Flusso di lavoro di tomografia ad array per l'acquisizione mirata di informazioni sul volume utilizzando la microscopia elettronica a scansione

Summary

Descriviamo la preparazione di nastri di sezioni seriali e la loro raccolta su un ampio supporto di trasferimento per l'uso come campioni di tomografia array, insieme a procedure di imaging automatizzate in un microscopio elettronico a scansione. Il protocollo consente lo screening, il recupero e l'imaging mirato di eventi locali rari e l'acquisizione di grandi volumi di dati.

Abstract

La microscopia elettronica è applicata in biologia e medicina per l'imaging di dettagli cellulari e strutturali a risoluzione nanometrica. Storicamente, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha fornito informazioni sull'ultrastruttura cellulare, ma nell'ultimo decennio, lo sviluppo dei moderni microscopi elettronici a scansione (SEM) ha cambiato il modo di guardare all'interno delle cellule. Anche se la risoluzione del TEM è superiore quando sono necessari dettagli strutturali a livello proteico, la risoluzione SEM è sufficiente per la maggior parte delle domande relative alla biologia cellulare a livello di organello. Il progresso tecnologico ha consentito soluzioni di acquisizione automatica del volume come l'imaging seriale a blocchi (SBF-SEM) e il fascio ionico focalizzato SEM (FIB-SEM). Tuttavia, fino ad oggi, questi metodi rimangono inefficienti quando l'identificazione e la navigazione verso le aree di interesse sono cruciali. Senza i mezzi per la localizzazione precisa delle aree target prima dell'imaging, gli operatori devono acquisire molti più dati di quelli di cui hanno bisogno (in SBF-SEM) o, peggio ancora, preparare molte griglie e immaginarle tutte (in TEM). Proponiamo la strategia di "screening laterale" utilizzando la Tomografia Array in SEM, che facilita la localizzazione delle aree di interesse, seguita dall'imaging automatizzato della frazione rilevante del volume totale del campione. I campioni di tomografia array vengono conservati durante l'imaging e possono essere organizzati in librerie di sezioni pronte per l'imaging ripetuto. Vengono mostrati diversi esempi in cui lo screening laterale ci consente di analizzare dettagli strutturali a cui è incredibilmente difficile accedere con qualsiasi altro metodo.

Introduction

Nonostante l'importanza delle tecniche relative ai ME, lo sforzo richiesto per padroneggiarle mantiene l'intero campo limitato a un piccolo numero di specialisti. Una difficoltà significativa è l'identificazione e il recupero di una regione di interesse (ROI) nei campioni conservati per EM. L'aspetto dello stesso campione differisce considerevolmente quando analizzato al microscopio ottico e dopo l'elaborazione per l'osservazione EM. Le modifiche per i campioni preparati chimicamente includono il restringimento del campione anisotropico dopo le fasi di disidratazione (~ 10% in ciascuna dimensione) e la perdita di fluorescenza quando si utilizza l'osmio nel protocollo di fissazione e colorazione (Figura 1A). Per il sezionamento ultrasottile, i campioni sono incorporati in resine epossidiche o acriliche utilizzando diverse strategie (Figura 1B). Per ottenere risultati positivi di questa preparazione, l'intero campione deve essere frazionato in pezzi che non superino 1 mm x 1 mm. Per soddisfare i requisiti standard delle condizioni di osservazione della microscopia elettronica a trasmissione (TEM), questa piccola porzione del campione viene ulteriormente sezionata a fette spesse 50-150 nm. Le immagini in scala di grigi risultanti mostrano l'organizzazione tissutale e la struttura degli organelli di una frazione minuscola dell'intero campione con maggiori dettagli rispetto a qualsiasi altra tecnica di microscopia (Figura 1C). Un tipico set di dati TEM fornisce informazioni 2D, teoricamente estrapolate per comprendere i processi che si verificano naturalmente in uno spazio 3D in cellule e tessuti. La figura 1D presenta la sfida dell'acquisizione di volumi ultrastrutturali: se un cubo di lato 1.000 μm è sezionato a 50 nm di spessore, saranno necessarie 20.000 sezioni per coprire l'intero volume; per un cubo laterale da 500 μm, sarà di 10.000 sezioni. Per coprire un volume di 50 μm x 50 μm x 50 μm, potrebbero essere necessarie "solo" 1.000 sezioni. Ottenere questo volume manualmente è praticamente impossibile ed estremamente impegnativo da eseguire con l'automazione. Se, oltre alla profondità del campione, abbiamo bisogno di coprire l'intera superficie di tali ipotetici cubi, la copertura di 1^{μm 2} di superficie a risoluzione ragionevole diventa un serio problema logistico (Figura 1E). Mentre per i progetti straordinari su larga scala, come gli approcci di connettomica, il gran numero di sezioni è cruciale, per la maggior parte dei progetti EM "banali", generare più sezioni necessarie per l'osservazione presenta uno svantaggio significativo.

