Articolo metodologico

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

DOI:

10.3791/61799

⸱

13 ottobre 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo copre un'analisi dettagliata della composizione del peptidoglicano utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida abbinata a software avanzati di estrazione delle caratteristiche e analisi bioinformatica.

Abstract

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Il peptidoglicano è un componente importante delle pareti cellulari batteriche e un bersaglio cellulare comune per gli antimicrobici. Sebbene gli aspetti della struttura del peptidoglicano siano abbastanza conservati in tutti i batteri, c'è anche una notevole variazione tra Gram-positivi / negativi e tra le specie. Inoltre, ci sono numerose varianti, modifiche o adattamenti noti al peptidoglicano che possono verificarsi all'interno di una specie batterica in risposta alla fase di crescita e / o stimoli ambientali. Queste variazioni producono una struttura altamente dinamica che è nota per partecipare a molte funzioni cellulari, tra cui la crescita / divisione, la resistenza agli antibiotici e l'evitamento della difesa dell'ospite. Per comprendere la variazione all'interno del peptidoglicano, la struttura complessiva deve essere scomposta nelle sue parti costitutive (note come muropeptidi) e valutata per la composizione cellulare complessiva. Peptidoglycomics utilizza la spettrometria di massa avanzata combinata con l'analisi dei dati bioinformatici ad alta potenza per esaminare la composizione del peptidoglicano nei minimi dettagli. Il seguente protocollo descrive la purificazione del peptidoglicano da colture batteriche, l'acquisizione di dati di intensità del muropeptide attraverso uno spettrometro di massa cromatografo liquido e l'analisi differenziale della composizione del peptidoglicano utilizzando la bioinformatica.

Introduzione

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Il peptidoglicano (PG) è una caratteristica distintiva dei batteri che serve a mantenere la morfologia cellulare, fornendo supporto strutturale per proteine e altri componenti cellulari 1,2. La spina dorsale del PG è composta dall'acido N-acetil muramico (MurNAc) alternato β-1,4-e dalla N-acetil glucosamina (GlcNAc)1,2. Ogni MurNAc possiede un peptide corto legato al residuo ᴅ-lattile che può essere reticolato con peptidi adiacenti legati al disaccaride (Figura 1A,B). Questa reticolazione produce una struttura a maglia che comprende l'intera cellula ed è spesso indicata come sacculus (Figura 1C). Durante la sintesi di PG, i precursori vengono generati nel citoplasma e trasportati attraverso la membrana citoplasmatica dalle flippasi. I precursori sono successivamente incorporati nel PG maturo dagli enzimi transglicosilasi e transpeptidasi, che producono rispettivamente i legami glicosidici e peptidici3. Tuttavia, una volta assemblati, ci sono numerosi enzimi prodotti dai batteri che modificano e / o degradano il PG per svolgere una serie di processi cellulari, tra cui la crescita e la divisione. Inoltre, varie modifiche del PG hanno dimostrato di conferire adattamenti specifici per la deformazione, le condizioni di crescita e lo stress ambientale, che sono stati implicati nella segnalazione cellulare, nella resistenza antimicrobica e nell'evasione immunitaria dell'ospite4. Ad esempio, una modifica comune è l'aggiunta di un gruppo acetilico C6 sul MurNAc che conferisce resistenza limitando l'accesso ai legami glicani β-1,4 agli enzimi lisozima prodotti dall'ospite che degradano PG 4,5,6. Negli enterococchi, la sostituzione del terminale ᴅ-Ala della catena laterale peptidica con ᴅ-Lac conferisce una maggiore resistenza all'antimicrobico, vancomicina 7,8.

La procedura generale per l'isolamento e la purificazione del PG è rimasta relativamente invariata da quando è stata descritta negli anni 19609. Le membrane batteriche vengono sciolte attraverso il trattamento termico con SDS, seguito dalla rimozione enzimatica delle proteine legate, dei glicolipidi e del DNA rimanente. Il sacculus intatto purificato può essere successivamente digerito nei singoli componenti mediante idrolisi del legame β-1,4 tra GlcNAc e MurNAc. Questa digestione produce disaccaridi GlcNAc-MurNAc con eventuali modifiche strutturali e/o legami incrociati intatti e sono chiamati muropeptidi (Figura 1B).

