Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi

Summary

Questo articolo si propone di presentare un protocollo su come costruire un microscopio per spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Abstract

I processi biologici dinamici nelle cellule viventi, compresi quelli associati all'organizzazione della membrana plasmatica, si verificano su varie scale spaziali e temporali, che vanno rispettivamente dai nanometri ai micrometri e dai microsecondi ai minuti. Una gamma così ampia di processi biologici sfida gli approcci convenzionali alla microscopia. Qui, descriviamo in dettaglio la procedura per l'implementazione di misurazioni di spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) utilizzando un microscopio a fluorescenza classico che è stato personalizzato. Il protocollo include uno specifico controllo delle prestazioni del setup svFCS e le linee guida per le misure di diffusione molecolare da parte di svFCS sulla membrana plasmatica di cellule viventi in condizioni fisiologiche. Inoltre, forniamo una procedura per interrompere i nanodomini della zattera della membrana plasmatica mediante il trattamento della colesterolo ossidasi e dimostriamo come questi cambiamenti nell'organizzazione laterale della membrana plasmatica potrebbero essere rivelati dall'analisi svFCS. In conclusione, questo metodo basato sulla fluorescenza può fornire dettagli senza precedenti sull'organizzazione laterale della membrana plasmatica con l'appropriata risoluzione spaziale e temporale.

Introduction

La complessità dell'organizzazione della membrana plasmatica
L'attuale comprensione dell'organizzazione della membrana cellulare deve tenere conto di diversi aspetti¹. In primo luogo, una composizione lipidica complessa varia non solo tra i tipi di cellule, ma anche all'interno di una singola cellula (organelli di membrana / membrana plasmatica). Inoltre, le proteine di membrana associate o intrinseche sono per lo più organizzate in complessi multimerici dinamici, con grandi domini che si estendono al di fuori della membrana, rappresentando un'area significativamente più ampia di quella dei soli domini transmembrana. Inoltre, le proteine associate alla membrana mostrano specifiche capacità di legame lipidico o di interazione lipidica che svolgono un ruolo nella regolazione della funzione proteica. Questi dipendono direttamente dalla composizione locale e dall'accessibilità dei lipidi².

Infine, si osserva un livello significativo di asimmetria tra due foglietti di membrana a causa della struttura asimmetrica intrinseca delle proteine di membrana e della distribuzione dei lipidi. Infatti, un equilibrio metabolico lipidico tra sintesi e idrolisi, combinato con flip-flop lipidico tra i foglietti, genera tale distribuzione asimmetrica. Poiché qualsiasi trasporto attraverso il doppio strato è limitato dall'energia libera necessaria per spostare il gruppo di testa polare attraverso l'interno idrofobo delle membrane, di solito è assistito da trasportatori selettivi. Per ogni tipo di cellula, l'asimmetria tende ad essere mantenuta saldamente. Complessivamente, questi fattori contribuiscono alla disomogeneità laterale o alla compartimentazione della membrana^{plasmatica 3,4}.

Arricchiamo questa rappresentazione della membrana plasmatica tenendo conto della diffusione molecolare intrinseca all'interno e attraverso il doppio strato, che contribuisce all'eterogeneità laterale dinamica su una scala da decimi a centinaia di nanometri e microsecondi a secondi. Ad esempio, i nanodomini di membrana lipidici-dipendenti – le cosiddette zattere lipidiche, definite come colesterolo, e le piattaforme di segnalazione ricche di sfingolipidi – contribuiscono alla compartimentazione della membrana^{plasmatica 5,6}. Tuttavia, l'attuale visione dell'organizzazione della membrana non è limitata alle sole zattere lipidiche. I nanodomini di membrana sono più complessi ed eterogenei per composizione, origine e funzione. Tuttavia, la loro presenza sulla membrana plasmatica deve essere strettamente coordinata e le interazioni dinamiche tra proteine e lipidi sembrano essere importanti nella distribuzione spaziale e nella modifica chimica dei nanodomini di membrana 1,3,7,8.

Il principio svFCS e la sua applicazione per sondare l'organizzazione della membrana plasmatica
Sebbene siano stati fatti molti progressi nell'analisi dei domini di membrana, principalmente attraverso tecniche biofisiche, i determinanti che dettano l'organizzazione locale della membrana plasmatica devono essere raffinati con un'appropriata risoluzione spaziale e temporale. I determinanti basati sul tracciamento di singole molecole forniscono un'eccellente precisione spaziale e consentono la caratterizzazione di diverse modalità di movimento 9,10,11,12, ma hanno una risoluzione temporale limitata con i classici frame rate bassi della telecamera e richiedono uno sforzo più sperimentale per registrare un numero significativo di traiettorie. In alternativa, il coefficiente di diffusione dei componenti della membrana può essere valutato mediante Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)¹³ o Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)¹⁴. Quest'ultimo ha ricevuto maggiore attenzione, principalmente a causa della sua elevata sensibilità e selettività, volume di rilevamento microscopico, bassa invasività e ampia gamma dinamica¹⁵.

La base concettuale di FCS è stata introdotta da Magde e colleghi circa 50 anni fa^16,17. Si basa sulla registrazione della fluttuazione dell'emissione di fluorescenza con un'alta risoluzione temporale (da μs a s)¹⁸. Nella sua versione moderna, le misurazioni nelle cellule viventi sono eseguite da un piccolo volume di eccitazione confocale (~ 0,3 femtolitri) posizionato all'interno di una regione di interesse (ad esempio, alla membrana plasmatica); il segnale di fluorescenza generato dalla diffusione di molecole fluorescenti che entrano ed escono dal volume di osservazione viene raccolto con una risoluzione temporale molto elevata (cioè il tempo di arrivo di ciascun fotone sul rivelatore). Quindi, il segnale viene calcolato per generare la funzione di autocorrelazione (ACF), da cui viene estratto il tempo medio t_d (tempo di diffusione) per il quale una molecola rimane all'interno del volume focale, insieme al numero medio di particelle, (N), presenti nel volume di osservazione, che è inversamente proporzionale all'ampiezza dell'ACF. Quest'ultimo parametro potrebbe essere un'informazione utile sulla concentrazione della molecola all'interno del volume di osservazione.

