Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Summary

Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.

Abstract

Gli epatociti primari sono ampiamente utilizzati nella ricerca in vitro sul fegato, specialmente negli studi sul metabolismo del glucosio. Una tecnica di base è stata adattata in base a diverse esigenze, come tempo, manodopera, costi e utilizzo di epatociti primari, con conseguente vari protocolli di isolamento degli epatociti primari. Tuttavia, i numerosi passaggi e le lunghe preparazioni di reagenti nell'isolamento degli epatociti primari sono i principali svantaggi per l'efficienza. Dopo aver confrontato diversi protocolli per i loro pro e contro, i vantaggi di ciascuno sono stati combinati ed è stato formulato un protocollo di isolamento degli epatociti primari rapido ed efficiente. Entro soli ~ 35 minuti, questo protocollo potrebbe produrre tanto, se non di più, epatociti primari sani come altri protocolli. Inoltre, gli esperimenti sul metabolismo del glucosio eseguiti utilizzando gli epatociti primari isolati hanno convalidato l'utilità di questo protocollo negli studi in vitro sul metabolismo epatico. Abbiamo anche ampiamente esaminato e analizzato il significato e lo scopo di ogni fase di questo studio in modo che i futuri ricercatori possano ottimizzare ulteriormente questo protocollo in base alle esigenze.

Introduction

Il fegato funge da uno degli organi più importanti nel corpo dei vertebrati a causa del ruolo vitale che svolge in numerose funzioni di supporto vitale come la digestione del cibo, la circolazione sanguigna e la disintossicazione. L'uso di epatociti primari di topo in coltura in vitro è sempre più popolare negli studi sul metabolismo dei carboidrati e sul carcinoma epatico. Pertanto, è importante sviluppare un metodo conveniente per l'isolamento degli epatociti primari del topo mantenendo la sua funzione fisiologica innata. Grazie alla sua funzione di hub del metabolismo del glucosio, il fegato è anche centrale per la produzione e lo stoccaggio del glucosio

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 topi femmina (8 settimane) sono stati utilizzati in questo studio.

1. Preparazione:

1. Mescolare William's E Medium (GlutaMAX Supplement) con 10% FBS e 1% di soluzione antibiotico-antimicotica per rendere il terreno di coltura.
2. Filtrare 25 mL di collagenasi-dispasi (ad es. Liver Digest Medium) attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm per rimuovere i detriti particellari.
3. Riscaldare 50 mL di H₂O a doppio distillato (ddH₂O), 35 mL di mezzo di perfusione (ad esempio, mezzo di perfus....

Results

Al fine di testare l'efficienza, l'attuale protocollo di isolamento degli epatociti primari è stato eseguito su topi C57BL/6 di 8 settimane. Sono stati testati l'attaccamento e la purezza degli epatociti primari isolati. L'isolamento primario degli epatociti viene utilizzato per un'ampia varietà di esperimenti sulla fisiologia epatica, come gli effetti dei farmaci epatici e il metabolismo del glucosio, l'attività dei biomarcatori farmaceutici², la sensibilità all'insulina e la produzione di glucos.......

Discussion

Sono stati sviluppati vari protocolli primari di isolamento degli epatociti. Inoltre sono stati mantenuti ottimizzati e adattati in base alle diverse esigenze (Tabella 1). I protocolli di isolamento sono generalmente composti da due parti: perfusione (compresa la digestione enzimatica) e purificazione.

La perfusione può essere eseguita con l'intero fegato in vivo 2,20,21,22,23 o con lobi epatici sezionati

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
Piastra a 12 pozzetti	FALCON	353043	Rivestimento non richiesto
Piastra a 6 pozzetti	FALCON	353046	Rivestimento non richiesto
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Soluzione antibiotica antimicotica (100x), stabilizzata	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µ m	CELLTREAT	229483
Catetere IV chiuso, 24 gauge 0,75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, senza glucosio, senza glutammina, senza rosso fenolo	ThermoFisher Scientific	A1443001
Kit per il dosaggio del glucosio EnzyChrom Sistemi	di analisi BioAssay	EBGL-100
Siero fetale bovino (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagone	Sigma-Aldrich	G2044
Capra Anti-topo IgG Anticorpo secondario	LI-COR	926-68070
Capra Anti-coniglio IgG Anticorpo secondario	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Segnalazione cellulare	13630S
Insulina	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamina HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutammina	Gibco	25030081
Digerisci il fegato Medium	Gibco	17703-034	Aliquotare all'interno della cappa di coltura tissutale a 25 mL ciascuno in provetta da 50 mL e mantenere in -20 ° C
congelatore Perfusione epatica Media	Gibco	17701-038
Penna Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Pompa peristaltica	Gilson	Minipuls 2	In grado di pompare a 4 mL/min
Piastra di Petri	Fisherbrand	08-757-12
Centrifuga	refrigerataSorvall	Legend RT	In grado di centrifugare provette da 50 mL a 4 gradi C
L-lattato di sodio	Sigma-Aldrich	L7022
Piruvato di sodio	Gibco	11360070
filtro per siringa, PVDF 0,45 e micro; m Siringa	CELLTREAT	229745
da 329461		Becton Dickinson	da 0,5 mL
Becton Dickinson	309653		da 60 mL
Gibco	15250061		0,4%,
da 430052		Corning	da 15 mL
Corning	430290		50 mL
Vasca da bagno	Corning	CLS6783	O qualsiasi serbatoio a bagnomaria in grado di riscaldare fino a 45 gradi C
William' s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xilozina (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10