L'analisi composizionale del PG è stata inizialmente condotta attraverso la separazione cromatografica liquida ad alta pressione (HPLC) per purificare ciascun muropeptide seguita dall'identificazione manuale dei muropeptidi10,11. Da allora questo è stato sostituito dalla spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida (LC-MS), che aumenta la sensibilità di rilevamento e diminuisce il carico di lavoro manuale di purificazione di ogni singolo muropeptide. Tuttavia, la natura lunga e complessa dell'identificazione manuale dei muropeptidi è rimasta un fattore limitante, riducendo il numero di studi condotti. Negli ultimi anni con l'emergere di tecnologie "omiche", l'estrazione automatizzata delle caratteristiche LC-MS è diventata uno strumento potente, consentendo una rapida rilevazione e identificazione di singoli composti in campioni complessi da set di dati molto grandi. Una volta identificate le caratteristiche, il software bioinformatico confronta statisticamente la variazione tra i campioni utilizzando l'analisi differenziale isolando anche minime differenze tra i complessi set di dati e visualizzandoli graficamente all'utente. L'applicazione di software di estrazione di caratteristiche per l'analisi della composizione PG ha appena iniziato ad essere esplorata 12,13,14 e accoppiata all'analisi bioinformatica 12. A differenza dell'analisi proteomica che beneficia dei database proteici prontamente disponibili che prevedono la frammentazione dei peptidi consentendo un'identificazione completamente automatizzata, attualmente non esiste una libreria di frammentazione per i peptidoglycomics. Tuttavia, l'estrazione delle caratteristiche può essere accoppiata con database strutturali noti e previsti per prevedere l'identificazione del muropeptide12. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'uso dell'estrazione di caratteristiche basata su LC-MS combinata con una libreria di muropeptidi per l'identificazione automatizzata e l'analisi differenziale bioinformatica della composizione PG (Figura 2).

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Protocollo

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1. Preparazione del campione di peptidoglicano