Esistono diversi metodi per acquisire informazioni ultrastrutturali 3D: microscopia elettronica a trasmissione a sezione seriale (TEM), tomografia TEM, tomografia array (AT), microscopia elettronica a scansione a blocchi facciali seriali (SBF-SEM) e microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Le principali differenze tra questi metodi sono la strategia di sezionamento e se l'acquisizione dell'immagine è accoppiata alla generazione di sezione¹. Nel TEM di sezionamento seriale, le sezioni sequenziali vengono raccolte su griglie di slot, le immagini TEM vengono generate da queste sequenze e allineate^2,3,4,5. Nella tomografia TEM, le serie di inclinazione da sezioni da 150-300 nm su una griglia e, quando accoppiate al sezionamento seriale, forniscono una risoluzione molto elevata, anche se volumi relativamente piccoli^6,7,8. L'approccio AT utilizza il sezionamento fisico con diversi modi manuali e semi-automatici di raccolta di sezioni su supporti relativamente grandi, come coperchi di vetro, wafer di silicio o un nastro speciale. Per l'acquisizione di immagini, il supporto viene analizzato in SEM, con diverse strategie di acquisizione delle immagini sono disponibili^{9,10,11,12,13,14,15.} Per SBF-SEM, il sezionamento fisico è ottenuto utilizzando un mini-microtomo con un coltello diamantato incastonato direttamente all'interno della camera SEM, con l'immagine SEM generata dalla superficie del blocco di resina^16,17,18,19. Per FIB-SEM, la sorgente ionica rimuove gli strati sottili del campione, seguita dall'imaging automatico della superficie esposta da parte del SEM^20,21. La tomografia TEM e l'AT generano sezioni fisiche, che possono essere ripresentate se necessario, mentre FSBF-SEM e FIB-SEM eliminano la sezione dopo l'imaging. Una recente combinazione di sezioni fisiche riprese da un SEM multi-fascio fornisce una combinazione di metodi che risolve il problema del "collo di bottiglia" della velocità di acquisizione delle immagini²². Ognuna di queste tecniche ha rivoluzionato il modo in cui i dati EM possono essere ottenuti e analizzati, e ogni approccio ha i suoi impatti pratici relativi a una determinata domanda di ricerca.

Data la natura della preparazione e la scala delle dimensioni ultrastrutturali, non è semplice prevedere dove si trova una specifica struttura target nel blocco campione (Figura 1D,E). Una soluzione per la localizzazione del ROI è la registrazione delle immagini dall'intero blocco alla risoluzione desiderata fin dall'inizio. Le strutture di interesse possono essere nel volume di dati acquisito quando si è lontani dal microscopio. I tempi di acquisizione e la gestione dei dati associati a questa strategia sono problematici. È auspicabile ridurre la quantità di dati registrati, specialmente se i ROI sono molto più piccoli del blocco tissutale, cioè se gli oggetti di interesse sono tipi specifici di cellule (non organi interi). Diverse tecniche di microscopia elettronica e alla luce correlativa (CLEM) possono avere successo quando la fluorescenza viene conservata e localizzata prima o dopo la preparazione all'interno dello stesso campione^{23,24,25,26,27,28,29.} Tuttavia, molte strutture cellulari sono riconoscibili anche senza correlazione di fluorescenza, solo in base all'ultrastruttura nota. Per questi casi, riteniamo che lo screening laterale Array Tomography fornisca un compromesso di equilibrio tra lo sforzo investito nella localizzazione del ROI e la qualità delle informazioni ultrastrutturali. Utilizzando questa strategia, un sottoinsieme di sezioni sul wafer viene sottoposto a screening a intervalli regolari, che possono essere stabiliti in base alle dimensioni e alla natura del ROI. Una volta trovati i ROI, l'acquisizione dei dati viene impostata in una serie continua di sezioni che iniziano prima e terminano dopo la sezione di ancoraggio, raccogliendo le informazioni pertinenti in modo mirato.

Presentiamo protocolli per AT che semplificano e accelerano l'acquisizione di regioni o eventi di interesse in numerose sezioni e producono volumi di immagini meglio allineati. Lo screening laterale e l'acquisizione multistep producono dati ad altissima risoluzione in regioni mirate con precisione. La procedura che descriviamo affronta diverse sfide dell'acquisizione dati EM 3D, in quanto prevede: compatibilità con un'ampia gamma di campioni senza modificare radicalmente il flusso di lavoro di preparazione del campione; localizzazione mirata per acquisizioni di sezionamento e SEM; riduzione di tempo e fatica durante l'installazione; imaging di regioni in più sezioni con un migliore allineamento dei volumi risultanti; e una procedura di cucitura e allineamento liscia per compilare diverse immagini in un'immagine a mosaico cucita. Abbiamo scelto di dimostrare la forza del nostro metodo con diversi campioni di progetti pubblicati e in corso. Riteniamo che questo approccio possa facilitare in modo significativo la generazione e l'acquisizione di dati EM mirati, anche per gli investigatori con limitata esperienza EM.

Protocol

NOTA: I metodi di preparazione dei campioni sono descritti altrove^14,30,31e non sono trattati in questa pubblicazione. In breve, gli esempi mostrati sono stati fissati chimicamente con glutaraldeide, post-fissati con OsO_{4 all'1%,}quindi trattati con acetato di uranile acquoso all'1% prima di incorporarlo nella resina incorporata. In alternativa, i campioni possono essere preparati utilizzando il congelamento ad alta pressione, il congelamento sostituito con lo 0,1% di acetato di uranile nell'acetone e incorporato in resina acrilica. I blocchi campione sono stati preparati utilizzando un metodo di incorporamento piatto che consente una visione chiara del campione, facilitandone l'orientamento per il sezionamento (Figura 1B).

