Articolo metodologico

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

DOI:

10.3791/61812

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25 ottobre 2021

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1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

In questo articolo

Sommario

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Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.

Abstract

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Gli epatociti primari sono ampiamente utilizzati nella ricerca in vitro sul fegato, specialmente negli studi sul metabolismo del glucosio. Una tecnica di base è stata adattata in base a diverse esigenze, come tempo, manodopera, costi e utilizzo di epatociti primari, con conseguente vari protocolli di isolamento degli epatociti primari. Tuttavia, i numerosi passaggi e le lunghe preparazioni di reagenti nell'isolamento degli epatociti primari sono i principali svantaggi per l'efficienza. Dopo aver confrontato diversi protocolli per i loro pro e contro, i vantaggi di ciascuno sono stati combinati ed è stato formulato un protocollo di isolamento degli epatociti primari rapido ed efficiente. Entro soli ~ 35 minuti, questo protocollo potrebbe produrre tanto, se non di più, epatociti primari sani come altri protocolli. Inoltre, gli esperimenti sul metabolismo del glucosio eseguiti utilizzando gli epatociti primari isolati hanno convalidato l'utilità di questo protocollo negli studi in vitro sul metabolismo epatico. Abbiamo anche ampiamente esaminato e analizzato il significato e lo scopo di ogni fase di questo studio in modo che i futuri ricercatori possano ottimizzare ulteriormente questo protocollo in base alle esigenze.

Introduzione

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Il fegato funge da uno degli organi più importanti nel corpo dei vertebrati a causa del ruolo vitale che svolge in numerose funzioni di supporto vitale come la digestione del cibo, la circolazione sanguigna e la disintossicazione. L'uso di epatociti primari di topo in coltura in vitro è sempre più popolare negli studi sul metabolismo dei carboidrati e sul carcinoma epatico. Pertanto, è importante sviluppare un metodo conveniente per l'isolamento degli epatociti primari del topo mantenendo la sua funzione fisiologica innata. Grazie alla sua funzione di hub del metabolismo del glucosio, il fegato è anche centrale per la produzione e lo stoccaggio del glucosio

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 topi femmina (8 settimane) sono stati utilizzati in questo studio.

1. Preparazione:

  1. Mescolare William's E Medium (GlutaMAX Supplement) con 10% FBS e 1% di soluzione antibiotico-antimicotica per rendere il terreno di coltura.
  2. Filtrare 25 mL di collagenasi-dispasi (ad es. Liver Digest Medium) attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm per rimuovere i detriti particellari.
  3. Riscaldare 50 mL di H2O a doppio distillato (ddH2O), 35 mL di mezzo di perfusione (ad esempio, mezzo di perfus....

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Risultati

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Al fine di testare l'efficienza, l'attuale protocollo di isolamento degli epatociti primari è stato eseguito su topi C57BL/6 di 8 settimane. Sono stati testati l'attaccamento e la purezza degli epatociti primari isolati. L'isolamento primario degli epatociti viene utilizzato per un'ampia varietà di esperimenti sulla fisiologia epatica, come gli effetti dei farmaci epatici e il metabolismo del glucosio, l'attività dei biomarcatori farmaceutici2, la sensibilità all'insulina e la produzione di glucos.......

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Discussione

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Sono stati sviluppati vari protocolli primari di isolamento degli epatociti. Inoltre sono stati mantenuti ottimizzati e adattati in base alle diverse esigenze (Tabella 1). I protocolli di isolamento sono generalmente composti da due parti: perfusione (compresa la digestione enzimatica) e purificazione.

La perfusione può essere eseguita con l'intero fegato in vivo 2,20,21,22,23 o con lobi epatici sezionati

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant 5R01HD095512-02 a S.W.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
Piastra a 12 pozzettiFALCON353043Rivestimento non richiesto
Piastra a 6 pozzettiFALCON353046Rivestimento non richiesto
anti-AKTCell Signaling2920S
Soluzione antibiotica antimicotica (100x), stabilizzataSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Cell Signaling97635S
anti-GAPDHCell Signaling2118S
anti-p-AKT (S473)Cell Signaling9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Cell Signaling84192S
Cell Strainer, 70 µ mCELLTREAT229483
Catetere IV chiuso, 24 gauge 0,75 INBecton Dickinson383511
DMEM, senza glucosio, senza glutammina, senza rosso fenoloThermoFisher ScientificA1443001
Kit per il dosaggio del glucosio EnzyChrom Sistemidi analisi BioAssayEBGL-100
Siero fetale bovino (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagoneSigma-AldrichG2044
Capra Anti-topo IgG Anticorpo secondarioLI-COR926-68070
Capra Anti-coniglio IgG Anticorpo secondarioLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
IBMXSegnalazione cellulare13630S
InsulinaLillyNDC 0002-8215-01
Ketamina HCL (100 mg/mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutamminaGibco25030081
Digerisci il fegato MediumGibco17703-034Aliquotare all'interno della cappa di coltura tissutale a 25 mL ciascuno in provetta da 50 mL e mantenere in -20 ° C
congelatore Perfusione epatica MediaGibco17701-038
Penna StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Pompa peristalticaGilsonMinipuls 2In grado di pompare a 4 mL/min
Piastra di PetriFisherbrand08-757-12
CentrifugarefrigerataSorvallLegend RTIn grado di centrifugare provette da 50 mL a 4 gradi C
L-lattato di sodioSigma-AldrichL7022
Piruvato di sodioGibco11360070
filtro per siringa, PVDF 0,45 e micro; m SiringaCELLTREAT229745
da 329461Becton Dickinsonda 0,5 mL
Becton Dickinson309653da 60 mL
Gibco152500610,4%,
da 430052Corningda 15 mL
Corning43029050 mL
Vasca da bagnoCorningCLS6783O qualsiasi serbatoio a bagnomaria in grado di riscaldare fino a 45 gradi C
William' s E Medium (GlutaMAX Supplement)Gibco32551020
Xilozina (100 mg/mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10
da 30 mm di diametro, siringa , soluzione Trypan Blue, provetta provetta , acqua da

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).
  2. Severgnini, M., et al.

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