3D Coltivazione di Organoidi dall'Epitelio Villi Intestinale sottoposti a Dedifferenziazione

Le cripte intestinali ma non i villi, formano organoidi quando coltivate in matrice Matrigel o BME-R1. Questi organoidi sono strutture auto-organizzanti, spesso indicate come il "mini-intestino" a causa della presenza dei vari lignaggi differenziati, progenitori e cellule staminali presenti nell'epitelio intestinale in vivo. Il potenziale di formare organoidi dalle cripte è attribuito alla presenza di cellule staminali¹. I villi intestinali d'altra parte sono costituiti solo da cellule differenziate e quindi non possono formare organoidi. Tuttavia, mutazioni² o condizioni che consentono la dedifferenziazione dell'epitelio villi possono^portarea cellule staminali nei villi 2^,3. Questo cambiamento di destino con conseguente staminalità nell'epitelio villi può essere confermato placcando l'epitelio villi dedifferenziante in matrice 3D per determinare il loro potenziale organoide-formante come indicatore di staminalità de-novo nell'epitelio villus. Quindi, l'aspetto critico di questa procedura è quello di garantire l'assenza di contaminazione della cripta.

La mutazione condizionale Smad4 KO:β-catenina^GOF provoca dedifferenziazione nell'epitelio intestinale caratterizzata dall'espressione di marcatori di proliferazione e cellule staminali nei villi, ed eventualmente la formazione di strutture simili a cripte nei villi denominate cripte ectopiche La presenza di cellule staminali questi villi dedifferenziati è stata determinata dall'espressione di marcatori di cellule staminali nelle cripte ectopiche (in vivo) e dalla capacità dei villi mutanti di formare organoidi wh en placcato Matrigel³. La procedura di seguito indicata elabora la metodologia utilizzata per confermare la staminalitàdell'epitelio intestinale dedifferenziante nei topi mutanti Smad4 KO:β-catenina^GOF. Una caratteristica chiave di questa metodologia per isolare i villi era l'uso del raschiamento del lume intestinale, al contrario del metodo di chelazione EDTA⁴. A differenza del metodo di chelazione EDTA, l'isolamento dei villi mediante raschiatura trattiene la maggior parte del mesenchima sottostante e consente di regolare la pressione di raschiatura per produrre villi senza cripte tethered. La pressione di raschiatura è soggettiva per l'operatore, quindi la pressione ottimale per produrre villi senza cripte tethered deve essere determinata empiricamente dall'operatore. L'aspetto critico di questa procedura è quello di garantire l'assenza di contaminazione da cripta mediante esame microscopico dei villi sia prima che dopo la placcatura nella matrice BME-R1.

I villi intestinali vengono raschiati via dal lume intestinale con vetrini e posti in un filtro da 70 μm e lavati con PBS per eliminare le cellule sciolte o le cripte, se presenti, prima della placcatura in matrice BME-R1. Il metodo sottolinea i seguenti criteri per evitare la contaminazione della cripta: a) confinare i villi raccogliere la metà prossimale del duodeno dove i villi sono più lunghi, b) ridurre al minimo il numero di graffi che producono villi, c) lavare il filtro contenente i villi attraverso una serie di PBS in un piatto a sei pozzetti e d) confermare l'assenza di contaminazione della cripta mediante esame microscopico prima e dopo la placcatura in matrice BME-R1. L'isolamento dei villi mediante raschiatura, piuttosto che per chelazione EDTA, impedisce la completa perdita del mesenchima sottostante che può fornire i segnali di nicchia^5,6,7,8,se necessario, per l'iniziazione organoide dall'epitelio villuso.

Tutti gli esperimenti sui topi condotti, incluso l'uso di Tamoxifene e l'eutanasia per lussazione cervicale, hanno avuto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto Stevens di echnologia.

1. Topi

NOTA: La generazione di Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; I topi Villin-Cre^ERT2 sono stati precedentemente descritti³. Sono stati utilizzati topi femmina adulti di età compresa tra le otto e le dodici settimane.

1. Indurre la mutazione Smad4 KO:β-catenina^GOF nel Smad4^f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Villin-Cre^ERT2 con iniezione intraperitoneale di Tamoxifene in olio di mais per quattro giorni consecutivi.
2. Sacrificare la lussazione cervicale del topo dieci giorni dopo la prima iniezione di tamoxifene.
3. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per evitare che la pelliccia di topo entri nella cavità peritoneale.
4. Aprire la cavità addominale con le forbici di dissezione per esporre l'intestino. Isolare l'intestino con l'aiuto delle forbici e della pinza.
   NOTA: La perdita concomitante di Smad4 insieme alla mutazione gain of function di β-catenina (Smad4^KO;β-catenina^GOF) nell'epitelio intestinale è stata ottenuta iniettando^Smad4f/f; Catnb^lox(ex3)/⁺; Topi Villin-Cre^ERT2 ogni giorno per quattro giorni consecutivi con 0,05 g di Tamoxifene/kg di peso corporeo in olio di mais. Questi topi vengono raccolti dieci giorni dopo la prima iniezione di tamoxifene per garantire la presenza di cellule che esprimono marcatori associati alle cellule staminali nei villi dedifferenzianti.