1. Procedura di generazione dell'array

1. Orientamento e rifilatura del campione incorporati
   1. Utilizzando il binocolo/microscopio, identificare e contrassegnare il ROI sulla superficie del blocco incorporato graffiando leggermente la superficie del blocco con una lama di rasoio. Ciò contribuirà a orientare il campione all'interno dell'ultramicrotomo e ridurrà la superficie di sezionamento.
   2. Bloccare il campione sul supporto dell'ultramicrotomo (Figura 2A).
   3. Tagliare la resina attorno al campione, prima con la lama del rasoio (rifilatura ruvida) e continuare con lo strumento di rifilatura diamantata (rifilatura fine; Figura 2A). Utilizzare coltelli con inclinazione del bordo di 20° o 90° per garantire che le superfici superiore e inferiore del blocco siano parallele al tagliente del coltello.
      NOTA: questo passaggio è fondamentale per il sezionamento seriale e l'acquisizione di nastri dritti.
   4. Mescolare xilene e colla in proporzione 3:1. Con una ciglia attaccata a uno stuzzicadenti, applicare questa miscela sui bordi superiore e inferiore del blocco tagliato. Lasciare asciugare accuratamente.
2. Preparare il supporto di montaggio dell'array A (ad esempio, wafer di silicio).
   1. Tagliare il pezzo di wafer utilizzando uno strumento di scissione del wafer (EMS), regolandone le dimensioni in base all'obiettivo del progetto. 2 cm x 4 cm è conveniente sia per le osservazioni al microscopio ottico che elettronico.
   2. Pulire il wafer in acqua distillata per eliminare i detriti.
   3. Glow discharge/plasma pulisce la superficie utilizzando apparecchiature standard. I parametri precisi dipenderanno dalla macchina utilizzata. Inizia con i parametri per lo scarico delle griglie e regola empiricamente il tempo. Questo passaggio è fondamentale per una buona diffusione delle sezioni sul supporto mentre le sezioni si stanno asciugando e non devono essere omesse.
3. Preparare il supporto di montaggio degli array B (ad esempio, coperchio in vetro)
   1. Se si pianificano esperimenti di immuno-etichettatura multiplex, trasferire i campioni su un coverslip per rilevare meglio il segnale di fluorescenza. Per migliorare l'adesività del coverslip, utilizzare una procedura dettagliata di rivestimento della gelatina descritta in precedenza⁹.
   2. Aumentare la conduttività rivestendo i vetrini con l'indio-stagno-ossido (ITO) o l'oro per evaporazione. Conservare le coperture preparate in un ambiente pulito. Glow scarica i campioni come descritto al punto 1.2.3.

2. Sezionamento del campione

1. Preparazione del coltello AT
   NOTA: per generare gli array, utilizzare un coltello modificato (ATS), progettato per facilitare l'acquisizione di nastri lunghi. Coltelli Histo-Jumbo o coltelli simili concepiti per la generazione delle sezioni su supporti di grandi dimensioni possono servire anche per il sezionamento AT.
   1. Attaccare l'ago sul fondo del coltello usando il nastro adesivo schiumoso e forarlo (Figura 2B). Posizionare il coltello ATS nel supporto per ultramicrotomia a 0°. Regolare il bordo del coltello parallelamente alla superficie del blocco utilizzando la procedura standard.
   2. Portare il blocco tagliato sul bordo del coltello in una posizione pronta per il sezionamento.
   3. Posizionare il wafer/coverslip all'interno della bacinella del coltello e riempirlo con acqua allo stesso livello del bordo del coltello. Lasciare umidificare correttamente il bordo diamantato del coltello e, se necessario, prelevare l'acqua utilizzando la siringa attaccata (Figura 2C).
2. Sezionamento e trasferimento di array
   1. Impostare il microtomo sui parametri di taglio desiderati. Con il coltello ATS, si consiglia la gamma di 50-100 nm e una velocità di taglio di 0,6-1 mm / s. Inizia il sezionamento (Figura 2Di).
   2. Ottenere un nastro della lunghezza che coprirà un volume z mirato e interrompere la raccolta. A seconda delle dimensioni del blocco, dell'omogeneità del tessuto e del tipo di resina, il nastro sarà relativamente dritto (Figura 2D-ii). Molti campioni non produrranno nastri dritti, nonostante lo sforzo investito e il tipo di coltello utilizzato.
   3. A seconda dell'obiettivo finale, crea uno o più nastri lunghi e corti allineati fianco a fianco. Un supporto di 2 cm x 4 cm può contenere comodamente da 100 a 1.000 sezioni. La disposizione del nastro sul gradino di supporto è un passo che richiede destrezza e mani ferme. Tuttavia, la curva di apprendimento per questa abilità viene rapidamente acquisita.
   4. Staccare il nastro dal bordo del coltello usando una punta pulita e non appiccicosa di una ciglia incollata sullo stuzzicadenti (Figura 2Diii).
   5. Usando le ciglia, spostare delicatamente il nastro sopra il centro del supporto. A questo punto, utilizzare cloroformio o penna riscaldante per lo stiramento delle sezioni, se necessario. Tuttavia, ricorda che questa manipolazione può indurre la rottura e la deformazione del nastro.
   6. Iniziare a drenare l'acqua tirando la siringa. Per nastri più delicati o una retrazione dell'acqua più lenta, lasciare gocciolare l'acqua staccando la siringa dal tubo. Quando il livello dell'acqua si abbassa al livello del wafer, controllare il nastro e riposizionarlo se necessario, spingendo delicatamente il nastro al centro. Dopo aver depositato i nastri sulla superficie del wafer, continuare a drenare fino a quando l'acqua rimanente non viene completamente retratta dal bacino.
      NOTA: Se non si utilizza il coltello ATS di retrazione dell'acqua di fondo, ridurre attentamente l'acqua dai lati del coltello ATS per non indurre turbolenze.
   7. Lasciare asciugare completamente le sezioni sul supporto all'interno del bagno. A seconda dell'idrofobicità del supporto e del livello di umidità ambientale, l'acqua evaporerà a una velocità diversa (Figura 2Div). È importante lasciare asciugare lentamente il campione per diminuire o evitare del tutto tutte le pieghe sul campione.
   8. Trasferire il campione secco in una scatola ben chiusa per proteggerlo dalla contaminazione da sporco e metterlo in un forno a 60 °C per almeno 30 minuti. Se necessario, controbattere le sezioni utilizzando metalli pesanti per migliorare il contrasto complessivo.
   9. Alla fine della procedura, pulire con cautela il coltello seguendo le istruzioni del produttore
      NOTA: il trasferimento di sezioni multiple o seriali su un wafer (Figura 2E) rispetto al trasferimento su una griglia di slot (Figura 2F) modifica completamente l'esperienza di preparazione EM. Il sezionamento e la raccolta ininterrotti delle sezioni su supporto singolo riducono la quantità di errori relativi al sezionamento e alla raccolta di sezioni frequenti nel sezionamento seriale. L'equivalente di 100 sezioni di 1000 μm x 500 μm raccolte su un wafer corrisponde a 33 griglie di slot (Figura 2G).