  1. Crescita di colture batteriche
    NOTA: La crescita delle colture batteriche varierà a seconda delle specie batteriche e delle condizioni di crescita esaminate. I parametri sperimentali da testare definiranno le condizioni di crescita.
    1. Coltivare colture batteriche nelle condizioni di crescita richieste per il ceppo batterico e il disegno sperimentale. Coltivare i batteri come colture triplicate (repliche biologiche), cioè tre colonie separate per ceppo o condizione di crescita.
      NOTA: È noto che le condizioni di crescita e la fase di crescita hanno effetti significativi sulla composizione PG 1,2,10. Grande attenzione deve essere posta nel mantenere la coerenza tra culture e repliche per garantire che i cambiamenti compositivi siano dovuti ai parametri sperimentali e non all'errore sperimentale.
    2. Raffreddare rapidamente la coltura a 4 °C, raccogliere mediante centrifugazione (11.000 x g, 10 min, 4 °C) e congelare il pellet cellulare a -20 °C. Lavare il pellet cellulare con 4 °C preraffreddato, 20 mM di fosfato di sodio pH 6,5 prima del congelamento. La produzione del pellet cellulare congelato deve essere effettuata nel modo più rapido e coerente possibile tra i campioni per limitare l'attività degli enzimi che potrebbero modificare e/o degradare la PG durante il processo di raccolta. I campioni possono essere trattati direttamente attraverso il processo di estrazione (sezione 1.2) senza congelamento; Tuttavia, assicurarsi che tutti i campioni vengano elaborati in modo simile.
      NOTA: Per garantire un prodotto sufficiente per le fasi successive, viene utilizzato un pellet a cellule umide di dimensioni significative. Questo produce un pellet sacculi abbastanza grande, che può essere facilmente visualizzato e mantenuto durante le fasi di lavaggio ripetitivo (punti 1.2.5 e 1.2.14) senza perdite significative di prodotto. A seconda del batterio e delle condizioni di crescita, questa resa probabilmente varierà. Per il batterio Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa, PAO1, 4 L di una coltura di 0,5 OD600 hanno prodotto un pellet cellulare di 3-4 g ed è stato sufficiente per produrre ~ 10 mg di sacculi purificati (sezione 1.2.17)12. Si tratta di un eccesso di sacculi elevato rispetto a quello richiesto per la LC-MS (sezione 2); Tuttavia, aiuterà nella precisione della misurazione (sezione 1.2.17) e nella normalizzazione (sezione 1.3).
  2. Estrazione di peptidoglycan sacculi
    NOTA: Il protocollo per l'estrazione del PG è adattato dal rif.9,11,15. Questo protocollo estrarrà il PG dalle singole cellule batteriche nel loro insieme sacculi, prive di altri componenti cellulari. Il protocollo può essere utilizzato con batteri Gram-negativi o Gram-positivi. Tuttavia, per le cellule Gram-positive, possono essere necessari aggiustamenti per isolare la struttura PG più spessa e rimuovere i polimeri associati alla parete cellulare; come, acidi teicoici.
    1. Risospendere i pellet di cellule congelate a circa 1:10 del volume di coltura originale di 20 mM di fosfato di sodio pH 6,5. Eseguire questo passaggio a 4 °C (può essere 1-8 mg di peso del pellet a cellule umide per mL di tampone11,12).
      NOTA: Per mantenere lo stato di acetilazione del PG, è necessario un pH di 6,5 o inferiore15,16.
    2. Aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia all'ebollizione 8% 8% sodio dodecilsolfato (SDS) 20 mM fosfato di sodio pH 6,5 per un volume finale 1: 1 (cioè la concentrazione finale è 4% SDS), mescolando delicatamente in un matraccio a fondo rotondo dotato di un condensatore raffreddato ad acqua. (Figura 2, passaggio 2)
    3. Mantenere una leggera ebollizione per 30 minuti a 3 ore agitando per garantire la completa dissociazione della membrana. Assicurarsi che la miscela risultante sia completamente limpida senza grumi di cellule o viscosità residui. Si preferisce un'ebollizione più lunga per garantire la completa dissociazione.
    4. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Il campione può essere lasciato a temperatura ambiente durante la notte.