2. Isolamento e preparazione del duodeno

1. Sezionare la metà prossimale del duodeno.
2. Lavare il duodeno con 5 mL di PBS ghiacciato in una siringa da 10 mL per eliminare il contenuto luminale.
3. Aprire il duodeno longitudinalmente con una forbice angolata e posare il duodeno piatto su una piastra di Petri di 15 cm su ghiaccio con il lume del duodeno rivolto verso l'operatore.

3. Isolamento dei villi mediante raschiatura

1. Prima di iniziare la raschiatura, posizionare un filtro a rete da 70 μm in uno dei pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Riempire tutti i pozzetti con 4 mL di 1x PBS e posizionare la piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti sul ghiaccio (Figura 1).
2. Raschiare i villi come segue usando due microscopici vetrini: uno per tenere il duodeno verso il basso e l'altro per raschiare (Figura 1B1).
   1. Raschiare il lato luminale del duodeno superficialmente avanti e indietro due volte per rimuovere il muco. Applicare una pressione tale che questo passaggio rimuova lo strato di muco, ma non i villi.
   2. Raschiare di nuovo il duodeno, avanti e indietro due volte applicando la stessa pressione di cui al punto 3..1, durante il quale si possono vedere i villi che si raccolgono sulle diapositive (Figura 1B2). Questa è la pressione ottimale (che deve essere determinata empiricamente dall'operatore) per produrre i villi senza le cripte legati.
3. Utilizzare un pipetto di trasferimento da 1 mL contenente PBS per trasferire i villi (che vengono raccolti sul vetrino dal passaggio 3.2.2.) a un filtro a rete da 70 μm posto in un piatto a 6 pozzetto. I villi vengono raccolti così, dopo ogni graffio (Figura 1B2).
4. Lavare i villi raccolti nel filtro da 70 μm (dal punto 3.3) trasferendo il filtro (con i villi) attraverso una serie di pozzelli in un piatto a 6 pozzedi contenente PBS freddo (~ 4 ml/pozzet). Questo per rimuovere le cripte sciolte, se presenti.
5. Utilizzando un pipetto p1000, trasferire la sospensione dei villi in PBS (~ 3 mL) dal filtro da 70 μm a un nuovo tubo da 15 mL su ghiaccio.
6. Utilizzare una punta del pipetto p200 con estremità smussata rivestita BSA allo 0,1% per aspirare un volume di 50 μL della sospensione di villi su un vetrino. Contare il numero di villi nella goccia da 50 μL con ingrandimento 4x per determinare la concentrazione di villi nella sospensione PBS. Ad esempio, se ci sono 10 villi nella sospensione da 50 μL esaminata, la concentrazione di villi è di 0,2 villi/μL. Questo è anche il momento di confermare l'assenza di cripte tethered.
7. Calcolare il volume di sospensione di villi necessario per placcare ad una concentrazione di 0,5 villi/μL di matrice BME-R1. Aggiungere un ulteriore 100 μL per tenere conto dell'errore di pipettaggio e del volume necessario per l'esame microscopico necessario per garantire la purezza dei villi.
   ATTENZIONE: La pressione utilizzata nei primi due graffi, che rimuove il muco ma non i villi, deve essere utilizzata nei graffi successivi durante i quali verranno rilasciati i villi. Limitare il numero di raschiature avanti e indietro a due dopo che il rilascio di villi è stato osservato per la prima volta. Questa misura evita il rilascio di villi con le cripte tethered. È essenziale valutare al microscopio i villi per garantire l'assenza delle cripte tethered.

4. Placcatura di villi su matrice BME-R1

1. Utilizzando una punta di pipetta smussata p200 rivestita BSA allo 0,1%, trasferire in un tubo microcentrifuga il volume di villi (dal passaggio 3.6) richiesto alla piastra ad una densità di ~ 6 villi per pozzetto in 12,5 μL di matrice BME-R1. L'uso della punta smussata rivestita di BSA a questo punto assicura che i villi, che sono troppo grandi per una punta appuntita, vengano aspirati senza essere bloccati o persi dall'essere attaccati ai lati della punta.
2. Girare i villi per 2 minuti a 200 x g in una centrifuga refrigerata (4 °C) e rimuovere il surnatante.
3. Ripetere il passaggio 4.2 per rimuovere eventuali PBS residui e procedere al passaggio successivo sotto una cappa a flusso laminare.
4. Rispenare delicatamente il pellet di villi nella quantità richiesta di BME-R1 freddo scongelato sul ghiaccio.
5. Utilizzando un pipetto p20, piastra 12,5 μL / pozzetto dei villi in matrice BME-R1 in 3D in una piastra a U a 96 pozzetti preriscaldata.
6. Incubare la piastra in un incubatore di colture tissutali a 37 °C per 15 minuti per consentire la solidificazione della matrice BME-R1.
7. Aggiungere 125 μL/pozzetti di mezzi ENR (epidermici di crescita/Noggin/R-spondin1) preriscaldati: mezzi DMEM F-12 avanzati, integrati con 1x Penicillina: Streptomicina, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% mezzi condizionati da cellule HEK293-T che esprimono R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetil cisteina e 0,05 mg/mL Primocin.
8. Incubare i villi placcati in un incubatore di colture tissutali mantenuto a 37 °C con il 5% di CO₂e cambiare il mezzo a giorni alterni.
9. Scartare qualsiasi pozzo in cui gli organoidi compaiono prima di due giorni di placcatura, poiché il primo punto temporale in cui sono attesi gli organoidi derivati dai villi è dopo due giorni.
   NOTA: Tutti i villi che hanno la metà o più della metà della lunghezza dei villi sono conteggiati come un villi. A differenza degli organoidi derivati dalla cripta, gli organoidi derivati dai villi non sono attesi entro 24 ore dalla placcatura. I villi che ingiungono gli organoidi sembrano scurirsi e restringersi prima della formazione di organoidi. Quindi, tutti i pozzetto con organoidi che si sviluppano entro un giorno dalla placcatura dovrebbero essere scartati per evitare la plausibilità di aver derivato da una contaminazione plausibile della cripta. La metodologia utilizzata per produrre i supporti condizionati è disponibile su richiesta.