3. Osservazione del campione

NOTA: in questa sezione vengono descritti i passaggi del flusso di lavoro implementati utilizzando un software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali). È possibile utilizzare qualsiasi software di acquisizione di immagini su qualsiasi SEM dotato dei rilevatori corretti, tuttavia, le azioni specifiche dell'utente saranno diverse e spesso saranno più manuali.

1. Acquisisci una mappa panoramica delle immagini SEM che riveli le posizioni delle sezioni sul wafer. Un'immagine della fotocamera ottica integrata aiuta a definire un mosaico di immagini SEM che copre un nastro di sezioni o tutte le sezioni. Creare il mosaico facendo clic e trascinando con il mouse a destra sull'immagine della fotocamera del campione e avviare l'acquisizione automatica.
   NOTA: sono sufficienti impostazioni di imaging molto grossolane, ovvero 1-2 μm di dimensione dei pixel e 1 μs di tempo di permanenza. Questo processo è illustrato in Materiale supplementare (pagine 2-7).
2. Individua le sezioni con la funzione di rilevamento automatico di Section Finder o individuale manualmente. Le posizioni delle sezioni e i contorni vengono recuperati automaticamente con questo software in base alla corrispondenza delle immagini. Per un'illustrazione di questo processo, vedere Materiale supplementare (pagine 8 - 15).
3. Nel caso in cui le immagini panoramiche non mostrino chiaramente i ROI, acquisire immagini a risoluzione più elevata delle sezioni. Utilizzare la funzione Anteprima sezione per creare e acquisire automaticamente le immagini. Questo processo è illustrato in Materiale supplementare,pagine 16-18. Le impostazioni di imaging devono essere scelte in base alla natura e alle dimensioni del ROI che l'utente cerca.
   1. Per trovare le impostazioni ottimali, attivare il Live Imaging nel software di controllo del microscopio e passare a un ROI. Modificare le impostazioni di imaging fino a quando le immagini non mostrano chiaramente il ROI, ma l'acquisizione delle immagini non è eccessivamente lunga.
4. Definire le aree di imaging
   NOTA: vengono proposte diverse strategie.
   1. Se è necessario creare solo alcune sezioni, utilizzare le immagini delle sezioni create finora per navigare nelle sezioni pertinenti e utilizzare il Visualizzatore zoomabile che mostra tutte le immagini acquisite nelle posizioni relative originali per esaminare tutte le sezioni. Una volta trovata una sezione che dovrebbe essere ripresa ad alta risoluzione, creare un'area di imaging con click-drag. Scegli le impostazioni di imaging ad alta risoluzione e memorizza le impostazioni in un modello. Riutilizzare questo modello per ulteriori sezioni.
   2. Per trovare eventi rari particolarmente piccoli o difficili da rilevare, utilizzare l'approccio di screening laterale. Creare manualmente un'area di imaging con impostazioni di imaging ad alta risoluzione su ogni decima sezione o su una sezione per barra multifunzione e acquisire le immagini. Esamina le immagini e contrassegna le sezioni che contengono il ROI nel software o prendi nota.
      1. Partendo da sezioni che contengono il ROI, spostarsi avanti e indietro attraverso il set di sezioni e creare aree di imaging ad alta risoluzione nelle stesse posizioni relative per tutto il tempo in cui la struttura è ancora visibile nella sezione. Questo può essere fatto manualmente o utilizzando la procedura descritta nei passaggi successivi.
   3. Acquisisci immagini in più di dieci sezioni consecutive. Fare clic su Avvia perfezionamento posizione dopo aver ingrandito l'immagine per aumentare la precisione delle posizioni delle sezioni registrate, come descritto nel manuale. In questo modo si riduce la variabilità di posizione delle serie di immagini. La procedura è illustrata e spiegata nelle pagine 19-21 del Materiale supplementare.
   4. Fare clic e trascinare su qualsiasi sezione per definire un'area di imaging tenendo premuto il tasto Alt e selezionare Crea matrice set di riquadri dal menu di scelta rapida che si apre quando viene rilasciato il pulsante del mouse. Il software crea quindi regioni di imaging nella stessa posizione relativa in tutte le sezioni che sono state trovate o contrassegnate in precedenza. È possibile limitare l'imaging a un intervallo specifico di sezioni con il dispositivo di scorrimento Estensione sezione.
      NOTA: questa procedura può essere ripetuta con un numero qualsiasi di regioni di imaging e pertanto consente di registrare molte piccole immagini ad alta risoluzione anziché registrare una singola immagine più grande su ogni sezione.
   5. Una volta creato, imposta il numero di pixel, la dimensione dei pixel, il layout delle piastrelle, il tempo di permanenza dei pixel, ecc. In ogni serie di immagini secondo necessità. Una volta create e configurate le serie di immagini, vengono tutte elencate in un segnale di lavoro.
5. Configurare le funzioni automatiche e avviare l'acquisizione delle immagini
   1. Creare una serie di immagini separata per le funzioni automatiche utilizzando lo stesso metodo descritto nel passaggio precedente. Spostare la serie di immagini in una posizione sulla sezione che contiene strutture a contrasto elevato.
   2. Impostare la serie di immagini su 1024 x 884 pixel e scegliere una dimensione in pixel corrispondente alla risoluzione più alta utilizzata nella serie di immagini impostata nei passaggi precedenti. Nell'elenco delle funzioni automatiche, selezionare Messa a fuoco automatica e Auto Stigmator.
   3. Selezionare Per sezione nei controlli della sequenza di acquisizione e assicurarsi che l'immagine delle funzioni automatiche sia il primo elemento dell'elenco. Avviare l'acquisizione dell'immagine facendo clic sul pulsante Esegui accanto al segnale di processo. Queste procedure sono illustrate in Materiale supplementare,pagine 22-23.
      NOTA: non è necessario pre-focalizzare manualmente su ogni sezione. Durante la sessione di registrazione, ogni volta che il microscopio avanza in una nuova sezione, le funzioni automatiche verranno eseguite prima che tutte le altre immagini vengano registrate in questa sezione.