Da allora, un numero crescente di modalità FCS è stato implementato grazie al rapido sviluppo della strumentazione in biofotonica, che consente la descrizione dei fenomeni dinamici che si verificano nei sistemi viventi. Tuttavia, una specie molecolare sperimenterebbe una distribuzione più sovrapposta dei valori del coefficiente di diffusione, che di solito si riflette in una caratteristica di diffusione anomala, in cui le molecole si diffondono con una relazione non lineare nel tempo¹⁹, e difficoltà nell'identificare il significato biologico di questa sottodiffusione anomala. In passato, questa difficoltà è stata in qualche modo superata registrando la diffusione molecolare da parte di FRAP da aree di varie dimensioni, piuttosto che da una sola area, fornendo così ulteriori informazioni spaziali. Ciò ha permesso, ad esempio, la concettualizzazione dei microdomini di membrana 20,21,22.

Una traduzione di questa strategia in misure FCS (cioè la cosiddetta spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS)) è stata stabilita variando la dimensione del volume focale di osservazione, consentendo di registrare la fluttuazione della fluorescenza su diverse scale spaziali²³. Pertanto, l'approccio svFCS fornisce informazioni spaziali indirette che consentono l'identificazione e la determinazione delle modalità di diffusione molecolare e del tipo di partizionamento della membrana (domini isolati rispetto a domini contigui²⁴) delle molecole studiate. Tracciando il tempo di diffusione t_d in funzione delle varie scale spaziali definite dal valore di vita (ω), che corrisponde alla dimensione del raggio del fascio di rilevazione in questo caso^23,25, si può caratterizzare la legge di diffusione di una data molecola in una data condizione fisiologica. L'svFCS è, quindi, un perfetto analogo al tracciamento a singola particella nel dominio del tempo²⁶. Sotto il vincolo di diffusione browniana, ci si dovrebbe aspettare una relazione strettamente lineare tra il tempo di diffusione t_d e la vita ω (Figura 1)^23,25. L'origine della deviazione della legge di diffusione da questo schema può essere attribuita a ragioni non esclusive, come la rete citoscheletrica, l'affollamento molecolare, il partizionamento dinamico nei nanodomini o qualsiasi combinazione di questi e altri effetti (Figura 1), e deve essere testata sperimentalmente²⁵.

Qui forniamo tutti i checkpoint di controllo necessari per l'uso quotidiano di un sistema ottico svFCS su misura costruito da zero, che integra le nostre precedenti revisioni del protocollo^27,28 su quell'approccio sperimentale. Inoltre, come prova di concetto, forniamo linee guida riguardanti la calibrazione della configurazione, la preparazione delle cellule, l'acquisizione dei dati e l'analisi per l'istituzione della legge di diffusione svFCS (DL) per Thy1-GFP, una proteina ancorata al glicosilfosfatidilinositolo della membrana plasmatica, che è nota per essere localizzata nei nanodomini della zattera lipidica²⁹. Infine, dimostriamo come la parziale destabilizzazione dei nanodomini lipidici da parte del trattamento con colesterolo ossidasi influisca sulle proprietà di diffusione di Thy1-GFP. Inoltre, una descrizione dettagliata della costruzione di una configurazione svFCS da zero è fornita in Materiale supplementare.

Protocol

1. Impostazione delle specifiche per l'assemblaggio di una configurazione svFCS personalizzata

NOTA: la semplicità della configurazione svFCS proposta consente una facile installazione, funzionamento e manutenzione a basso costo, garantendo al contempo l'efficienza nel recupero dei fotoni. Per maggiori dettagli, vedere Materiale supplementare.

1. Sala sperimentale e sicurezza
   1. Installare il sistema in una stanza stabilizzata a circa 21 °C.
   2. Evitare il flusso d'aria diretto sul tavolo ottico passivo (o attivo) e seguire le regole di sicurezza laser per l'allineamento ottico.
2. Hardware e software
   NOTA: il materiale supplementare descrive in dettaglio le fasi di installazione illustrate nella Figura 2.
   1. Scrivi il software di acquisizione e controllo principale in LabVIEW utilizzando una macchina a stati e un'architettura della struttura degli eventi in cui una scheda di acquisizione multifunzione guida la maggior parte dei controller.
      NOTA: il correlatore, il laser e il misuratore di potenza sono controllati o monitorati dal proprio software.
   2. Adattare le procedure di installazione hardware e software in base all'hardware utilizzato.
3. Configurazione ottica
   NOTA: la Figura 3 illustra i moduli da banco ottici utilizzati nelle sezioni seguenti per controllare la qualità degli allineamenti ottici. Tutte le specifiche degli elementi ottici sono elencate nella Tabella dei materiali. La procedura per costruire l'installazione è ampiamente dettagliata in Materiale supplementare. Questo sistema comprende un laser a onda continua, un microscopio invertito motorizzato dotato di un obiettivo ad acqua ad immersione, un rilevatore di fotodiodi a valanga accoppiato a un singolo modulo di conteggio dei fotoni e un correlatore hardware. Una camera di incubazione al microscopio con riscaldatori privi di vibrazioni è stata appositamente progettata per controllare la temperatura per esperimenti su cellule viventi. Per convenzione, l'asse XY corrisponde al piano perpendicolare del percorso ottico e l'asse Z corrisponde al percorso ottico.