      NOTA: quando è presente SDS, mantenere i campioni a temperatura ambiente per mantenere SDS nella soluzione.
    5. Raccogliere i sacculi sotto forma di pellet mediante ultracentrifugazione a 70.000 x g per 40 minuti (o il tempo necessario per sedimentare completamente i sacculi) a 25 °C.
    6. Lavare ripetutamente i sacculi mediante successiva ultracentrifugazione (punto 1.2.5) e sospensione in ~50 mL di temperatura ambiente 20 mM di fosfato di sodio pH 6,5 fino a quando il tampone di lavaggio ha una concentrazione SDS ~0,001%. In genere, sono sufficienti da 5 a 7 lavaggi.
      NOTA: Per testare la concentrazione della SDS rimanente nel tampone di lavaggio, utilizzare il colorante colorimetrico, Stains-all17.
    7. Risospendere sacculi in 5–10 mL di temperatura ambiente 20 mM fosfato di sodio pH 6,5.
    8. Sonicare brevemente il campione (~40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) a temperatura ambiente per disperdere i grumi.
      NOTA: la sonicazione prolungata causerà meccanicamente il taglio della struttura PG18.
    9. Integrare il campione con 50 μg/ml di amilasi, DNasi e RNasi, 10 mM di solfato di magnesio e digerire a 37 °C per 1 ora agitando o nutando.
      NOTA: La digestione dell'amilasi rimuove qualsiasi glicogeno residuo intrappolato all'interno dei sacculi11.
    10. Aggiungere 100 μg/mL di pronase e digerire a 37 °C durante la notte agitazione o nutazione e ~0,02% di azoturo di sodio.
      NOTA: La digestione pronasica rimuove gli enzimi aggiunti (dalla sezione 1.2.9) e rimuove le lipoproteine che sono legate covalentemente al PG.
      ATTENZIONE: L'azoturo di sodio è altamente tossico e richiede metodi di uso / smaltimento adeguati.
    11. Ultracentrifugare a 70.000 x g per 40 minuti (o il tempo necessario per sedimentare completamente i sacculi) a 25 °C per rimuovere l'azoturo di sodio.
    12. Risospendere il pellet in 25 ml di SDS 20 mM fosfato di sodio pH 6,5.
    13. Far bollire per 1 ora in una vaporiera o nel matraccio a fondo tondo con condensatore raffreddato ad acqua (punto 1.2.2).
      NOTA: La seconda fase di ebollizione SDS rimuove tutte le proteine e i contaminanti rimanenti dai sacculi.
    14. Ripetere il lavaggio sacculi (punto 1.2.6) con ~50 mL di acqua bidistillata a temperatura ambiente (ddH2O) fino a quando la concentrazione di SDS è ~0,001%.
    15. Risospendere il pellet in una quantità sufficiente di ddH2O per sospendere i sacculi, nonché lavare il contenitore (ad esempio, 25 ml) e congelare per una notte a -80 °C. Il volume può variare in quanto il campione verrà liofilizzato nella fase successiva, anche se volumi più piccoli richiedono meno tempo per liofilizzare.
    16. Il giorno dopo, liofilizzare la sospensione e conservare a temperatura ambiente.
    17. Misurare la quantità di sacculi liofilizzati ottenuta su una bilancia analitica.
    18. Diluire sacculi in ddH2O a 10 mg/ml e sonicare brevemente per rompere i grumi prima di ulteriori analisi.
  3. Quantificazione del peptidoglicano purificato
    1. Quantificare la quantità di sacculi purificati di cui al punto 1.2.18 per garantire che i dati delle specifiche di massa siano equalizzati durante l'analisi differenziale (punto 3.2). Seguire la metodologia dettagliata delineata nel riferimento15.
      NOTA: I sacculi purificati (punto 1.2.18) sono scomposti in singoli componenti di zuccheri e amminoacidi mediante idrolisi acida. I singoli componenti vengono separati e quantificati mediante cromatografia a scambio anionico mediante rilevamento amperometrico pulsato. Data la struttura della PG (Figura 1), i singoli muropeptidi sono composti da un singolo residuo di MurNAc e da un singolo residuo di GlcNAc. Pertanto, quantificare la concentrazione di entrambi i residui rappresenta la quantità di muropeptidi 1:1 all'interno del campione. Il MurNAc è preferito a causa della netta separazione del picco dagli altri componenti PG durante la cromatografia16.