4. Allineamento e analisi dei dati

1. Esportazione dei dati
   1. Assicurati che i dati vengano salvati in formato .tif, quindi non è necessaria una funzione di esportazione dedicata. Ordinare i dati in una struttura di cartelle che corrisponda direttamente ai livelli e agli elementi nell'albero dei livelli.
   2. Una volta registrati i mosaici di immagini, utilizzare la funzione StitchAll per cucire automaticamente tutte le tessere.
2. Allineamento e ritaglio dello stack nelle Figi
   NOTA. Molti pacchetti software (gratuiti e commerciali) possono essere utilizzati per lavorare con i dati della tomografia array. I passaggi seguenti sono mostrati con il programma open source Fiji³² perché è ampiamente disponibile e contiene tutte le funzioni richieste.
   1. Importa una pila di immagini (o immagini cucite) nelle Figi come pila virtuale.
   2. Se il contrasto/luminosità deve essere normalizzato, scegli Contrasto avanzato... dal menu Processo. Impostate Pixel saturi su 0.1 o inferiore e selezionate Elabora tutte le sezioni.
   3. Dal menu Plugin, scegli Registrazione | Allineamento lineare dello stack con SIFT.
   4. Selezionate Rigido (Rigid) o Affine (Affine) dal menu a discesa Trasformazione prevista (Expected Transformation). In caso contrario, mantenere le impostazioni predefinite. Avviare l'allineamento facendo clic su OK.
      NOTA: il caricamento dei dati come Virtual Stack consente a Fiji di gestire stack di qualsiasi dimensione. L'output dell'allineamento viene creato nella RAM; tuttavia, ciò può limitare la dimensione massima degli stack che possono essere elaborati. In tal caso, utilizzare Register Virtual Stack Slices, che è un'implementazione da cartella a cartella dello stesso algoritmo di registrazione. Una volta completata la registrazione, caricare i dati di output come stack virtuale.
   5. Ritaglia lo stack di immagini facendo clic su Ritaglia in modo che contenga solo il ROI.
   6. Salvare lo stack come immagine singola .tif o serie di immagini .tif.
      NOTA: i passaggi critici della tomografia ad array sono illustrati nella Figura 3.

Results

Gli esempi riportati di seguito mirano a dimostrare la versatilità dei flussi di lavoro consigliati. Le illustrazioni del caso di studio sono progetti per i quali abbiamo avuto difficoltà ad ottenere risultati soddisfacenti con qualsiasi altra tecnica. Abbiamo scelto Drosophila adult per illustrare le sfide tipiche che si potrebbero incontrare con numerosi tipi di campioni. Questo organo tubolare di circa 6mm di lunghezza, 500-1000 μm in sezione trasversale, è diviso in diverse regioni con una funzione unica e composizione cellulare (Figura 4A)³³. A seconda dell'orientamento del sezionamento, le dimensioni del profilo intestinale e il suo aspetto sulla sezione variano. Le sezioni orientate trasversalmente o longitudinalmente sono relativamente grandi e solo un paio possono essere posizionate su una singola griglia TEM (Figura 2F). Solo una piccola parte del tessuto può essere ripresa nel FIB e per l'SBF-SEM, la difficoltà è simile a qualsiasi campione non omogeneo. AT fornisce un compromesso efficiente per l'analisi di tali campioni e l'incorporamento piatto facilita la localizzazione del ROI. Un'attenta rifilatura dell'eccesso di resina intorno all'area selezionata (Figura 4B) è importante per una raccolta efficiente degli array dall'area pertinente (Figura 4C). Centinaia di sezioni possono essere raccolte su un singolo wafer in sequenza o casualmente (Figura 4D). A seconda della domanda di ricerca, lo screening e l'acquisizione del campione richiederanno una strategia diversa, che abbiamo arbitrariamente diviso in diversi scenari. Per illustrare diversi scenari presentati in modo più mirato, abbiamo scelto diversi casi di studio dal diverso progetto di ricerca.

Analisi di numerose strutture di grandi dimensioni distribuite casualmente nell'intervallo 1-10 μm (Figura 4E)
Spesso, sono necessari dati ultrastrutturali per convalidare un'ipotesi nata da diversi approcci sperimentali, confrontando una condizione standard e sperimentalmente alterata. In questi casi, diverse sezioni vengono in genere raccolte casualmente su griglie e schermate per localizzare e visualizzare le aree di interesse. Questa tattica è di solito meno sistematica e limitata a un piccolo numero di sezioni analizzate. Suggeriamo di registrare panoramiche di decine / centinaia di sezioni a media risoluzione da un determinato nastro (Figura 4D). Per sezioni tipiche di 70 nm, 200 sezioni si estenderanno su circa 14 μm, che conterranno numerose celle, interamente o parzialmente, completate entro mezz'ora. Come primo passo, viene registrata la panoramica a bassa risoluzione dell'intero nastro e la panoramica aiuta a omettere le sezioni che mostrano artefatti di preparazione (ad esempio, pieghe, sporco). Successivamente, l'acquisizione può essere eseguita manualmente o automaticamente direttamente su parti selezionate della sezione, o su un'intera sezione, utilizzando l'imaging singolo o a mosaico, seguito da cuciture (Figura 4E). Successivamente, le immagini dell'area selezionata possono essere acquisite utilizzando parametri ad alta risoluzione. Ad esempio, mitocondri, nuclei e microvilli possono beneficiare di un tale metodo statisticamente migliorato (Figura 4Ei-iii).

