Descriviamo un metodo modificato a base di agar progettato per quantificare gli effetti antifungini dei prodotti di origine vegetale. Sia i contributi volatili che i contributi non volatili all'attività antimicotica possono essere valutati attraverso questo protocollo. Inoltre, l'efficacia contro i funghi può essere misurata in fasi chiave di sviluppo in un'unica configurazione sperimentale.
Articolo metodologico
Misurazione dell'attività antifungina volatile e non volatile dei prodotti biocontrollo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il protocollo descritto si basa su una tecnica di trasferimento della spina che consente una determinazione accurata delle quantità di microrganismi e delle loro fasi di sviluppo. Un numero specificato di spore viene distribuito su una piastra di agar. Questa piastra di agar viene incubata per un periodo definito per consentire ai funghi di raggiungere lo stadio di sviluppo previsto, ad eccezione delle spore in cui non è richiesta l'incubazione. Le spine di agar coperte da spore, ife o micelio vengono successivamente ritirate e trasferite su supporti di agar contenenti il composto antimicotico da testare sia posizionate a distanza dai funghi che a contatto. Questo metodo è applicabile per testare sia estratti liquidi che campioni solidi (polveri). È particolarmente adatto per quantificare i contributi relativi degli agenti volatili e non volatili nelle miscele bioattive e per determinarne gli effetti, in particolare sulle spore, sull'iphae precoce e sul micelio.
Il metodo è molto rilevante per la caratterizzazione dell'attività antimicotica dei prodotti di biocontrollo, in particolare dei prodotti di origine vegetale. Infatti, per il trattamento dell'impianto, i risultati possono essere utilizzati per guidare la scelta delle modalità di applicazione e stabilire le soglie di innesco.
Introduzione
Le perdite globali di frutta e verdura possono raggiungere fino al 50% dellaproduzione 1 e derivare principalmente dal decadimento alimentare causato dal deterioramento dei funghi sul campo o durante lo stoccaggio post-raccolta2,3,nonostante l'ampia occupazione di fungicidi sintetici dalla metà del XX secolo4. L'uso di queste sostanze viene riconsiderato in quanto rappresenta gravi rischi per l'ambiente e la salute. Poiché le conseguenze dannose del loro uso si stanno mostrando in tutti gli ecosistemi e le prove di potenziali impatti sulla salute si
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Protocollo
1. Preparazione dell'inocula
- Prima dell'esperimento, posare 5 μL di Trichoderma spp. Le spore SBT10-2018 conservate a 4 °C su mezzo agar destrosio di patate (PDA) e incubano per 4 giorni a 30°C con esposizione regolare alla luce per favorire la formazione di conidia42 (Figura 1,pannello A).
NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 è stato isolato dal legno ed è utilizzato come modello in questo studio per la sua rapida crescita e facilità di recupero delle spore. Questo ceppo è conservato dal nostro laboratorio. - Recupera conidia(Figura 1, pannello A)
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Risultati
Per valutare la capacità del metodo quantitativo di discriminare le modalità di azione di diversi tipi di composti antifungini, abbiamo confrontato l'efficacia di tre noti agenti antifungini. Carbendazim è un fungicida sintetico non volatile che è stato ampiamente utilizzato per controllare una vasta gamma di malattie fungine nellepiante 39,40. L'olio essenziale di thymus vulgaris è stato in gran parte descritto per la sua attività antibatterica e antimi.......
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Discussione
L'approccio qui presentato consente la valutazione delle proprietà antifungine dei prodotti di origine vegetale minimamente lavorati. In questo protocollo, la distribuzione omogenea delle spore sulla superficie dell'agar si ottiene utilizzando perline di vetro da 2 mm. Questo passaggio richiede capacità di movimentazione per distribuire correttamente le perline e ottenere risultati riproducibili, consentendo in ultima analisi il confronto di effetti antifungini in diverse fasi della crescita fungina. Abbiamo scoperto che.......
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Ringraziamenti
Siamo molto grati a Frank Yates per il suo prezioso consiglio. Questo lavoro è stato sostenuto da Sup'Biotech.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Acqua | |||
| Provette Eppendorf | Sarstedt | 72.706 | 1,5 mL |
| Sarstedt | 547254 | 50 mL | |
| Provette in acciaio inox da cinque millimetri di diametro | Negozio | / | |
| Disidratatore alimentare | Sancusto | sei vassoi | |
| Aglio in polvere | Negozio | ||
| organico Perle di vetro | CLOUP | 65020 |  Emocitometro da 2 mm |
| Cella di conteggio | Jeulin | 713442 | / |
| Incubatore | Memmert | UM400 | 30 gradi C |
| Mulino a coltelli | Bosch | TSM6A013B | |
| Contatore di cellule manuale | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Righello di misurazione | negozio | ||
| Armadi di sicurezza microbiologica | FASTER FASTER | BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipetta | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 &; |
| L Micropipetta | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µ |
| L Micropipetta | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µ L |
| Piastra di Petri | Sarstedt | 82-1194500< | img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png"/> Piastra di Petri da 55 mm |
| Sarstedt | 82-1473 | 90 mm | |
| Controller per pipette-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Destrosio di patate Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Bilancia di precisione-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220. R2-ML 220 g/0,1 mg |
| Rastrello | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Microscopio inverso AE31E trinoculare | Grosseron | M097917 | / |
| Pipetta graduata sterile | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Olio essenziale di timo | Drugstore | Olio essenziale 100% | |
| Tips 1000 &; L | Sarstedt | 70.762010 | |
| Punte 20 µ L | Sarstedt | 70.760012 | |
| Punte 200 µ L | Sarstedt | 70.760002 | |
| Stuzzicadenti | negozio | ||
| Trichoderma spp ceppo | Ceppo di laboratorio LRPIA | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Pinzetta | Labbox FORS-001-002 | / |
Riferimenti
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. Intern....
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