. Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130(2013).
  4. Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
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