Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull'aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
All'interno dello stesso paziente, l'assenza di espressione superficiale dei ligandi NKG2D (NKG2DL) ha dimostrato di distinguere le sottopopolazioni leucemiche con proprietà delle cellule staminali (le cosiddette cellule staminali leucemiche, LSC) da cellule leucemiche di controparte più differenziate che mancano di potenziale di iniziazione della malattia sebbene portino mutazioni genetiche specifiche della leucemia simili. Gli NKG2DL sono auto-molecole simili a MHC di classe I, biochimicamente molto diverse. Le cellule sane in condizioni omeostatiche generalmente non esprimono NKG2DL sulla superficie cellulare. Invece, l'espressione di questi ligandi è indotta dall'esposizione allo stress cellulare (ad esempio, trasformazione oncogenica o stimoli infettivi) per innescare l'eliminazione delle cellule danneggiate attraverso lalisi attraverso cellule immunitarie che esprimono il recettore NKG2D come le cellule natural killer (NK). È interessante notare che l'espressione superficiale di NKG2DL viene soppressa selettivamente nelle sottopopolazioni LSC, consentendo a queste cellule di eludere la sorveglianza immunitaria mediata da NKG2D. Qui, presentiamo un'analisi affiancata di due diversi metodi di citometria a flusso che consentono lo studio dell'espressione superficiale di NKG2DL sulle cellule tumorali, cioè un metodo che prevede il riconoscimento del pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi multipli contro singoli ligandi. Questi metodi possono essere utilizzati per separare le sottopopolazioni cellulari negative NKG2DL vitali con proprietà putative delle cellule staminali tumorali dal NKG2DL positivo non LSC.
Introduzione
Le cellule NK sono importanti effettori del sistema immunitario innato in grado di riconoscere ed eliminare le cellule maligne o le cellule sane stressate (ad esempio, da un'infezione virale) senza previo stimolo dell'antigene1. Questo processo è strettamente regolato attraverso un complesso repertorio di recettori attivanti - come recettori naturali della citotossicità (NCR), NKG2D e CD16 - e recettori inibitori che sono in gran parte rappresentati da recettori killer simili a immunoglobuline (KIR)2. Il legame dei KIR con le molecole umane di antigene leucocitare (HLA) di classe I su cellule somatiche garantisce l'auto-....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I campioni dei pazienti sono stati raccolti in seguito all'approvazione del Comitato di revisione etica degli ospedali universitari di Basilea e Tuebingen.
1. Biotinilazione della proteina di fusione NKG2D
NOTA: Questo passaggio viene eseguito con un kit di biotinylation (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Questa fase del protocollo deve essere eseguita almeno 24 ore prima della colorazione. La proteina di fusione NKG2D biotinilata deve essere conservata a -20 °C.
- Scongelare sia la biotina, sia i tubi proteici di fusione NKG2D a temperatura ambiente (RT).<....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Entrambi i protocolli qui presentati consentono l'arricchimento di AML LSC mediante analisi citometriche di flusso utilizzando CD34, un marcatore noto di LSC17, in combinazione con l'espressione superficiale NKG2DL utilizzando il riconoscimento pan-ligando o macchiando con anticorpi raggruppati contro singoli ligandi. Nella figura 1, mostriamo che i campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, che è mostrata .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui presentiamo due metodi citometrici a flusso in grado di rilevare l'espressione di superficie NKG2DL sulle cellule AML primarie umane. Mostriamo che entrambi i metodi di rilevamento possono essere utilizzati in combinazione con altre colorazioni anticorpali (ad esempio, rilevando l'espressione CD34). Colorazioni simili possono essere eseguite anche su altri tipi di cellule primarie e linee cellulari.
Di recente abbiamo dimostrato che l'assenza di NKG2DL sulla superficie delle esplosioni del.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione nazionale svizzera per la scienza (179239), della Fondazione per la lotta contro il cancro (Zuerich), della Fondazione Wilhelm Sander a CL (2019.042.1) e della Fondazione Novartis per la ricerca medico-biologica a C.L. Inoltre, questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 765104. Ringraziamo il Flow Cytometry Facility di Basilea per il supporto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 7-amminoactinomicina D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Colorante di vitalità |
| Piastra a 96 pozzetti Fondo a U | Sarstedt | 833925500 | Piastra a 96 pozzetti per il nostro citometro a flusso |
| APC Topo Anti-umano cd34 | BD | 555824 Anticorpo che rileva CD34 RRID: AB_398614 | |
| Albumina sierica bovina | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Componente della colorazione tampone |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Roth | 8043.1 | Componente del tampone di colorazione |
| Fetale Siero di vitello (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Componente del mezzo RPMI integrato |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software che consente l'analisi dei dati per l'esperimento di citometria a flusso |
| IgG di capra anti-coniglio (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Anticorpo secondario che rileva gli anticorpi primari per MICA e MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R& D | 1299-NK-050 | Proteina di fusione che rileva tutti gli NKG2DL RRID: |
| R | & D | AF1380 | Anticorpo che rileva ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Umano ULBP-2/5/6 Anticorpo | R& D | AF1298 | Anticorpo che rileva ULBP2/5/6 RRID: |
| AB_354725 Anticorpo umano ULBP-3 | R& D | AF1517 | Anticorpo di rilevamento ULBP3 RRID: |
| AB_354835 MICA Anticorpo policlonale | Thermo Scientific | PA5-35346 | Anticorpo di rilevamento MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Anticorpo policlonale | Thermo Scientific | PA5-66698 | Anticorpo di rilevamento MICB RRID: AB_2663413 |
| Kit di biotinilazione anticorpale in un'unica fase 1 striscia, per 8 reazioni | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Kit di biotinilazione per la proteina di fusione NKG2DL |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Componente del tampone di colorazione |
| Coniglio anti-capra IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Anticorpo secondario che rileva gli anticorpi primari per ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Perle utilizzate per la manutenzione del dispositivo di citometria a flusso |
| Mezzo RPMI | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Terreno di coltura cellulare |
| RayBright Perle di compensazione universale Raybiotech | 137-00013-100 | Perle utilizzate per creare la matrice di compensazione | |
| Streptavidina, R-Ficoeritrina coniugato (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Fase secondaria per la rilevazione della proteina di fusione NKG2DL biotinilata |
Riferimenti
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clini....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