2. Checkpoint giornaliero prima di eseguire l'esperimento

1. Controllare il percorso di eccitazione (Figura 3, & ).
   1. Aprire tutti i diaframmi dell'iride.
   2. Misurare la potenza del laser con il misuratore di potenza, mantenendo il primo diaframma completamente aperto.
   3. Ruotare la piastra a mezza onda (HWP) per trovare la potenza massima.
   4. Controllare l'allineamento utilizzando i iris se la potenza del laser è inferiore al solito e spostare L1 e M1 alternativamente, se necessario.
   5. Prendere nota del valore di potenza nel blocco appunti del laboratorio dell'esperimento.
2. Controllare il percorso di rilevamento (Figura 3, & ).
   1. Posizionare l'acqua, un coperchio e una goccia di una soluzione di rodamina 6G (Rh6G) da 2 nM sull'obiettivo.
   2. Se il segnale di fluorescenza (numero di conteggio sull'APD, registrato con il software LabVIEW) è inferiore al solito, rifare la soluzione Rh6G, controllare il posizionamento e il numero di coverslip sull'obiettivo o eliminare le bolle, se presenti.
      1. Se il segnale di fluorescenza è ancora inferiore al solito, posizionare il misuratore di potenza all'interno del percorso ottico per bloccare il fascio.
      2. Spegnere l'APD (di seguito, APD si riferisce all'APD e al modulo di conteggio dei singoli fotoni).
      3. Rimuovere il campione.
      4. Pulire e sostituire l'obiettivo con un bersaglio riflettente.
      5. Controllare il raggio laser sul bersaglio riflettente rimuovendo il misuratore di potenza dal percorso della luce. Assicurarsi che il raggio del bersaglio sia centrato e che la riflessione posteriore raggiunga il primo iride sulla linea (Figura 3).
      6. In caso contrario, regolare il posizionamento centrale con M2 o il riflesso posteriore con lo specchio dicroico.
      7. Se l'accoppiamento al microscopio è corretto, spingere indietro la lente dell'obiettivo, aggiungere una goccia d'acqua, un coperchio e una goccia di una soluzione Rh6G più concentrata (cioè 200 nM) e impostare una potenza laser inferiore rispetto alle misurazioni classiche (pochi μW).
      8. Accendere l'APD e ottimizzare l'allineamento APD e stenopeico, alternativamente, con le rispettive viti di regolazione XYZ durante il monitoraggio del segnale di intensità (software LabVIEW).
      9. Cambiare il coverslip e aggiungere una concentrazione inferiore di Rh6G (2 nM). Sposta il foro stenopeico lungo l'asse Z per trovare una posizione in cui il rapporto di luminosità molecolare aumenta e la vita è minima.
      10. Chiudere il diaframma fino a quando il segnale non scende: la dimensione del raggio laser raggiunge la dimensione dell'apertura posteriore dell'obiettivo (cioè la dimensione minima della vita, vedi Materiale supplementare).
      11. Avviare il software correlatore e registrare i dati (vedere la sezione 7 per la registrazione dei dati).
      12. Controllare l'ACF, che dovrebbe mostrare una bassa quantità di rumore, dare una piccola dimensione della vita e un alto tasso di conteggio per molecola al secondo (vedere la sezione 7 per l'analisi dei dati e la valutazione del girovita).

3. Considerazioni generali per la registrazione e l'analisi dei dati svFCS

1. Registrare e analizzare i dati di fluorescenza seguendo questo schema generale (vedere le sezioni 7, 8 e 9): (1) registrazione della fluorescenza e generazione ACF (software correlatore), (2) scarto imprevisto dei dati, una media dei dati conservati, adattamento al modello appropriato (con software Igor Pro fatto in casa), (3) grafico della legge di diffusione (software MATLAB fatto in casa 1) e (4) confronto opzionale della legge di diffusione (software MATLAB fatto in casa 2). I diversi programmi software sono disponibili su richiesta.
   NOTA: il correlatore hardware ha un tempo di campionamento minimo di 12,5 ns (ovvero una frequenza di campionamento di 80 MHz). Fornisce una risoluzione temporale che è almeno 1.000 inferiore al tipico tempo di residenza di libera diffusione di piccole molecole in soluzione e 10⁶ inferiore al tempo di diffusione delle proteine di membrana all'interno di un volume di osservazione confocale.

4. Coltura cellulare e trasfezione

1. Semina le cellule Cos7 in vetro di copertura a 8 pozzetti con fondo di vetro borosilicato #1.0 ad una densità di 10.000 cellule / pozzo usando il Modified Eagle Medium (DMEM) completo di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 5%, penicillina (100 U / mL), streptomicina (100 U / mL) e L-glutammina (1 mM).
2. Coltivare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per 24 ore.
3. Rimuovere il terreno, aggiungere 300 μL del terreno di coltura fresco completo per pozzetto e preincubare le cellule per 30 minuti a 37 °C.
4. Diluire 0,5 μg del DNA plasmidico che codifica per la proteina Thy-1 fuso con eGFP²⁵ in 50 μL di DMEM senza siero. Vortice brevemente da mescolare.
5. Diluire 1,5 μL del reagente di trasfezione del DNA in 50 μL di DMEM privo di siero e mescolare bene la soluzione.
6. Aggiungere il reagente di trasfezione diluito direttamente nella soluzione di DNA preparata e mescolare immediatamente i composti.
7. Incubare la miscela preparata per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
8. Aggiungere 10 μL dei complessi combinati DNA/reagente di trasfezione a goccia sul mezzo in ciascun pozzetto e omogeneizzare ruotando delicatamente la piastra.
9. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ per 3 ore.
10. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo contenente i complessi di reagenti DNA/trasfezione con 400 μL di DMEM fresco completo e coltivare le cellule per 16 ore prima dell'esperimento svFCS.

5. Preparazione delle celle per le misurazioni svFCS

1. Rimuovere il supporto della lingua.
2. Lavare delicatamente le cellule due o tre volte con tampone di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank privo di siero contenente Ca²⁺ e Mg²⁺ integrato con 10 mM (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES).
3. Mantenere le celle nel buffer HBSS/HEPES durante tutte le acquisizioni svFCS.

6. Trattamento farmacologico

1. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due o tre volte con HBSS senza siero integrato con 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES).
2. Incubare le cellule con 1 U/mL di soluzione di colesterolo ossidasi (COasi) in tampone HBSS/HEPES per 1 ora a 37 °C.
3. Rimuovere la soluzione e mantenere le celle in presenza di 0,1 U/mL di COasi nel buffer HBSS/HEPES durante l'esecuzione delle misurazioni svFCS.