2. Acquisizione dati di spettrometria di massa

  1. Preparazione di muropeptidi per spettrometria di massa
    1. Integrare 800 μg di sacculi purificati con 100 μg/mL di mutanolysin, 100 mM di acetato di ammonio pH 5,5 e 50 mM di cloruro di magnesio in una reazione di 100 μL.
    2. Digerire a 37 °C per una notte.
    3. Aggiungere tampone borato 1:1 volume 0,5 M pH 9,0 e integrare con ~10 mg/mL di boroidruro di sodio (NaBH4).
      NOTA: La mutarotazione degli zuccheri ciclici tra α e β forme anomeriche causerà più formazioni di picco durante la separazione della cromatografia liquida dei muropeptidi. Il trattamento con NaBH4 elimina l'interconversione tra le due forme riducendo il MurNAc in muramitolo11. Il trattamento non riduce i residui zuccherini legati all'1,6-anidro MurNAc o all'1,4.
      ATTENZIONE: La reazione di NaBH4 produce piccole quantità di idrogeno gassoso. La reazione di NaBH4 creerà bolle e i tubi di microfuge dovrebbero essere tenuti aperti per consentire al gas di fuoriuscire.
    4. Incubare il campione a temperatura ambiente per ~20-30 minuti.
    5. Centrifugare brevemente per depositare il campione nel tubo di microfugo e rimuovere le bolle.
    6. Regolare il pH a <4,0 utilizzando acido fosforico 1:5, aggiunto con incrementi di 5 μL. Test del pH utilizzando strisce reattive per il pH a cartina di tornasole.
    7. Centrifugare a ~17.000 x g per 1 minuto per sedimentare qualsiasi materiale insolubile rimanente.
    8. Filtrare con filtri microcentrifuga da 0,2 μm.
    9. I campioni vengono centrifugati per 10 minuti a 30.000 x g prima dell'iniezione in LC-MS per garantire che il particolato non venga iniettato nella SM.
  2. Configurazione di LC-MS
    1. Collegare una colonna di particelle superficialmente porose C18 (100 mm x 2,1 mm, dimensione dei pori <3 μm) a uno spettrometro di massa QTOF (Quadrupole-Time of Flight) con una precisione di rilevamento minima di quattro punti decimali m/z .
    2. Eseguire la separazione cromatografica liquida dei muropeptidi
      NOTA: Ogni triplice biologico (punto 1.1.1) deve essere eseguito attraverso la LC-MS (punti da 2.2.2 a 2.2.3) tre volte (triplice tecnica). Pertanto, ogni condizione testata avrà un totale di nove file di dati LC-MS. L'acquisizione dei dati è stata eseguita utilizzando software disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). Tuttavia, il software di acquisizione dovrebbe essere scelto in base al macchinario MS. Di seguito rappresenta una guida per l'impostazione dello SM con parametri specifici per l'esecuzione di questo protocollo. Per una descrizione dettagliata, fare riferimento al manuale del produttore.
      1. Per la separazione cromatografica, preparare i seguenti solventi 0,1% acido formico (A) e acetonitrile con acido formico 0,1% (B).
      2. Impostare un metodo per la separazione cromatografica utilizzando i seguenti parametri.
      3. Impostare la portata su 0,4 ml/min.
      4. Condizionare la colonna per 10 minuti al 2% B (~24 volumi di colonna).
      5. Utilizzando un autocampionatore, iniettare 10 μL di campione dal punto 2.1.9.
        NOTA: eseguire un campione iniziale tramite il protocollo LC-MS prima di iniziare la raccolta dei dati. Questa esecuzione non viene utilizzata per i dati, ma per aumentare la riproducibilità del tempo di conservazione per tutte le esecuzioni successive. La riproducibilità del tempo di ritenzione è richiesta durante l'elaborazione spettrale (sezione 3.1) per l'identificazione accurata e il raggruppamento dei picchi del rapporto massa-carica (m/z).
      6. Separare i muropeptidi usando il 2% B per 5 minuti (~ 12 volumi di colonna), quindi aumentandolo al 15% B su 13 minuti (~ 30 volumi di colonna), aumentandolo ulteriormente al 50% B su 10 minuti (~ 24 volumi di colonna) e infine aumentandolo al 98% B su 2 minuti (~ 5 volumi di colonna).
        NOTA: scartare (inviare ai rifiuti) i primi 2 minuti e gli ultimi 5 minuti della pendenza.
      7. Terminare con un lavaggio della colonna al 98% B per 6 minuti (~14 volumi di colonna) e 20 minuti (~47 volumi di colonna).
    3. Eseguire la rivelazione spettrometrica di massa di muropeptidi
      1. Calibrare l'asse di massa in modalità positiva utilizzando una miscela di regolazione in acetonitrile contenente gli standard di massa di riferimento LC-MS seguendo le istruzioni del produttore MS.
        NOTA: La SM viene sintonizzata prima dell'inizio delle prove cromatografiche (punto 2.2.2.1).
      2. Impostare un metodo per l'acquisizione dei dati MS utilizzando i seguenti parametri.
        NOTA: i dati relativi alla SM e alla SM/SM sono raccolti (punti da 2.2.3.2 a 2.2.3.6) contemporaneamente alla separazione cromatografica dei muropeptidi (punti 2.2.2.4 e 2.2.2.5). Sia i parametri cromatografici che quelli MS (sezioni 2.2.2.2 e 2.2.3.2) sono un singolo metodo che viene aggiunto durante l'impostazione di una lista di lavoro per l'esecuzione di più campioni in sequenza.
      3. Impostare la tensione capillare dell'elettrospray a 4,0 kV e la temperatura del gas di essiccazione a 350°C con una portata di 13 L/min.
        NOTA: L'azoto (purezza >99%) deve essere utilizzato come gas di nebulizzazione, essiccazione e collisione durante tutta la raccolta dei dati di spettrometria di massa.
      4. Impostare la pressione del nebulizzatore a 40 psi e impostare il frammentatore su 150 V.
      5. Impostare le tensioni RF dell'ugello, dello skimmer e dell'ottapolo rispettivamente su 1000 V, 65 V e 750 V.
      6. Impostare l'intervallo di scansione su 300–2.000 m/z in modalità ioni positivi a 4 GHz (gamma dinamica estesa).
      7. Imposta la raccolta dei dati utilizzando l'acquisizione MS/MS dipendente dai dati con una velocità di scansione MS e MS/MS di 1 spettri/secondo. Selezionare cinque masse precursori per ciclo, nell'ordine di carica singola, doppia e tripla.
      8. Impostare le energie di collisione a frammentazione MS/MS a 15, 20 e 30 eV.