Analisi di più strutture piccole e scarsamente distribuite nell'intervallo 500-1.000 nm (Filmato supplementare 1)
In questo scenario, il ROI non può essere semplicemente identificato in una scansione panoramica a basso ingrandimento e sono necessarie immagini ad alta risoluzione. Nei campioni TEM convenzionali, il noioso zoom avanti e indietro della sezione è necessario fino a quando non viene trovata la funzionalità richiesta. Spesso, l'imaging di diverse posizioni indipendenti in più campioni è statisticamente più rilevante rispetto alla generazione di un singolo grande volume. In questi casi, la complessità dell'acquisizione manuale cresce esponenzialmente. Sebbene diverse soluzioni TEM consentano l'acquisizione automatica o lo screening di più griglie, le dimensioni della griglia e le sfide di sezionamento seriale spesso rendono l'approccio incompatibile per molti campioni. Per casi simili, generiamo una mappa completa a media risoluzione di un ROI complessivo in più sezioni a una risoluzione sufficiente a identificare le strutture di interesse. Durante questa fase di screening laterale, è consigliabile saltare più sezioni alla volta, con l'obiettivo di colpire almeno una parte della struttura di interesse quando viene affrontata in modo casuale. Ciò dipenderà in gran parte dalle dimensioni generali della struttura: ad esempio, se la dimensione complessiva della struttura è di 500 nm e le sezioni hanno uno spessore di 50 nm, almeno nove sezioni sequenziali di fila conterranno probabilmente una parte della struttura di interesse. In questo modo, il salto di 6-7 sezioni deve essere efficiente per trovare molti tipi diversi di strutture in più aree. L'acquisizione automatica delle mappe a mosaico risolte delle sezioni selezionate consente un attento screening di queste sezioni dopo la loro acquisizione. Una volta acquisita una mappa ad alta risoluzione, è possibile ritagliare diversi ROI o utilizzarli per definire ulteriori aree di imaging locale sui ROI (Filmato supplementare 1). Golgi, centrioli, giunzioni, microtubuli, diversi tipi di vescicole sono buoni esempi delle strutture che potrebbero beneficiare di questo scenario (Filmato supplementare 1).

Analisi di GRANDI ROI scarsamente distribuiti in campioni di grandi dimensioni (Figure 4F-4H)
Questo scenario comporta eventi rari, che sono spesso descritti come "un ago in un pagliaio" in cui il problema non è nell'identificazione del ROI ma nella sua localizzazione. Per molti campioni l'approccio correlativo non è un'opzione valida, ma spesso il ROI ha un'ultrastruttura rivelatrice e, se localizzato, può essere identificato con elevata affidabilità. Per questi campioni, è essenziale applicare l'acquisizione multilivello, a partire dai campioni pre-selezionati con decine o centinaia di sezioni a media risoluzione. Nel software utilizzato qui, ci sono due diverse strategie per ottenere set di immagini di più sezioni: Registrazione delle immagini di anteprima a una risoluzione più elevata o acquisizione di un Set di tile array con impostazioni appropriate (Figura 4F). Diversi tipi di cellule specializzatenell'intestino di Drosophila sono distribuiti in modo casuale (ad esempio cellule staminali, enteroendocrine) e sottili sezionati a orientamento casuale. Eppure possono essere visivamente distinti dopo aver esaminato le immagini ottenute utilizzando parametri ad alta risoluzione sia da singole sezioni che come raccolta di immagini seriali (Figura 4G). Dopo l'allineamento, gli stack possono essere renderizzati utilizzando diverse soluzioni software(Figura 4H,Filmato supplementare 2).

Scenario 1: organoidi intestinali (Figura 5A)
Gli organoidi stanno rapidamente diventando uno degli strumenti più all'avanguardia delle moderne scienze della vita. Questo modello di organo derivato da cellule staminali 3D quasi fisiologico rende possibile uno studio accurato di una serie di processi biologici in vivo, tra cui il rinnovamento dei tessuti, la risposta ai farmaci e la medicina rigenerativa. I mini-tubi intestinali³⁴ introdotti di recente aprono una nuova generazione di tecnologia organoide, molto simile alla fisiologia dei tessuti in vivo, alla composizione del tipo cellulare e all'omeostasi, consentendo ampie prospettive per la modellazione della malattia, l'interazione ospite-microbo e la scoperta di farmaci. Tuttavia, quando è richiesta la caratterizzazione ultrastrutturale, la localizzazione di diversi tipi di cellule in tessuti così grandi utilizzando campioni casuali può essere difficile. Inoltre, nei test di "infezione" variabili, è fondamentale assicurarsi che l'analisi riveli diversi stadi di sviluppo che influenzano il tessuto. Per tali studi, la copertura statisticamente significativa del campione è centrale, ma difficile da ottenere utilizzando il tradizionale approccio TEM on-grid. AT-scenario 1 è utile in questi casi: molte sezioni sequenziali possono essere generate su un wafer (Figura 5Aii) e schermate utilizzando parametri a bassa risoluzione per localizzare le aree generali di interesse (Figura 5Aiii; frecce). Queste aree possono essere mirate per ulteriori analisi utilizzando parametri di acquisizione avanzati (Figure 5Aiv e Figura 5Av). Quando viene rilevata una struttura rilevante (in genere un cluster di 5-10 sezioni una volta ogni 100-300 sezioni), è facile concentrarsi su ciascuna delle strutture di interesse e acquisire manualmente singole immagini o utilizzare le funzionalità di automazione per acquisire volumi di immagini su più sezioni.