7. Calibrazione delle dimensioni dello spot

1. Preriscaldare la camera del microscopio a 37 °C.
2. Preparare una soluzione standard da 2 nM di Rh6G mediante diluizione seriale.
3. Far cadere 200 μL di soluzione Rh6G da 2 nM su un coperchio di vetro posto sull'obiettivo di immersione in acqua.
4. Avviare tutto l'hardware e il software.
5. Misurare e regolare la potenza del raggio laser di 488 nm a 300 μW. A seconda della luminosità e della fotostabilità della sonda fluorescente utilizzata, adattare questa potenza in base a (1) l'intensità di fluorescenza (sul software LabVIEW), che dovrebbe essere stabile, (2) la forma ACF (sul software correlatore), che dovrebbe avere una forma costante nel tempo, e (3) i parametri di adattamento che danno una piccola dimensione della vita e un alto tasso di conteggio per molecola (fotoni per molecola al secondo, in genere da poche decine a centinaia di fotoni per molecola al secondo).
   NOTA: L'ampiezza dell'ACF (chiamata G(0)) è inversamente proporzionale al numero della molecola (cioè alla concentrazione della sonda fluorescente). Per la calibrazione del girovita, questo è un buon parametro candidato per il controllo di qualità. Pertanto, G(0) dovrebbe essere simile per la stessa concentrazione di giorno in giorno in quanto collega il girovita e la concentrazione. Per le misurazioni delle celle, poiché FCS è più accurato per la bassa concentrazione, G(0) dovrebbe essere alto per la corretta estrazione del parametro.
6. Impostare la porta del microscopio di illuminazione/rilevamento svFCS con il software LabVIEW.
7. Accendere l'APD.
8. Chiudi l'iride fino a quando il segnale scende verso il basso per ottenere la dimensione minima della vita o chiudila per una dimensione della vita più grande.
9. Registrare diversi ACF di durata selezionata (vale a dire una corsa) per migliorare la riproducibilità statistica, in genere 10 cicli della durata di 20 s ciascuno con il software del correlatore.
10. Spegnere l'APD.
11. Utilizzare il software Igor Pro per controllare e scartare le corse con forti fluttuazioni dovute agli aggregati molecolari. Esegui questo passaggio manualmente: dovrebbe essere indipendente dall'utente dopo che gli utenti sono stati addestrati.
12. Adatta la media degli ACF conservati con un modello di diffusione 3D.
13. Estrarre dai parametri di fitting il tempo medio di diffusione e salvarlo in un file ".txt" (il formato del file è dettato dal software Igor Pro).
14. Controllare il count-rate per molecola al secondo (un buon indicatore di performance) dividendo l'intensità media (estratta dalla traccia di fluorescenza) per il numero di molecole (estratte dall'ACF).
    NOTA: assicurarsi che questo valore sia alto e stabile di giorno in giorno per gli stessi parametri di acquisizione.
15. Conoscendo il coefficiente di diffusione di Rh6G in soluzione acquosa a 37 °C (D) e (vedi 7.13), calcolare il girovita sperimentale ω in base a: .
16. Applicare la procedura per ogni modifica del girovita necessaria per tracciare la legge di diffusione FCS e prima di qualsiasi nuova serie sperimentale di acquisizione dati svFCS.

8. Acquisizioni di dati svFCS su celle

1. Misurare e regolare la potenza del fascio di 488 nm tra 2 e 4 μW. A seconda della luminosità e della fotostabilità della sonda fluorescente utilizzata, adattare questa potenza per consentire un elevato tasso di conteggio per molecola (in genere diverse migliaia di fotoni per molecola al secondo), mantenendo basso il fotosbiancamento (cioè una traccia di intensità stabile sul software LabVIEW).
2. Equilibrare i campioni per 10 minuti a 37 °C prima di iniziare le misurazioni.
3. Impostare il microscopio con illuminazione a epifluorescenza con il software LabVIEW.
4. Scegliere una cella con una posizione appropriata della sonda fluorescente e un'intensità del segnale di fluorescenza (bassa).
   NOTA: minore è la fluorescenza, migliori sono le misurazioni FCS (vedere il passaggio 8.1).
5. Impostare la porta del microscopio di illuminazione/rilevamento svFCS con il software LabVIEW.
6. Accendere l'APD.
7. Eseguire una scansione xy della cella selezionata con il software LabVIEW.
8. Eseguire una z-scan e localizzare il punto confocale alla massima intensità di fluorescenza scegliendo la membrana plasmatica nella parte superiore e avviare l'acquisizione dei dati. Per massimizzare la separazione tra le due membrane, eseguire preferibilmente la scansione nell'area nucleare della cellula.
9. Registra una serie di 20 tirature della durata di 5 s, ciascuna con il software correlatore.
   NOTA: assicurarsi che la durata di ogni esecuzione sia sufficientemente lunga da ottenere ACF con rumore ridotto. Le acquisizioni lunghe sono suscettibili di fotosbiancamento o variazioni sostanziali impreviste (ad esempio, aggregati). Adattare il numero di esecuzioni, la loro durata e il numero di serie ai campioni, ma assicurarsi che rimangano costanti all'interno della stessa mole di esperimenti per la riproducibilità.
10. Spegnere l'APD.
11. Scartare le esecuzioni impreviste con il software Igor Pro.
12. Adatta l'ACF medio con un modello di diffusione 2D di 2 specie. Adattare questo modello al tipo di comportamento di diffusione della molecola bersaglio.
13. Salvate i parametri di raccordo nel file precedente (vedere il passaggio 7.13).
14. Eseguire da 10 a 15 serie di registrazioni su almeno 10 celle diverse e riprodurre i passaggi da 8.3 a 8.13. Verificare che il singolo file ottenuto contenga le informazioni sul girovita e i parametri di adattamento delle 10-15 registrazioni.
15. Per stabilire una singola legge di diffusione, analizzare almeno quattro taglie di vita variabili tra 200 e 400 nm. Questo intervallo è definito dal limite ottico di diffrazione, ma dipende dall'obiettivo (apertura numerica) e dal laser (lunghezza d'onda).
    NOTA: Poiché la calibrazione del girovita non è assoluta e presenta un certo grado di incertezza, è stato costruito un software MATLAB²⁸ dedicato che tiene conto dell'errore x e y (vale a dire ω² e t_d) per adattarsi alla legge di diffusione.
16. Avvia il software MATLAB 1 e seleziona una cartella contenente tutti i file ".txt" corrispondenti ad almeno quattro esperimenti di dimensioni della vita.
17. Plot <t_d> versus <ω²>, cioè la legge di diffusione. Si possono estrarre due parametri principali: l'intercetta dell'asse y (t₀) e il coefficiente di diffusione effettivo (D_eff, inversamente proporzionale alla pendenza).

9. Leggi di diffusione di diverse condizioni sperimentali di confronto

NOTA: Se necessario, riprodurre le sezioni 7 e 8 per diverse condizioni sperimentali. È stato sviluppato un software dedicato (software MATLAB 2) per determinare se queste leggi di diffusione sono simili o meno secondo _{i valori} t₀ eff²⁸. Mette alla prova due ipotesi: i due valori sono diversi, oppure i due valori non sono diversi ad una soglia posta al di sopra di una probabilità di falso allarme (PFA). Un valore PFA arbitrario del 5% (T = 3,8) è considerato il limite superiore di significatività tra due parametri (t₀ o D_eff), indicando che esiste solo il 5% di possibilità che i due valori siano identici.