3. Analisi differenziale dell'abbondanza di muropeptidi

  1. Elaborazione spettrale del cromatogramma LC-MS
    NOTA: l'estrazione ricorsiva delle feature è stata eseguita utilizzando software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). È possibile utilizzare altri software di estrazione delle funzionalità. Tuttavia, altri software potrebbero richiedere un'ulteriore elaborazione manuale dei dati per eseguire l'estrazione ricorsiva altamente robusta. Vari software utilizzano la funzione terminologica, l'entità e il composto quasi in modo intercambiabile. Per l'analisi PG, tutti si riferiscono all'identificazione del cromatogramma ionico LC-MS rappresentativo di un singolo muropeptide (ad esempio, Figura 3). Durante l'elaborazione spettrale (sezione 3.1), una caratteristica rappresenta i picchi multipli m/z che comprendono le molteplici possibili specie ioniche di un singolo muropeptide che sono raggruppate sotto un'unica etichetta composta.
    1. In File avviare un nuovo progetto.
    2. Aggiungere i file di dati LC-MS QTOF e assegnare singoli file di dati a una condizione / gruppo sperimentale, ad esempio due diverse condizioni di crescita.
    3. Eseguire l'estrazione di feature ricorsive batch (piccole molecole/peptidi) della procedura guidata di elaborazione dati e impostare i filtri di elaborazione dati in modo che corrispondano ai parametri delle condizioni e della strumentazione LC-MS per identificare, raggruppare e verificare con precisione i picchi m/z che rappresentano i singoli muropeptidi. Dal cromatogramma, esaminare la deriva del tempo di ritenzione e la variazione di m/z di picchi simili noti per impostare i parametri iniziali del filtro.
      NOTA: l'estrazione ricorsiva delle caratteristiche utilizza un algoritmo iniziale di estrazione delle caratteristiche molecolari non mirate per identificare e allineare le caratteristiche del cromatogramma (picchi m/z ) su tutti i file di dati. Una volta create, queste funzionalità vengono utilizzate per rivalutare i file di dati originali (ricorsivi) con un algoritmo di estrazione delle caratteristiche molecolari mirato per migliorare l'affidabilità e l'accuratezza delle caratteristiche identificate. È consigliabile impostare l'estrazione iniziale non mirata con una finestra di rilevamento ristretta e utilizzare parametri di rilevamento più ampi per l'estrazione ricorsiva per identificare i picchi in tutti i file di dati che potrebbero mancare nell'estrazione iniziale. Il completamento dell'esecuzione dell'estrazione ricorsiva delle funzionalità può richiedere ore a seconda del numero di campioni, della complessità dei dati e dell'hardware del computer presente
    4. Esaminare i risultati dell'estrazione delle feature. Se un numero significativo di feature non è stato allineato in un gruppo, modificare i parametri di filtro ricorsivo per ampliare/limitare la finestra di rilevamento in base alle esigenze. A tale scopo, ispezionare il cromatogramma e il profilo isotopico di ciascuna caratteristica estratta per garantire che il rilevamento delle caratteristiche sia stato eseguito in modo simile in tutti i file di dati. Inoltre, per ogni caratteristica identificata all'interno di un file di dati, esaminare il punteggio, eventuali avvisi e se la caratteristica ha superato i parametri di filtro scelti.
      NOTA: è necessario prestare attenzione a mantenere le finestre di rilevamento sufficientemente strette da non raggruppare erroneamente feature distinte. Questo è spesso notato da profili isotopici disparati tra i file di dati o significative variazioni m/z / tempo di conservazione. Al contrario, se ci sono più caratteristiche con tempi di ritenzione e m /z simili, è possibile che i parametri del filtro fossero troppo rigorosi, con conseguente suddivisione di un picco MS in due caratteristiche. Pertanto, eseguire nuovamente l'estrazione delle feature (sezione 3.1.3) con parametri di filtro del tempo di conservazione regolati per consentire un migliore raggruppamento di queste caratteristiche. La visualizzazione dei picchi di abbondanza più bassi indicherà se i filtri utilizzati (sezione 3.1.3) hanno identificato con precisione i picchi al di sopra del rumore di fondo. Se i picchi di abbondanza più bassi sono simili allo sfondo, eseguire nuovamente l'estrazione della feature con nuovi parametri del filtro di sfondo.
    5. Esportare i dati come file di scambio composto (.cef) (un formato compatibile con il programma software statistico) o un file separato da colonne (.csv) che contiene la massa, il tempo di conservazione e l'abbondanza di ogni caratteristica per ogni campione.
  2. Analisi differenziale delle caratteristiche spettrali
    NOTA: l'analisi differenziale è stata eseguita utilizzando software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). Possono essere utilizzati altri software bioinformatici.
    1. Apri il programma e quando richiesto inizia un nuovo progetto.
    2. Seguire le istruzioni per l'importazione e l'analisi dei dati. Durante l'importazione dei dati, caricate i file estratti (sezione 3.1). Durante l'analisi dei dati, scegliere la significatività e la modifica della piega per l'analisi differenziale e selezionare i dati di base per l'intensità mediana in tutti i file di dati. Non impostare alcun filtro dati (se questa operazione è stata eseguita nella precedente fase di elaborazione degli spettri (sezione 3.1)) poiché l'applicazione di nuovi filtri annullerebbe l'estrazione robusta della feature ricorsiva. Tuttavia, analogamente all'estrazione delle caratteristiche, l'analisi differenziale deve essere allineata in base alla massa (m/z) e al tempo di ritenzione dovuto alla deriva nella raccolta dei dati LC-MS. Utilizzare i parametri determinati nell'estrazione delle feature (sezione 3.1).
      NOTA: Normalizzare tra file di dati utilizzando la quantificazione del muropeptide (sezione 1.3) per garantire che le variazioni siano dovute a parametri sperimentali e non a variazioni nella purificazione dei sacculi (punto 1.2). Utilizzare l'opzione scaler esterno per regolare ogni file di dati per le differenze nella concentrazione di MurNAc del campione.
