3D Coltivazione di Organoidi dall'Epitelio Villi Intestinale sottoposti a Dedifferenziazione

Christina Li; Jeel Shah; Kylee Wrath; Dahlia Matouba; Connor Mills; Kishore Punnath; Ansu Perekatt

doi:10.3791/61809

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Articolo metodologico

3D Coltivazione di Organoidi dall'Epitelio Villi Intestinale sottoposti a Dedifferenziazione

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DOI:

10.3791/61809

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1 aprile 2021

Christina Li¹ , Jeel Shah¹ , Kylee Wrath¹ , Dahlia Matouba¹ , Connor Mills¹ , Kishore Punnath² , Ansu Perekatt¹

¹Department of Biology and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, ²Department of Pharmacology, Pennsylvania State University College of Medicine

In questo articolo

Sommario

La procedura descrive l'isolamento dei villi dall'epitelio intestinale del topo sottoposto a dedifferenziazione per determinare il loro potenziale di formazione organoide.

Abstract

La clonogenicità degli organoidi dell'epitelio intestinale è attribuita alla presenza di cellule staminali in esso. L'epitelio intestinale di topo è compartimentato in cripte e villi: le cellule staminali e proliferanti sono confinate nelle cripte, mentre l'epitelio villi contiene solo cellule differenziate. Quindi, le normali cripte intestinali, ma non i villi, possono dare origine a organoidi nelle colture 3D. La procedura qui descritta è applicabile solo all'epitelio villus sottoposto a dedifferenziazione che porta allo staminale. Il metodo descritto utilizza il topo mutante condizionale Smad4-loss-of-function:β-catenina gain-of-function (Smad4 KO:β-catenina^GOF). La mutazione fa sì che i villi intestinali dedifferenziati e generino cellule staminali nei villi. I villi intestinali sottoposti a dedifferenziazione vengono raschiati via dall'intestino usando vetrini, posti in un colino da 70 μm e lavati più volte per filtrare eventuali cellule sciolte o cripte prima della placcatura nella matrice BME-R1 per determinare il loro potenziale organoide-formante. Due criteri principali sono stati utilizzati per garantire che gli organoidi risultanti fossero sviluppati dal compartimento dei villi dedifferenzianti e non dalle cripte: 1) valutare microscopicamente i villi isolati per garantire l'assenza di cripte tethered, sia prima che dopo la placcatura nella matrice 3D, e 2) monitorare il corso temporale dello sviluppo organoide dai villi. L'iniziazione organoide dai villi avviene solo da due a cinque giorni dopo la placcatura e appare di forma irregolare, mentre gli organoidi derivati dalla cripta dello stesso epitelio intestinale sono evidenti entro sedici ore dalla placcatura e appaiono sferici. Il limite del metodo, tuttavia, è che il numero di organoidi formati e il tempo necessario per l'iniziazione organoide dai villi variano a seconda del grado di dedifferenziazione. Quindi, a seconda della specificità della mutazione o dell'insulto che causa la dedifferenziazione, lo stadio ottimale in cui i villi possono essere raccolti per saggiare il loro potenziale organoide-formante, deve essere determinato empiricamente.

Introduzione

Le cripte intestinali ma non i villi, formano organoidi quando coltivate in matrice Matrigel o BME-R1. Questi organoidi sono strutture auto-organizzanti, spesso indicate come il "mini-intestino" a causa della presenza dei vari lignaggi differenziati, progenitori e cellule staminali presenti nell'epitelio intestinale in vivo. Il potenziale di formare organoidi dalle cripte è attribuito alla presenza di cellule staminali¹. I villi intestinali d'altra parte sono costituiti solo da cellule differenziate e quindi non possono formare organoidi. Tuttavia, mutazioni² o condizioni che consentono la dedifferenziazione del....