1. Creare un file ".xls" contenente i valori caratteristici della legge di diffusione di ciascuna condizione per confrontare (ad esempio, un file contenente l'errore t₀, t₀ , D_eff e D_eff per le condizioni non trattate (NT) e trattate (COase) come una tabella).
   1. Avviare il software MATLAB 2.
   2. Seleziona il file ".xls".
   3. Analizzare il grafico 2D codificato a colori generato, in cui i test statistici t₀ e D_eff devono essere tracciati rispettivamente sugli assi x e y (Figura 4). Più alto è T, maggiore è la differenza tra i valori confrontati.

10. Misurazioni della concentrazione di colesterolo

1. Trattamento cellulare e lisi
   1. Seminare le cellule Cos7 in triplice copia in piastre a 6 pozzetti a 4 × 10⁵ cellule/pozzetto e incubare in 2 ml di DMEM completo a 37 °C con il 5% di CO₂ durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi alla piastra.
   2. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   3. Aggiungere 1 mL di tampone HBSS/HEPES contenente (o meno, per i controlli) 1 U/mL di Coasi e incubare per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO₂.
   4. Sostituire il mezzo con 1 mL di HBSS/HEPES contenente 0,1 U/mL di Coasi e incubare per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO₂.
   5. Rimuovere la soluzione e raccogliere le cellule.
   6. Lavare le celle tre volte con PBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   7. Lisare le cellule con tampone di saggio di radioimmunoprecipitazione (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl₂, 1 mM di acido tetraacetico etilendiammina, 2% di glicerolo, proteasi e cocktail inibitore della fosfatasi) per 30 minuti sul ghiaccio.
   8. Centrifugare i lisati a 10000 × g per 10 min a 4 °C e raccogliere il surnatante.
2. Quantificare la concentrazione totale di proteine per ciascun campione mediante il test proteico di Bradford modificato utilizzando la soluzione di lavoro in base alle raccomandazioni del produttore.
3. Misurazione della concentrazione di colesterolo
   1. Per determinare il livello di colesterolo cellulare totale enzimaticamente, utilizzare il kit appropriato (ad esempio, Amplex Red Cholesterol Assay Kit) secondo le raccomandazioni del produttore.
   2. Per ogni reazione, mescolare il campione contenente 5 μg di proteine con la soluzione di lavoro reagente Amplex Red/perossidasi di rafano/colesterolo ossidasi/colesterolo esterasi e incubare per 30 minuti a 37 °C al buio.
   3. Misurare la fluorescenza utilizzando l'eccitazione di 520 nm e rilevare l'emissione a 560-590 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
   4. Sottrarre lo sfondo dal valore finale e determinare la concentrazione di colesterolo utilizzando una curva standard.
   5. Calcola il contenuto finale di colesterolo in ng di colesterolo per μg di proteine.

Results

Abbiamo generato un DL per Thy1-GFP espresso in celle Cos-7 (Figura 4, quadrati neri). La legge di diffusione ha un valore _{t 0} positivo (19,47 ms ± 2 ms), indicando che Thy1-GFP è confinato in strutture nanodominio della membrana plasmatica. Il trattamento con colesterolo ossidasi delle cellule che esprimono Thy1-GFP ha comportato lo spostamento del valore DL t₀ a 7,36 ± 1,34 ms (Figura 4, quadrati grigi). Questa osservazione conferma che la natura del confinamento Thy1-GFP dipende dal contenuto di colesterolo ed è associata a nanodomini di zattera lipidica. Queste due leggi di diffusione si sono dimostrate diverse secondo il test statistico sopra descritto (vedi punto 9.1.3) in termini di valori t₀ e D_eff. Inoltre, abbiamo valutato la concentrazione di colesterolo cellulare totale nelle cellule Cos-7 non trattate rispetto alle cellule trattate con COase. Una piccola, ma significativa, diminuzione del contenuto di colesterolo totale è osservata durante il trattamento con COase (Figura 5). Poiché questo enzima agisce solo sul pool di colesterolo accessibile al foglietto esterno della membrana plasmatica, assumiamo che la diminuzione osservata del colesterolo sia associata solo alla membrana plasmatica e si traduca nella destabilizzazione dei nanodomini della zattera lipidica.

Figura 1: Leggi di diffusione della spettroscopia di correlazione di fluorescenza simulata (FCS) stabilite da FCS a variazione spot per diverse forme di organizzazione della membrana. (Pannelli superiori) Rappresentazione schematica dell'organizzazione della membrana - (A) diffusione libera, (B) barriere a rete e (C) confinamenti trappola / dominio - con la traiettoria disegnata per una singola molecola (rosso). I cerchi blu denotano l'intersezione della membrana e del raggio laser della vita ω. (Pannelli inferiori) Leggi di diffusione FCS rappresentate tracciando il tempo di diffusione t_d in funzione del raggio quadrato ω². La proiezione della legge di diffusione (linea tratteggiata verde) intercetta l'asse temporale a (A) l'origine (t₀ = 0) nel caso di diffusione libera; (B) in asse negativo (t₀ < 0) quando ci sono barriere a maglie, o (C) in asse positivo (t₀ > 0) quando ci sono trappole e domini (zattere lipidiche). D è il coefficiente di diffusione laterale per il moto browniano; D_eff, il coefficiente di diffusione effettivo; D_micro, il coefficiente di diffusione microscopico all'interno delle trappole a maglie; D_in, il coefficiente di diffusione all'interno dei domini; D_out, il coefficiente di diffusione al di fuori dei domini; L, la dimensione del lato di un dominio quadrato; e r_D, il raggio di un dominio circolare. Questa figura è stata modificata da He e Marguet⁶. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Visualizzazione schematica del controllo hardware svFCS. Il computer controlla tutti i dispositivi attraverso diversi protocolli di comunicazione: seriale (microscopio, otturatore esterno), USB (stadio piezoelettrico XYZ, correlatore) e PCI (scheda di acquisizione). DAQ: scheda di acquisizione dati, APD: fotodiodo a valanga, SPCM: modulo di conteggio a singolo fotone, DO: uscita digitale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Vista schematica dei percorsi ottici di eccitazione ed emissione della configurazione svFCS. La configurazione svFCS contiene quattro moduli: (1) l'uscita di un laser a fibra da 488 nm è collimata, (2) una combinazione di una piastra a mezza onda e di uno splitter a fascio polarizzante imposta la potenza ottica, (3) il raggio laser focalizzato sul campione dopo aver viaggiato attraverso un microscopio motorizzato privo di lenti tubolari e (4) la fluorescenza viene rilevata attraverso un percorso di rilevamento simile a quello confocale su un fotodiodo a valanga accoppiato a un singolo modulo di conteggio dei fotoni, che fornisce un segnale a un correlatore hardware. La semplicità conferisce al sistema sensibilità, robustezza e facilità d'uso (ampiamente commentata nel materiale supplementare). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Le leggi di diffusione svFCS generate dall'analisi di diffusione di Thy1-GFP espresse in Cos-7. leggi di diffusione svFCS delle cellule Cos-7 senza trattamento (NT, quadrati neri) e dopo trattamento con colesterolo ossidasi (COasi, cerchi grigi). L'inserto nel grafico rappresenta la verifica statistica di una differenza significativa tra le due leggi di diffusione svFCS presentate (secondo Mailfert et ^al.28). Il valore di prova (T) deve essere superiore alla soglia impostata a 3,8 quando entrambe le leggi di diffusione sono diverse. Più è alto, maggiore è la differenza tra le leggi di diffusione. Il valore di T è codificato a colori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Confronto del contenuto di colesterolo totale nelle cellule Cos-7. Le cellule Cos-7 sono state non trattate (NT) o trattate con 1 U / mL di colesterolo ossidasi (COasi) per 1 ora. I dati rappresentano un esempio di un esperimento in triplice copia. Un t-test a due code e spaiato è stato utilizzato per valutare la differenza statistica (α = 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella dei materiali: Elenco degli elementi ottici necessari per la configurazione svFCS.

