Descriviamo un approccio a singola molecola alle misurazioni dell'affinità antigene-anticorpo usando la fotometria di massa (MP). Il protocollo basato su MP è veloce, accurato, utilizza una quantità molto piccola di materiale e non richiede modifiche proteiche.
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Articolo metodologico
Rapida determinazione dell'affinità anticorpo-antigene mediante fotometria di massa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le misurazioni della specificità e dell'affinità delle interazioni antigene-anticorpo sono di fondamentale importanza per le applicazioni mediche e di ricerca. In questo protocollo, descriviamo l'implementazione di una nuova tecnica a singola molecola, la fotometria di massa (MP), per questo scopo. MP è una tecnica senza etichetta e immobilizzazione che rileva e quantifica masse molecolari e popolazioni di anticorpi e complessi antigene-anticorpi a livello di singola molecola. MP analizza il campione antigene-anticorpo in pochi minuti, consentendo la determinazione precisa dell'affinità di legame e fornendo contemporaneamente informazioni sulla stechiometria e sullo stato oligomerico delle proteine. Questa è una tecnica semplice e diretta che richiede solo quantità di picomole di proteine e non costosi materiali di consumo. La stessa procedura può essere utilizzata per studiare il legame proteina-proteina per proteine con una massa molecolare superiore a 50 kDa. Per le interazioni proteiche multivalenti, le affinità di più siti di legame possono essere ottenute in un'unica misurazione. Tuttavia, il modo di misurazione a singola molecola e la mancanza di etichettatura impongono alcune limitazioni sperimentali. Questo metodo fornisce i migliori risultati se applicato alle misurazioni di affinità di interazione sub-micromolare, antigeni con una massa molecolare di 20 kDa o più grandi, e campioni proteici relativamente puri. Descriviamo anche la procedura per eseguire le fasi di adattamento e calcolo richieste utilizzando il software di analisi dei dati di base.
Introduzione
Gli anticorpi sono diventati strumenti onnipresenti della biologia molecolare e sono ampiamente utilizzati sia in applicazioni mediche che di ricerca. In medicina, sono di fondamentale importanza nella diagnostica, ma anche le loro applicazioni terapeutiche si stanno espandendo e nuove terapie basate su anticorpi vengono costantementesviluppate 1,2,3,4. Le applicazioni scientifiche degli anticorpi includono molte tecniche di laboratorio indispensabili come l'immunofluorescenza5,l'immunoprecipitazione....
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Protocollo
1. Preparare le camere di flusso
- Pulire le coperture in vetro
- Utilizzando bottiglie di lavaggio con acqua distillata, etanolo e isopropanolo, sciacquare i copricapo da 24 mm x 50 mm nel seguente ordine: acqua, etanolo, acqua, isopropanolo, acqua. Asciugare i copricapo con un flusso di azoto pulito. È importante risciacquare i coprispalla dall'alto verso il basso, tenendo l'angolo inferiore con forcep a punta morbida. Asciugare il coperchio nella stessa direzione per evitare di trasferire la contaminazione dalle forcep (Figura 2A).
- Allo stesso modo, sciacquare le coperture da 24 mm x 24 mm con acqua distillata,....
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Risultati
Abbiamo precedentemente esaminato l'interazione tra l'anticorpo umano α-trombina (HT) e l'anticorpo monoclonale anti-umano della trombina (AHT) utilizzando il saggio basato su MP11. Poiché la massa molecolare dell'HT (37 kDa) è inferiore al limite di rilevamento di 40 kDa, la concentrazione massima del campione può superare la limitazione di concentrazione di 50 nM MP senza influire negativamente sulla risoluzione delle distribuzioni di massa. L'esperimento è stato pianificato come serie di titola.......
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Discussione
Il protocollo basato sulla fotometria di massa qui delineato fornisce un metodo rapido e accurato per misurare le affinità di legame antigene-anticorpo. L'analisi MP utilizza una quantità molto piccola di materiale e ulteriori informazioni, tra cui stechiometria, oligomerizzazione e purezza, possono essere valutate dagli stessi dati (Figura 5). Senza modifiche, questo metodo è applicabile alle misurazioni delle costanti di dissociazione nell'intervallo da 5 nM a 500 nM circa, e per le moleco.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Keir Neuman per la sua lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal programma intramurale della NHLBI, NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AcquireMP | Refeyn | MP software di raccolta dati | |
| Anti-trombina umana | Tecnologie ematologiche | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Applicatori con punta in cotone | Thorlabs | CTA10 | tamponi ottici in cotone per la pulizia delle lenti |
| Vetrini coprioggetti 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Vetrini coprioggetti 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | di elaborazione dati | Refeyn | |
| Pinze | microscopia elettronica Scienze | 78080-CF | pinze a punta morbida per la manipolazione di vetrini coprioggetti |
| Tecnologie ematologiche | umane | HCT-0020 | |
| Olio da immersione | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanolo | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Foglio di calcolo | Microsoft | |
| OneMP | Refeyn | Strumento di fotometria di massa | |
| Origin | OriginLab | software di grafica scientifica | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Filtro per siringa | Millipore | SLGSR33SS | tampone e campione filtraggio |
Riferimenti
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H.
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Ristampe e permessi