Il fattore determinante per il successo della procedura è prevenire la contaminazione della cripta. Lo sviluppo organoide dai villi (e non da cripte contaminanti) è assicurato confermando quattro criteri principali: 1) garantire la purezza dei villi raccolti mediante esame microscopico prima e dopo la placcatura dei villi in BME-R1, 2) placcare un numero limitato di villi per pozzo per consentire la visualizzazione di tutti i villi placcati singolarmente, 3) onitoring lo sviluppo degli organoidi quotidianamente; le immagini del corso temporale mostrano lo sviluppo di organoidi da villi (Figura 3), e 4) che onitoring la cinetica e l'aspetto morfologico degli organoidi che presentano ciò che da villi; gli organoidi che iniziano dai villi appaiono inizialmente di forma irregolare e impiegano da due a cinque giorni prima di poter essere visti sotto ingrandimento 4x rispetto agli organoidi derivati dalla cripta (coltivati isolando cripte usando il metodo di chelazione EDTA/PBS1,4) che appaiono durante la notte come strutture sferiche con bordi ben definiti (Figura 2).

Il momento ottimale per sacrificare i topi per testare il potenziale organoide-formante dei villi è dopo che i marcatori di cellule staminali villi-epitelio dedifferenzianti esprimono i marcatori delle cellule staminali e iniziano lo sviluppo di cripte ectopiche nei villi in vivo (circa 10 giorni dopo l'iniezione di Tamoxifene dello Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Topi Villin-CreERT2). Questi topi hanno una cre-ricombiinasi inducibile da tamoxifene che causa la perdita di Smad4 concomitante con l'attivazione di β-catenina con tamoxifene. Le cripte ectopiche si sviluppano completamente entro due settimane dall'induzione della mutazione, mentre le cellule staminali nell'epitelio villus compaiono entro una settimana dall'induzione della mutazione in vivo. Il numero di villi che formano organoidi quando placcati in Matrigel è stato segnalato per variare tra il 2% e il 12%3. La raccolta del topo mutante per la placcatura dei villi nel periodo in cui sono presenti le cellule staminali (circa una settimana dopo l'induzione della cre-ricombinasi) prolungherà il tempo necessario per la comparsa di organoidi derivati dai villi, mentre ritardare la raccolta a più tardi di dieci giorni dopo la cre-induzione aumenta il rischio di cripta di contaminazione.

Figura 1: Set-up sperimentale e raschiatura dei villi dall'epitelio intestinale. A) Siringa riempita di PBS (syrg) con tubi e filtro (Fltr) in PBS. B)Isolamento dei villi mediante raschiatura (B1) e trasferimento ad un filtro (B2). La freccia indica i villi raccolti sulla diapositiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Distinzione nell'aspetto degli organoidi che emergono dalle cripte rispetto all'epitelio villi dedifferenziato dello stesso intestino di topo: A) Cartone animato che mostra villi e cripte. B)Montaggio intero (in PBS) di villi preparati per raschiatura (pannello superiore) e cripte preparate mediante chelazione EDTA (pannello inferiore). C)Organoidi derivati da Villi (pannello superiore) e da cripta (pannello inferiore) dallo stesso epitelio intestinale di topo in BME-R1 (barre di scala, 500 um). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Decorso temporale della formazione organoide dai villi dedifferenzianti. Viene mostrata l'iniziazione organoide da due diversi villi (le regioni in scatola sono ingrandite nei pannelli centrale e inferiore). I villi con potenziale organoide-formante appaiono densi, probabilmente a causa della ritenzione del mesenchima sottostante. L'iniziazione organoide dai villi è evidente al secondo giorno (freccia solida) da uno dei villi (scatola con confine spezzato), mentre negli altri villi (scatola con contorno solido) l'organoide appare al quarto giorno (freccia). La scatola superiore nel pannello del giorno 6 mostra un organoide derivato dai villi sviluppato. Barra della scala, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.