Materiale supplementare: Questo documento descrive la creazione di una configurazione svFCS da zero. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Qui abbiamo descritto l'implementazione del modulo svFCS su un microscopio fluorescente standard, un potente approccio sperimentale per decifrare la dinamica dell'organizzazione della membrana plasmatica nelle cellule viventi grazie all'analisi della legge di diffusione FCS. Concettualmente, lo svFCS si basa su un principio semplice: misure di correlazione della fluorescenza nel dominio del tempo variando le dimensioni dell'area di illuminazione²³. Questa strategia è stata determinante nel dedurre informazioni nanoscopiche da misurazioni microscopiche, che aiutano a decifrare i principali elementi fisico-chimici che contribuiscono all'organizzazione della membrana plasmatica in stato stazionario²⁵ e processi fisiologici ^30,31,32,33. Complessivamente, queste analisi svFCS dimostrano inequivocabilmente l'esistenza di nanodomini lipidi-dipendenti in vari tipi di cellule e la loro implicazione diretta nella sintonizzazione di diversi eventi di segnalazione.

All'interno di questo quadro, ci sono alcuni aspetti ottici che devono essere considerati durante la costruzione della configurazione svFCS per ottimizzare il budget dei fotoni e ridurre al minimo le aberrazioni ottiche. Pertanto, si consiglia di utilizzare un microscopio da cui è possibile rimuovere la lente del tubo quando viene eseguita la misurazione svFCS. Inoltre, un singolo diaframma gioca un ruolo chiave nella configurazione svFCS: cambia la dimensione del fascio all'apertura posteriore dell'obiettivo, variando così direttamente la dimensione effettiva della vita (cioè il volume di eccitazione effettivo). Il diametro del fascio dovrebbe adattarsi alla pupilla posteriore dell'obiettivo per ottenere la più piccola dimensione della vita³⁴. Questa opzione, che aiuta a regolare il girovita, garantisce l'ottimizzazione del budget dei fotoni ed è facile da implementare. Infine, un numero minimo di parti ottiche viene utilizzato lungo il percorso della luce; meno complesso è il sistema, meno fotoni si perdono. Tutte queste opzioni migliorano significativamente la robustezza degli esperimenti svFCS.

Per quanto riguarda il protocollo stesso, devono essere considerati alcuni passaggi critici. Il più importante è un allineamento appropriato dei percorsi ottici che è cruciale per il successo delle misurazioni svFCS (protocollo, sezione 2). Questo è facile da controllare analizzando il segnale di fluorescenza da una soluzione Rh6G da 2 nM, che dovrebbe essere ~ 200 kHz sotto l'illuminazione laser di 300 μW. Tutte le iridi devono essere aperte e gli ACF devono avere un'ampiezza importante (in genere G0 ~ 1,5-2,0). Un altro punto critico riguarda le cellule e la loro preparazione per l'analisi svFCS (protocollo, sezioni 4-8). La loro densità deve essere adattata in modo che le cellule isolate da osservare siano disponibili per l'analisi. Le cellule non aderenti devono essere immobilizzate su un vetro di copertura camerato utilizzando una soluzione di poli-L-lisina. Il segnale di fluorescenza dall'etichettatura delle celle non dovrebbe essere troppo forte, o si tradurrà in ACF molto piatti che sono difficili da adattare e i parametri di adattamento sono gravati da un errore importante. Inoltre, l'etichettatura non omogenea e gli aggregati di fluorescenza nelle cellule rendono le misurazioni svFCS estremamente difficili da interpretare. Infine, il trattamento con colesterolo ossidasi influisce sulla vitalità cellulare e l'analisi svFCS non deve superare un'ora dopo il trattamento. È anche meglio registrare le fluttuazioni di fluorescenza dalla membrana plasmatica superiore in quanto non è attaccata al supporto e non vi è alcun rischio di diffusione ostacolata delle molecole a causa delle interazioni fisiche con il supporto.

Ci sono stati abbastanza progressi nella tecnica svFCS per il suo uso in diversi approcci a causa della diversità delle modalità per regolare il volume di rilevamento, rendendo possibile studiare vari processi biologici nelle cellule viventi. Un'alternativa alla regolazione della dimensione del volume di eccitazione consiste nell'utilizzare un espansore a fascio variabile³⁵. È anche possibile modulare semplicemente la dimensione dell'area di illuminazione registrando il segnale fluorescente dall'intercettazione della membrana plasmatica lungo la direzione z³⁶. Questo può essere fatto su un microscopio confocale standard per il quale è stato sviluppato un quadro teorico per derivare la legge di diffusione^37,38.

