Il nematode geneticamente trattabile Caenorhabditis elegans può essere utilizzato come modello semplice ed economico per la scoperta di farmaci. Qui è descritto un protocollo per identificare terapie antitumorali che inibiscono la segnalazione a valle delle proteine RAS ed EGFR.
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Articolo metodologico
Identificazione di inibitori EGFR e RAS utilizzando Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
I cambiamenti nella localizzazione della membrana plasmatica del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e del suo effettore a valle RAS sono stati implicati in diverse malattie tra cui il cancro. Il nematode C. elegans a vita libera possiede una cascata di segnali EGFR-RAS-ERK MAP evolutivamente conservata e funzionalmente conservata che è centrale per lo sviluppo della vulva. Le mutazioni di guadagno di funzione nell'omologo RAS LET-60 e nell'omologo EGFR LET-23 inducono la generazione di pseudovulva ectopica non funzionale visibile lungo la parete corporea ventrale di questi vermi. In precedenza, il fenotipo multivulvale (Muv) in questi vermi ha dimostrato di essere inibito da piccole molecole chimiche. Qui descriviamo un protocollo per l'utilizzo del worm in un test a base liquida per identificare gli inibitori che aboliscono le attività delle proteine EGFR e RAS. Usando questo test, mostriamo che la R-fendilina, un inibitore indiretto di K-RAS, sopprime il fenotipo Muv espresso nei vermi mutanti let-60(n1046) e let-23(sa62). Il test è semplice, poco costoso, non richiede molto tempo per l'installazione e può essere utilizzato come piattaforma iniziale per la scoperta di terapie antitumorali.
Introduzione
Le vie cellulari che regolano gli eventi di sviluppo all'interno degli organismi sono altamente conservate tra tutti i metazoi. Una di queste vie è la cascata di segnalazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno EGFR-RAS-ERK (MAPK) che è una via critica che governa la proliferazione cellulare, la differenziazione, la migrazione e la sopravvivenza1,2. I difetti in questa via di segnalazione possono portare a stati patologici o patologici come il cancro. Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) ha dimostrato di essere altamente espresso nei tumori umani, tra cui il 50% dei carcinomi a cellu....
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Protocollo
1. Preparazione della piastra del mezzo di crescita dei nematodi (NGM)
- Aggiungere 2,5 g di peptone e 3 g di NaCl a 970 ml di acqua deionizzata contenuta in un matraccio Erlenmeyer da 2 L. Mescolare il contenuto usando una barra di agitazione magnetica. Successivamente, aggiungere 20 g di agar al matraccio. Autoclave il contenuto del matraccio a 121 °C e una pressione di 15 lb/in2 per 30 min. Dopo la sterilizzazione, posizionare il matraccio su una piastra di agitazione e lasciare raffreddare il mezzo fino a quando la temperatura raggiunge i 50 °C.
- Per preparare le piastre NGM aggiungere i seguenti reagenti al mezzo raffreddato: 25 mL di ....
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Risultati
Per prima cosa dimostriamo che la R-fendilina è in grado di sopprimere il fenotipo Muv nel ceppo mutante let-60 (n1046) rispetto ai vermi trattati con DMSO. I nostri dati mostrano che la R-fendilina è in grado di bloccare il fenotipo Muv nel let-60(n1046) in modo dose-dipendente (Figura 2A,B). Tuttavia, la non inversione del fenotipo Muv è stata osservata nel ceppo mutante nullo lin-1 in risposta all'aumento delle concentrazioni di R-fendilina (
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Discussione
I saggi che descriviamo usando il worm sono semplici e poco costosi per identificare gli inibitori della funzione EGFR e RAS. C. elegans è un modello interessante per la scoperta di farmaci perché è facile da coltivare in laboratorio a causa del breve ciclo di vita (3 giorni a 20 ° C) e della capacità di generare un gran numero di larve. Ancora più importante, il percorso EGFR-RAS-ERK MAPK è evolutivamente e funzionalmente conservato con mammiferi che forniscono un sistema geneticamente trattabile per analizzare.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) per aver fornito il let-60 (n1046). Ringraziamo anche il Dr. David Reiner (Texas A & M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology di Houston) per il ceppo lin-1. Infine, ringraziamo la dottoressa Danielle Garsin e il suo laboratorio (The University of Texas, McGovern Medical School) per aver fornito alcuni dei reagenti. Alcuni ceppi di worm sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Questa ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione RP200047 del Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) a JF ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreni e prodotti chimici | |||
| Agarosio | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Brodo | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Cloruro di calcio | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Colesterolo | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Solfato di magnesio | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nistatina | Acros organics | ||
| Fosfato di potassio bibasico | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| PFosfato di potassio monobasico | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendilina | Sintetizzato commercialmente (grado farmaceutico) | ||
| Sodio azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Idrossido di sodio | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8,25% ipoclorito di sodio | Candeggina | ||
| Sodio Fosfato Bibasico | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomicina solfato | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (&meno;)-Tetramisolo cloridrato | millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (inibitore MEK) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Materiali di consumo Provette | |||
| 15mL | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 50 ml | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Pipette sierologiche monouso in polistirene 10 ml | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Pipette sierologiche monouso in polistirene 25 ml | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| n. 1,5 18 mm X 18 mm Vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Piastra di Petri con coperchio trasparente (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Piastre di Petri con coperchio trasparente (100X15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vetrini per microscopio in vetro semplice (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Piastre per coltura tissutale a 12 pozzetti | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Batteri | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Ceppi | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H.
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Ristampe e permessi