Scenario 2: Drosophila pupal notum ( Figura5B)
Studiare la divisione cellulare e i meccanismi che controllano la progressione attraverso il ciclo cellulare è fondamentale per comprendere sia i processi standard che quelli alterati negli organismi multicellulari. Le informazioni esistenti sono spesso derivate da sistemi unicellulari; tuttavia, questa soluzione manca del contesto critico delle interazioni 3D tra le cellule di un tessuto. Un monostrato monocellulare del notum, il dorso in via di sviluppo della larva di Drosophila, è un modello perfetto per l'interazione tra le cellule epiteliali in generale e la divisione cellulare in particolare³⁵. È un modello consolidato per studi di interazioni molecolari e cellulari che utilizzano la combinazione dei dati disponibili mediante microscopia fluorescente e manipolazioni genetiche. L'ascissione, l'ultimo passo della divisione cellulare, assicura la separazione finale tra due cellule che si dividono e caratterizzare i cambiamenti strutturali che si verificano durante l'abscissione è essenziale per la nostra comprensione della mitosi. Tuttavia, le divisioni mitotiche nel notum non sono facili da localizzare a livello ultrastrutturale: le cellule sono relativamente grandi, rispetto alla zona di abscissione (Figura 5B). Il rapporto tra la dimensione complessiva della zona di abscissione e la superficie della sezione da coprire è ampio (Figura 5Bi). Anche se è possibile localizzare la zona di abscissione utilizzando i metodi TEM o SBF-SEM³⁶, il compito è laborioso. Con questo scenario, le immagini di panoramica automatica a media risoluzione dei salti di 20-40 sezioni possono essere utilizzate per localizzare le celle in divisione (Figura 5Bii). Quando tali celle vengono identificate, le sezioni fungono da ancoraggio per un esame più attento delle sezioni nelle vicinanze e numerose celle divisorie possono essere trovate e selezionate per ulteriori analisi. In questo modo, la zona di abscissione può essere localizzata e fotografata nella sua interezza (Figura 5Biii). A seconda della domanda, è possibile raccogliere singole immagini ad alta risoluzione o 3-7 sequenze di immagini per coprire la profondità della struttura (Figura 5Biv).

Scenario 3: neuroni taniciti di topo (Figura 5C)
Il topo fornisce un modello ben consolidato per lo sviluppo del cervello ed è ben documentato su diversi livelli, anche da EM. Anche se diversi metodi automatizzati seriali-block-face sono stati ampiamente utilizzati per studiare il tessuto cerebrale, ci sono casi in cui AT è più adatto a raccogliere i dati necessari. L'ipotalamo è un modello di neuroscienza ben consolidato, una parte del cervello che contiene più funzioni di tipo neuronale. I taniciti ipotalamici rappresentano un particolare sottoinsieme di cellule ependimogliali che rivestono il fondo del terzo ventricolo, con processi insolitamente lunghi (fino a 300 μm) e grandi piedini terminali (~5 μm)³⁷. Questo li rende scomodi per l'analisi con metodi TEM o FIB. Il compito è ulteriormente complicato quando diversi taniciti indipendenti devono essere localizzati e analizzati. Uno degli approcci per facilitare questo compito può essere il targeting semi-correlativo, in cui la mappa di fluorescenza è ottenuta dai campioni etichettati fluorescentemente prima del fissaggio e dell'incorporamento per EM. Il sezionamento viene eseguito sull'area catturata combinando le informazioni posizionali del campione di fluorescenza e la replica in plastica piatta incorporata. Successivamente, è possibile utilizzare lo scenario AT 3: vengono generate le immagini a mosaico panoramiche di alto livello per rivelare le regioni con cluster di piedi terminali di tanycyte. Successivamente, le funzionalità di automazione nel software vengono utilizzate per impostare l'acquisizione di sequenze delle immagini da una o più aree in una singola immagine o in modalità piastrellata. Queste immagini possono essere analizzate separatamente, come pile allineate o renderizzate successivamente.

La potenza del metodo AT consente l'"aggiornamento" relativamente semplice dei dati da 2D a 3D: le mappe sono disponibili dall'acquisizione primaria e i volumi possono essere ottenuti dall'area selezionata e dalle sue vicinanze. Lo stack risultante può essere allineato e successivamente sottoposto a rendering. È essenziale determinare in anticipo quale risoluzione e qualità dell'immagine sono necessarie per trovare i ROI. L'imaging dovrebbe consentire di riconoscere i ROI, ma non oltre questo valore perché il tempo di acquisizione scala proporzionalmente al tempo di permanenza dei pixel e al quadrato inverso della dimensione dei pixel.