Sebbene il metodo svFCS offra una risoluzione spazio-temporale, necessaria per la caratterizzazione dell'organizzazione laterale disomogenea della membrana plasmatica, le modalità geometriche di confinamento non si escludono a vicenda. Una deviazione di t₀ in una direzione o nell'altra rivela esclusivamente un modo dominante di confinamento²⁵. Inoltre, un'altra importante limitazione dell'attuale metodo svFCS deriva dal classico limite di diffrazione ottica (~200 nm). Questo è indiscutibilmente maggiore dei domini che confinano le molecole all'interno della membrana plasmatica cellulare. Pertanto, l'analisi del confinamento è dedotta dal valore t₀ , estrapolato dalla legge di diffusione.

Questo inconveniente è stato superato implementando metodi alternativi. Inizialmente, l'uso di pellicole metalliche perforate con nanoaperture offriva la possibilità di illuminare un'area di membrana molto piccola (cioè al di sotto del limite di diffrazione ottica di singole aperture nanometriche di raggi variabili tra 75 e 250 nm)³⁹. È stato così riportato il regime di transizione previsto dalla legge teorica di diffusione per l'organizzazione di domini isolati, che ha permesso un affinamento della dimensione caratteristica delle eterogeneità nanometriche della membrana e una stima quantitativa della superficie occupata dai nanodomini lipido-dipendenti³⁹. In alternativa, l'illuminazione nanometrica è stata sviluppata anche utilizzando la microscopia ottica a scansione a campo vicino⁴⁰ o nanoantenne ottiche planari⁴¹. Più recentemente, la combinazione di esaurimento delle emissioni stimolate (STED) e FCS ha fornito uno strumento potente e sensibile per documentare la legge di diffusione con una risoluzione spaziale molto elevata. Questo STED-FCS dà accesso alle caratteristiche di diffusione molecolare su scala nanometrica che si verificano in un breve periodo di tempo, consentendo lo studio dell'organizzazione dinamica delle sonde lipidiche sulla membrana^{plasmatica 42,43}. Tuttavia, la soppressione incompleta della fluorescenza nel processo STED sfida l'analisi delle curve di auto-correlazione in FCS.

È stato sviluppato un nuovo modello di fitting per superare questa difficoltà, migliorando l'accuratezza dei tempi di diffusione e le misure medie del numero di molecole⁴⁴. Infine, per una lenta diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, il principio svFCS può essere applicato ai dati registrati mediante spettroscopia di correlazione delle immagini⁴⁵. Recentemente, è stato dimostrato che la combinazione della microscopia a forza atomica (AFM) con l'imaging a riflessione interna totale-FCS (ITIR-FCS) contribuisce al perfezionamento della natura del meccanismo che ostacola la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, specialmente vicino alla configurazione della membrana di soglia di percolazione a causa di un'alta densità di nanodomini⁴⁶.