    3. Una volta completata l'analisi, esaminare le analisi grafiche e statistiche risultanti per identificare i muropeptidi che dimostrano un cambiamento significativo dell'abbondanza tra le condizioni sperimentali testate.
    4. Sotto il navigatore del progetto, fate clic con il pulsante destro del mouse sulle varie analisi e scegliete un'opzione di esportazione per salvare i dettagli della feature come file di dati separati da colonne (.csv) che contiene m /z, tempo di ritenzione, valori di intensità grezzi e normalizzati, valore p, FDR e modifiche di piegatura per ciascuna feature. È necessario salvare più analisi per ottenere tutti i dati rilevanti.
    5. Esportare un secondo file .csv contenente solo i muropeptidi che hanno superato le analisi statistiche, tra cui il valore p <0,05 e il cambio di piega >2.
  3. Annotazione dell'identità del muropeptide alle caratteristiche spettrali
    NOTA: Ad ogni caratteristica identificata deve essere assegnata una struttura di muropeptide prevista basata su m/z e questa annotazione è confermata esaminando la frammentazione MS/MS. Dopo aver confermato le annotazioni, può essere necessario eseguire e perfezionare l'analisi differenziale (sezione 3.2).
    1. All'interno del software di analisi differenziale, in Interpretazione dei risultati, selezionare ID browser. Aggiungere una libreria di strutture muropeptidiche attese e selezionare parametri simili a quelli usati in precedenza (sezione 3.1.3). Ciò produrrà un'annotazione di muropeptide prevista per ogni caratteristica identificata. Una libreria di strutture muropeptidiche può essere prodotta utilizzando m /z per le strutture muropeptidiche previste e il software di database MS (vedi Tabella dei materiali). Tuttavia, una libreria di m/z di >6.000 possibili muropeptidi può essere trovata nel riferimento12.
    2. Selezionare l'annotazione del muropeptide previsto in base al punteggio corrispondente e alla rilevanza biologica del muropeptide previsto, ovvero scegliere il muropeptide più probabile da presentare nel campione biologico.
    3. Confermare manualmente l'annotazione del muropeptide prevista confrontando i picchi m/z del cromatogramma MS/MS con il m/z previsto di tutte le possibili frammentazioni di una struttura di muropeptide nota (ad esempio, Figura 4).
      1. Visualizzare i dati MS e MS/MS utilizzando un programma di visualizzazione del cromatogramma (vedere la tabella dei materiali, figura 4).
      2. Disegnare la struttura del muropeptide prevista utilizzando un editor molecolare (programma di disegno della struttura chimica) (vedi Tabella dei materiali, Figura 4, riquadro grigio). Utilizzare lo strumento di frammentazione di massa per mostrare la m/z dei frammenti MS quando ogni legame viene rotto singolarmente o in combinazione.
        NOTA: A seconda dell'energia di frammentazione utilizzata per MS/MS, la frammentazione può avvenire in qualsiasi legame nella struttura del muropeptide. Tuttavia, alcuni legami sono più facilmente / frequentemente frammentati a livelli di energia più bassi. Ad esempio, la frammentazione nella catena laterale del peptide si verifica più spesso nel legame ammidico tra gli amminoacidi. Durante la valutazione della frammentazione, è importante notare che i residui di GlcNAc sono molto facilmente frammentati dal muropeptide. Pertanto, la frammentazione della struttura del muropeptide nota deve essere valutata con e senza GlcNAc. A causa della frammentazione in-source del GlcNAc, diverse caratteristiche estratte nell'elaborazione spettrale (sezione 3.1) possono rappresentare una singola struttura muropeptidica. Se trovate, queste caratteristiche dovrebbero essere unite e l'analisi differenziale rivalutata.
      3. Confrontare tutte le possibili frammentazioni della struttura del muropeptide che è stata determinata (sezione 3.3.3.2) con il cromatogramma MS/MS (sezione 3.3.3.1). Per confermare l'annotazione del muropeptide, i picchi m /z di più frammenti dovrebbero essere trovati nel cromatogramma MS/MS con una finestra di allineamento m /z molto minima (Figura 4).
      4. Al fine di chiarire l'identità del muropeptide in caso di frammentazione ambigua MS/MS, ripetere le sezioni da 2.2.2 a 2.2.3 con campioni (sezione 2.1.9) per un'ulteriore acquisizione di dati MS/MS che incorpora un elenco precursore preferito di m/z e tempo di ritenzione con energie di collisione di frammentazione MS/MS aggiuntive.
    4. Per le entità co-eluenti che sono state annotate come lo stesso muropeptide, eseguire nuovamente l'analisi differenziale (sezione 3.2.2) e unire le caratteristiche estratte.
  4. Valutazione dei cambiamenti globali nelle modificazioni del muropeptide
    1. Modificare il file .csv (sezione 3.2.4) dei muropeptidi statisticamente significativi ad alto cambiamento di piega per includere una singola colonna per ogni modifica del muropeptide. Popolare questa colonna con una designazione per ogni muropeptide annotato (sezione 3.3) (ad esempio, GlcNAc acetilato rispetto a GlcNAc o MurNAc de-N-acetilato).
    2. Carica il file .csv modificato in Perseus22,23. Importare i valori di intensità normalizzati nella casella Importazione principale e importare la designazione di modifica nella casella Importazione categoriale.
    3. In Annota righe, fare clic su Categoricamente annota righe e aggiungere file di dati a ciascun parametro sperimentale.
    4. In test, fai clic su due test di esempio per eseguire il test t di uno studente (valore p < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Fare clic su 1D per eseguire l'annotazione 1D22,23. Un'annotazione 1D FDR < 0,05 indica un cambiamento significativo dell'abbondanza per la modifica del muropeptide tra i parametri sperimentali testati. Impostando il valore di soglia (s0) = 1 verranno visualizzati i punteggi FDR dell'annotazione 1D per tutti i muropeptidi.
    6. All'interno di un software grafico (vedi Tabella dei materiali), produrre una mappa termica del cambiamento di piega dell'abbondanza per ogni modifica del muropeptide e mostrare il punteggio di annotazione 1D per dimostrare la significatività (Figura 5B). Il cambiamento di piega di ogni modifica del muropeptide può essere prodotto in Microsoft Excel utilizzando le intensità grezze di tutti i singoli muropeptidi che contengono la modifica.

