Questo protocollo copre un'analisi dettagliata della composizione del peptidoglicano utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida abbinata a software avanzati di estrazione delle caratteristiche e analisi bioinformatica.
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Articolo metodologico
Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il peptidoglicano è un componente importante delle pareti cellulari batteriche e un bersaglio cellulare comune per gli antimicrobici. Sebbene gli aspetti della struttura del peptidoglicano siano abbastanza conservati in tutti i batteri, c'è anche una notevole variazione tra Gram-positivi / negativi e tra le specie. Inoltre, ci sono numerose varianti, modifiche o adattamenti noti al peptidoglicano che possono verificarsi all'interno di una specie batterica in risposta alla fase di crescita e / o stimoli ambientali. Queste variazioni producono una struttura altamente dinamica che è nota per partecipare a molte funzioni cellulari, tra cui la crescita / divisione, la resistenza agli antibiotici e l'evitamento della difesa dell'ospite. Per comprendere la variazione all'interno del peptidoglicano, la struttura complessiva deve essere scomposta nelle sue parti costitutive (note come muropeptidi) e valutata per la composizione cellulare complessiva. Peptidoglycomics utilizza la spettrometria di massa avanzata combinata con l'analisi dei dati bioinformatici ad alta potenza per esaminare la composizione del peptidoglicano nei minimi dettagli. Il seguente protocollo descrive la purificazione del peptidoglicano da colture batteriche, l'acquisizione di dati di intensità del muropeptide attraverso uno spettrometro di massa cromatografo liquido e l'analisi differenziale della composizione del peptidoglicano utilizzando la bioinformatica.
Introduzione
Il peptidoglicano (PG) è una caratteristica distintiva dei batteri che serve a mantenere la morfologia cellulare, fornendo supporto strutturale per proteine e altri componenti cellulari 1,2. La spina dorsale del PG è composta dall'acido N-acetil muramico (MurNAc) alternato β-1,4-e dalla N-acetil glucosamina (GlcNAc)1,2. Ogni MurNAc possiede un peptide corto legato al residuo ᴅ-lattile che può essere reticolato con peptidi adiacenti legati al disaccaride (Figura 1A,B). Questa reticolazione....
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Protocollo
1. Preparazione del campione di peptidoglicano
- Crescita di colture batteriche
NOTA: La crescita delle colture batteriche varierà a seconda delle specie batteriche e delle condizioni di crescita esaminate. I parametri sperimentali da testare definiranno le condizioni di crescita.- Coltivare colture batteriche nelle condizioni di crescita richieste per il ceppo batterico e il disegno sperimentale. Coltivare i batteri come colture triplicate (repliche biologiche), cioè tre colonie separate per ceppo o condizione di crescita.
NOTA: È noto che le condizioni di crescita e la fase di crescita hanno effetti significativi sulla composizio....
- Coltivare colture batteriche nelle condizioni di crescita richieste per il ceppo batterico e il disegno sperimentale. Coltivare i batteri come colture triplicate (repliche biologiche), cioè tre colonie separate per ceppo o condizione di crescita.
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Risultati
La maggiore sensibilità di rilevamento dei macchinari MS unita al potente software di riconoscimento dei picchi ha migliorato la capacità di isolare, monitorare e analizzare le composizioni di sostanze di campioni complessi con dettagli molto minuti. Utilizzando questi progressi tecnologici, recenti studi sulla composizione del peptidoglicano hanno iniziato a utilizzare tecniche automatizzate di estrazione delle caratteristiche LC-MS 12,13,14,24 rispetto alla vecchia metodologia basata su HPLC
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Discussione
Questo protocollo descrive un metodo per purificare il peptidoglicano da colture batteriche, processo per il rilevamento di LC-MS e analizzare la composizione utilizzando tecniche bioinformatiche. Qui, ci concentriamo sui batteri Gram-negativi e sarà necessaria qualche leggera modifica per consentire l'analisi dei batteri Gram-positivi.
La preparazione dei muropeptidi è rimasta praticamente la stessa da quando è stata prodotta per la prima volta nel 1960 9,11,15.
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Jennifer Geddes-McAlister e il dottor Anthony Clarke per il loro contributo nel perfezionamento di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative del CIHR assegnate a C.M.K (PJT 156111) e da un NSERC Alexander Graham Bell CGS D assegnato a E.M.A. Le figure sono state create su BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| C18 colonna di fase inversa - Colonna AdvanceBio Peptide (100 mm x 2,1 mm 2,7 &; micro; m) | Agilent | LC-MS acquisizione dati | |
| Regolatore mantello riscaldante, Optichem | Fisher | 50-401-788 | per ebollizione SDS al 4% |
| Mantello riscaldante, 1000mL CG1000008 Fisher emisferico | per ebollizione SDS al 4% | ||
| Incubatore, 37° C | per la purificazione del sacculi e la preparazione del campione MS | ||
| Condensatore Leibig, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | per l'ebollizione SDS al 4% |
| Liofilizzatore | Labconco | per la liofilizzazione del sacculi | |
| Agitatore magentico | Fisher | 90-691-18 | per l'ebollizione al 4% SDS |
| Spettrometro di massa Q-Tof modello UHD 6530 | Aglient | LC-MS acquisizione dati | |
| filtri per microcentrifuga, Nanosep MF 0.2 µ m | Fisher | 50-197-9573 | pulizia del campione prima dell'iniezione MS |
| Supporto per storta | Fisher | 12-000-102 | per ebollizione SDS al 4% |
| Morsetto per storta | Fisher | S02629 | per ebollizione SDS al 4% |
| pallone a fondo tondo - 1 litro di pyrex | Fisher | 07-250-084 | per ebollizione SDS al 4% |
| Sonicatore modello 120 | Fisher | FB120 | per purificazione sacculi |
| Sonicatore - micro punta | Fisher | FB4422 | per la purificazione del sacculi |
| Ultracentrifuga | Beckman | fasi di lavaggio sacculi | |
| Flaconi per ultracentrifuga, Ti45 | Fisher | NC9691797 | fasi di lavaggio sacculi |
| Alimentazione idrica | Città | per condensatore | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | editor molecolare per la previsione della frammentazione dei muropeptidi | |
| Excel | Microsoft | visualizza elenchi di muropeptidi annotati, abbondanza, modelli isotopici, ecc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | differenziale bioinformatica | Aglient | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Muropeptide Aglient | m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | ricorsiva delle caratteristiche | ||
| AglientMassHunter Analisi qualitativa | Visualizzazione agliente | Cromatogrammi MS e MS/MS | |
| Prisma | Graphpad | Software di grafica | |
| Perseus | Max Plank Istituto di Biochimica | Annotazione | |
| Materiale | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Acetato di ammonio | Fisher | A637 | |
| Amilasi | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Acido borico | Fisher | BP168-1 | |
| DNasi | Fisher | EN0521 | |
| Acido formico | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| Miscela di sintonizzazione LC-MS - HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Solfato di magnesio | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolisina da Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Azoto gassoso (purezza >99%) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Acido fosforico | Fisher | A242 | |
| Pronasi E da Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNasi | Fisher | EN0531 | |
| Sodio azide | Fisher | S0489 | |
| Boroidruro di sodio | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Idrossido di sodio | Fisher | S318 | |
| Sodio Fosfato (dibasico) | Fisher | S373 | |
| Fosfato di sodio (monobasico) | Fisher | S369 | |
| Coloranti-tutto | Sigma-Aldrich | E9379 |
Riferimenti
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W.
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Ristampe e permessi