In conclusione, stabilire la legge di diffusione mediante svFCS ha fornito le prove sperimentali per dedurre l'eterogeneità locale creata da lipidi collettivi dinamici e associazioni di proteine di membrana. Come affermato da Wohland e colleghi⁴⁶, "l'analisi della legge di diffusione FCS rimane uno strumento prezioso per dedurre caratteristiche strutturali e organizzative al di sotto del limite di risoluzione dalle informazioni dinamiche". Tuttavia, abbiamo bisogno di sviluppare nuovi modelli per perfezionare l'interpretazione della legge di diffusione che dovrebbe consentire una migliore comprensione della dinamica degli eventi molecolari che si verificano sulla membrana plasmatica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chiave per anelli	sicurezza filettati SM1 Thorlabs		SPW602
Fotodiodo a valanga e modulo di conteggio a singolo fotone (SPCM)	Modulo di conteggio a singolo fotone, fotodiodo a valanga	Excelitas	SPCM-AQRH-15
	BNC 50 Ω spina a 50 e cavo spina Omega; 2 m	RS Components	742-4315
	Cavo coassiale 415 Connettori RCA, RG-316, 50 e Omega; Con connettore, 1,22 m, RoHS2	RS Components	885-8172
	Tee 50Ω Adattatore RF Spina BNC a presa BNC 0 → 1GHz	RS Components	546-4948
	Brennenstuhl 2,5 m, 8 prese Tipo E – Cavo di prolunga francese, 230 V	RS Components	768-5500
	Mascot, alimentatore a spina da 6 W 5 V c.c., 1,2 A, 1 uscita alimentatore a commutazione, tipo C	RS Components	452-8394
	Crystek CCSMACL-MC-24 Oscillatore di riferimento Cavo di alimentazione Adattatore RF	RS Components	792-4079
Filtro a fluorescenza	535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diametro 25 mm	Filtro AHF	F47-539
	Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Filtro AHF Chroma 25,5 x 36 x 1 mm		F43-088
	496/LP Filtro passa-lungo BrightLine HC, AOI 0° Chroma Diametro 25	AHF filtro	F37-496
Correlatore hardware Correlatore	digitale 80 MHz	Correlator.com	Flex02-12D
Laser	LASOS LDM-XT accoppiato a fibra, 488 nm, 65 mW	Lasos	BLD-XT 488100
Nastro adesivo nero ad alte prestazioni di sicurezza laser, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Rotolo	Thorlabs	T743-2.0
	Fazzoletti per lenti, 25 fogli per opuscolo, 5 opuscoli	Thorlabs	MC-5
	, lenti arancioni chiari, trasmissione della luce visibile al 48% Microscopio	Thorlabs	LG3B
	Microscopio a fluorescenza invertita motorizzato Zeiss Axiovert 200M Messa a fuoco fine e grossolana, rotazione della torretta riflettente, rotazione del portaobiettivi dell'obiettivo, commutazione delle porte della fotocamera e otturatori di luce interni	Carl Zeiss
	C-Apocromatico 40x/1,2 W Korr.selected per FCS (D=0,14-0,19 mm) (WD=0,28 mm a D=0,17 mm), UV-VIS-IR	Carl Zeiss	421767-9971-711
	Adattatore W0,8 / M27x0,75 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-345
	Anello centrale W0,8 - W0,8 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-347
Percorso ottico	D25,4mm Specchio, Argento protetto	Thorlabs	PF10-03-P01
	D25.4mm, F=60.0.mm, Achromat visibile	Thorlabs	AC254-060-A
	D25.4mm, F=35.0.mm, Achromat visibile	Thorlabs	AC254-035-A
	25 µ m montato foro stenopeico	Thorlabs	P25S I
	25,4 mm montato zero, ordine 1/2 piastra d'onda 488 nm	Thorlabs	WPH10M-488 (HWP)
	20 mm Cubo beamsplitter polarizzatore 420-680 nm	Thorlabs	PBS201
	Stadio di rotazione 56 mm x 26 mm ID filettato	Thorlabs	RSP1/M
	52 mm x 52 mm Montaggio su piattaforma cinematica	Thorlabs	KM100B/M
	Morsetto a prisma regolabile	Thorlabs	PM3/M
	Blocco fascio - area attiva 19 mm x 38 mm	Thorlabs	LB1/M
	Diaframma a iride Apertura da 1 mm a 25 mm	Thorlabs	ID25/M
	Cinematica per mancini Supporto per obiettivo cilindrico	Thorlabs	KM100CL
	1" Supporto ottico, M4 Tap	Thorlabs	MFF101/M
	Tubo per obiettivo impilabile da 1"	Thorlabs	SM1L03
	Supporto per obiettivo impilabile per profondità utilizzabile in ottica da 1" ½	Thorlabs	SM1L05
	Supporto per obiettivo impilabile per 1"Profondità ottica utilizzabile 2"	Thorlabs	SM1L20
	Binari ottici piccoli 600mm,	Thorlabs	RLA600/M
	Binari ottici piccoli metrici 75mm,	Thorlabs	RLA075/M
	Binari ottici piccoli 150mm,	Thorlabs	RLA150/M
	Rail Carrier metrico, Foro svasato 1 "x 1"	Thorlabs	RC1
	Rail Carrier, perpendicolare a coda di rondine	Thorlabs	RC3
	Supporto per lente di traslazione ad alta precisione	per Thorlabs	LM1XY / M
	frac12; " (12 mm) Stadio di traslazione a coda di rondine	Thorlabs	DT12 / M
	Morsetti per binari	Thorlabs	CL6
	Stadio di traslazione XYZ metrico (include PT102)	Thorlabs	PT3/M
	Tessuto gommato nero	a sfera Thorlabs	BK5
	/ 6 strumenti	Adattatore Thorlabs	BD-KIT/M
	con filettature esterne M6 x 1,0 e filettature esterne M4 x 0,7 Base	Thorlabs	AP6M4M
	, 25 mm x 58 mm x 10 mm, confezione da 5	Thorlabs	BA1S/M-P5
	Supporto per obiettivo per ottica da 25,4 mm	Thorlabs	LMR1/M
	SM1 FC/APC Adattatore	Thorlabs	SM1FCA
	specchio cinematico per ottica da 1 pollice	in silicone Thorlabs	KM100
	, 400-1100 nm, 50 mW	Thorlabs	S120C
	Supporti per pali da 12,7 mm, vite a testa zigrinata con bloccaggio esagonale a molla, L=50 mm, confezione da 5	Thorlabs	Portapalo PH50/M-P5
	con vite a testa zigrinata a molla, L=20 mm	Thorlabs	PH20/M
	Perno ottico in acciaio inossidabile da 12,7 mm x 50 mm, perno M4, foro filettato M6, confezione da 5	Thorlabs	TR50/M-P5
	perno ottico in acciaio inossidabile da 12,7 mm x 75 mm, perno M4, foro filettato M6, confezione da 5	Thorlabs	TR75/M-P5
	Interfaccia USB per contatore di energia e alimentazione	Thorlabs	PM100USB
	perno ottico in acciaio inossidabile da 12,7 mm x 30 mm, perno M4, foro filettato	Thorlabs	TR30/M
	perno ottico in acciaio inossidabile da 12,7 mm x 20 mm, perno M4, foro filettato M6	Thorlabs	TR20/M
	Binario strutturale lungo 750 mm (scatola di rilevamento)	Thorlabs	XE25L750/M
	Binario strutturale lungo 350 mm (scatola di rilevamento)	Thorlabs	XE25L350/M
	per binari da 25 mm Staffa	Thorlabs	XE25W3
	per binari da 25 mm	Thorlabs	XE25A90
	Cartoncino nero 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1,6 mm) di spessore, 5 fogli	Cerniera Thorlabs	TB5
	per custodie	da 25 mmThorlabs	XE25H
	Fermo coperchio per custodie su guida da 25 mm	Thorlabs	XE25LS
	Kit viti a testa cilindrica M4	Thorlabs	HW-KIT1/M
	Kit viti a testa cilindrica M6 e kit bulloneria	Thorlabs	HW-KIT2/M
	Morsetto da tavolo, forma a L, confezione da 5	Thorlabs	CL5-P5
	SM1 diaframma a iride azionato ad anello (Ø 0,8 - Ø 12 mm)	Thorlabs	SM1D12D
	Ø Disco di allineamento in vetro smerigliato montato su SM1 da 1" con fendente;	Thorlabs	DG10-1500-H1-MD con foro
, Standa	Standa	1HB10-15-12
	Piezoelettrico digitale multicanale, 3 canali, da -30 a 130 V Connettore/i Sub-D, sensori capacitivi,	Physik Instrumente	PI E727-3.CD
Camera di temperatura	Zeiss 200M Sistema di incubazione per microscopio invertito MATT BLK	Digital Pixel Regolatore
	temperatura a microprocessore a doppio canale	Pixel	DP_MTC_2000_DUO
	due moduli	riscaldanti senza vibrazioniSensore di temperatura Digital Pixel	DP_150_VF
	PT100	Digital Pixel	DP_P100_TS
Reagenti e materiali biologici
Coltura cellulare e trasfezione	di cellule Cos7	ATCC®	CRL-1651&commercio;
	Camere Lab-Tek a 8 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	155411PK
	Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
	Siero fetale bovino	Thermo Fisher Scientific	16000044
	L-glutammina	Thermo Fisher Scientific	25030081
	tampone PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
	PenStrep	Thermo Fisher Scientific	15140122
	Reagente di trasfezione PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Misurazione del contenuto di colesterolo	dosaggio del colesterolo rosso Amplex Thermo	Fisher Scientific	A12216
	Cocktail di inibitori della proteasi Thermo	Fisher Scientific	87786
	Inibitore della fosfatasi Cocktail	Thermo Fisher Scientific	78420
	ROTI Nanoquant Soluzione di lavoro	Roth	K880
	GloMax Discover Lettore di micropiastre	Promega	GM3000
Misure svFCS	Tampone HBSS	Thermo Fisher Scientific	14025092
	Hepes tampone	Thermo Fisher Scientific	15630080
	Colesterolo ossidasi	Sigma-Aldrich	C8868
	rodamina 6G	Sigma-Aldrich	83697-1G