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Risultati

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La maggiore sensibilità di rilevamento dei macchinari MS unita al potente software di riconoscimento dei picchi ha migliorato la capacità di isolare, monitorare e analizzare le composizioni di sostanze di campioni complessi con dettagli molto minuti. Utilizzando questi progressi tecnologici, recenti studi sulla composizione del peptidoglicano hanno iniziato a utilizzare tecniche automatizzate di estrazione delle caratteristiche LC-MS 12,13,14,24 rispetto alla vecchia metodologia basata su HPLC

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Discussione

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Questo protocollo descrive un metodo per purificare il peptidoglicano da colture batteriche, processo per il rilevamento di LC-MS e analizzare la composizione utilizzando tecniche bioinformatiche. Qui, ci concentriamo sui batteri Gram-negativi e sarà necessaria qualche leggera modifica per consentire l'analisi dei batteri Gram-positivi.

La preparazione dei muropeptidi è rimasta praticamente la stessa da quando è stata prodotta per la prima volta nel 1960 9,11,15.

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Jennifer Geddes-McAlister e il dottor Anthony Clarke per il loro contributo nel perfezionamento di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative del CIHR assegnate a C.M.K (PJT 156111) e da un NSERC Alexander Graham Bell CGS D assegnato a E.M.A. Le figure sono state create su BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
C18 colonna di fase inversa - Colonna AdvanceBio Peptide (100 mm x 2,1 mm 2,7 &; micro; m)AgilentLC-MS acquisizione dati
Regolatore mantello riscaldante, OptichemFisher50-401-788per ebollizione SDS al 4%
Mantello riscaldante, 1000mL CG1000008 Fisher emisfericoper ebollizione SDS al 4%
Incubatore, 37° Cper la purificazione del sacculi e la preparazione del campione MS
Condensatore Leibig, 300MM 24/40,FisherCG121805per l'ebollizione SDS al 4%
LiofilizzatoreLabconcoper la liofilizzazione del sacculi
Agitatore magenticoFisher90-691-18per l'ebollizione al 4% SDS
Spettrometro di massa Q-Tof modello UHD 6530AglientLC-MS acquisizione dati
filtri per microcentrifuga, Nanosep MF 0.2 µ mFisher50-197-9573pulizia del campione prima dell'iniezione MS
Supporto per stortaFisher12-000-102per ebollizione SDS al 4%
Morsetto per stortaFisherS02629per ebollizione SDS al 4%
pallone a fondo tondo - 1 litro di pyrexFisher07-250-084per ebollizione SDS al 4%
Sonicatore modello 120FisherFB120per purificazione sacculi
Sonicatore - micro puntaFisherFB4422per la purificazione del sacculi
UltracentrifugaBeckmanfasi di lavaggio sacculi
Flaconi per ultracentrifuga, Ti45FisherNC9691797fasi di lavaggio sacculi
Alimentazione idricaCittàper condensatore
Software
ChemdrawCambridgesofteditor molecolare per la previsione della frammentazione dei muropeptidi
ExcelMicrosoftvisualizza elenchi di muropeptidi annotati, abbondanza, modelli isotopici, ecc.
MassHunter AcquisitionAglientrunning QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professionaldifferenziale bioinformaticaAglient
MassHunter Personal Compound Database and Library ManagerMuropeptide Aglientm/z MS database
MassHunter Profinderricorsiva delle caratteristiche
AglientMassHunter Analisi qualitativaVisualizzazione aglienteCromatogrammi MS e MS/MS
PrismaGraphpadSoftware di grafica
PerseusMax Plank Istituto di BiochimicaAnnotazione
Materiale
AcetonitrileFisherA998-4
Acetato di ammonioFisherA637
AmilasiSigma-AldrichA6380
Acido boricoFisherBP168-1
DNasiFisherEN0521
Acido formicoSigma-Aldrich27001-500ML-R
Miscela di sintonizzazione LC-MS - HP0321AgilentG1969-85000
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM8266
Solfato di magnesioSigma-AldrichM7506
Mutanolisina da Streptomyces globisporus ATCC 21553Sigma-AldrichM9901
Azoto gassoso (purezza >99%)PraxairNI 5.0UH-T
Acido fosforicoFisherA242
Pronasi E da Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
RNasiFisherEN0531
Sodio azideFisherS0489
Boroidruro di sodioSigma-Aldrich452890
Sodio dodecil solfato (SDS)FisherBP166
Idrossido di sodioFisherS318
Sodio Fosfato (dibasico)FisherS373
Fosfato di sodio (monobasico)FisherS369
Coloranti-tuttoSigma-AldrichE9379
raffreddato ad acqua Analisi Estrazione 1D

Riferimenti

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  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
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