Figura 1: Sfide della preparazione del campione EM e dell'acquisizione del volume. (A) La perdita di fluorescenza e il restringimento si verificano a causa di un'elevata concentrazione di metalli pesanti e della disidratazione durante la preparazione del campione. i) Un disegno schematico di un campione osservato sotto LM (ii) lo stesso campione preparato per EM, che diventa completamente opaco e perde circa il 10% del suo volume. (B) L'incorporamento del campione viene in genere effettuato utilizzando resine epossidiche o acriliche. I blocchi tradizionali (i) possono essere utilizzati con successo per campioni omogenei che non richiedono un particolare orientamento. I blocchi piatti (ii) sono utili quando è essenziale mirare e orientare al microscopio, un'area precisa finalizzata al sezionamento, ad esempio in campioni non omogenei o procedure di microscopia correlativa. (C) Dell'intero volume del campione, solo una frazione limitata è rappresentata su una singola sezione di 50 nm, fornendo un'immagine 2D di un campione 3D, spesso in un orientamento sconosciuto. (D) Per illustrare il problema della registrazione di volumi eccessivamente grandi rispetto al targeting preciso, abbiamo scelto tre cubi concentrici con le facce di 1000, 500 e 50 μm organizzati per includere un ipotetico campione di 1000 x 500 x 500 μm (marrone scuro). Se tali ipotetici cubi campione sono accuratamente sezionati con fette da 50 nm, per coprire l'intero volume, saranno necessari un totale di 20.000, 10.000 e 1.000 fette e 800 tb, 100 tb e 100 gb, di conseguenza (risoluzione di imaging 5 nm x 5 nm x 50 nm, dati a 8 bit). Ciò dimostra l'importanza di pianificare l'acquisizione dei dati EM solo per acquisire il volume minimo necessario. (E) Coprire un'ampia superficie del campione in alta risoluzione presenta un problema simile a quello di un grande volume. Il affiancamento di diverse immagini ad alta risoluzione in una sola è una soluzione utile per un tale problema. Tuttavia, per coprire una superficie di 1 mm x 1 mm utilizzando il telaio 2024 x 1048 con ingrandimento 10.000x sarà necessario un vasto numero di piastrelle, che possono diventare difficili da cucire. Inoltre, se le sezioni sono compresse o distorte in modo variabile durante il taglio, le pile di dati risultanti diventano quasi impossibili da allineare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il flusso di lavoro per la generazione diretta delle matrici di sezioni su supporto di grandi dimensioni. (A) Per il taglio stretto utilizzando lo strumento di taglio, i blocchi sono fissati all'interno del supporto microtome. Questo passaggio aiuta a garantire i lati paralleli di un blocco e riduce anche la resina vuota attorno al campione. (B) Un coltello modificato per le acquisizioni di sezioni AT. Una barca di grandi dimensioni facilita il trasferimento delle sezioni e la loro manipolazione durante il sezionamento del campione e il trasferimento sul supporto. Un grande bacino consente la manipolazione delle sezioni; il sistema di drenaggio limita il movimento dei nastri durante la fase di drenaggio, il fondo piatto rende affidabile l'asciugatura graduale del supporto. (C) Il coltello, pronto per il sezionamento con un wafer scaricato a bagliore posto sul fondo della bacinella e acqua livellata ai bordi. La costruzione del coltello mantiene l'ago incorporato, senza interferire con il supporto. (D) Generazione di array, vista dall'alto sull'area di sezionamento del microtomo. (i) Le prime sezioni sono di solito facili da ottenere in quanto si attaccano l'una all'altra e formano un nastro regolare. (ii) Quando più sezioni vengono aggiunte al nastro e diventa più lungo, il nastro perde la sua stabilità e spesso si curva. È fondamentale mantenere le tracce della sequenza organizzate in sequenza in preparazione per la fase di acquisizione dell'immagine. (iii) Quando un nastro di sezioni raggiunge la lunghezza desiderata, viene accuratamente staccato dal bordo del coltello usando una ciglia. iv) l'acqua viene drenata dal bacino; il wafer rimane all'interno fino a quando non è completamente asciutto all'aria. Questo passaggio è essenziale, in quanto aiuta a raddrizzare le sezioni ed evitare la formazione delle micro pieghe. Il wafer viene posto in forno a 60°C per almeno 30 min per fissare le sezioni sul supporto. (E) Esempi di wafer con le sezioni trasferite. Sebbene sia conveniente ottenere nastri dritti e precisi, i campioni reali impediscono la formazione di nastri ideali nella maggior parte dei casi. Tuttavia, anche i nastri "sciatti" sono molto istruttivi per il vasto numero di casi e l'importanza del nastro "pulito" dipenderà da una strategia di ricerca per la quale vengono raccolte le sezioni. Scala a barre 1 cm. (F) Esempio di griglie di slot con le sezioni seriali. Anche quando molte sezioni sono raccolte su una griglia, è ancora una piccola frazione di ciò che può essere raccolto su un singolo wafer. L'abilità richiesta per padroneggiare il trasferimento delle sezioni su una griglia (in particolare la griglia a fessura) ha rappresentato un collo di bottiglia significativo per la padronanza della preparazione del campione al microscopio elettronico. Scala bar 500 μm. (G) Indipendentemente dal metodo di raccolta delle sezioni utilizzato, i punti di forza dell'approccio AT sono la relativa facilità di generazione di sezioni sequenziali, rispetto alla raccolta on-grid. Se si considera un blocco campione di 1000 μm x 500 μm, non vi è alcun problema a montare circa 100 sezioni su un wafer di 2 cm x 4 cm (i). Le sezioni della stessa dimensione su una griglia di slot si adattano solo a tre sezioni/griglia al massimo (ii). Forniamo un'immagine in scala per mostrare quante griglie potrebbero essere necessarie per coprire lo stesso numero di sezioni, senza menzionare la difficoltà di raccogliere sezioni seriali sulla griglia. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Passaggi critici del flusso di lavoro della tomografia array. Schema del flusso di lavoro per l'acquisizione automatica di stack di immagini ad alta risoluzione. Tutti i passaggi preparatori sono automatizzati (simboli di ingranaggi verdi) e non richiedono alcuna azione da eseguire manualmente, sezione per sezione. Le pile di immagini possono essere allineate in qualsiasi software di analisi delle immagini in grado di allineare automaticamente rigidi o affini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tre scenari di acquisizione con Drosophila adult gut come modello dimostrativo. (A) disegno di una Drosophila midgut sezionata, con tre regioni principali designate da diversi colori: anteriore, centrale e posteriore. (B) Blocco piatto rifilato in cui un budello è orientato per il sezionamento trasversale. Si noti che la quantità di resina vuota è attentamente bilanciata attorno al tessuto contenente la regione di interesse (rettangolo bianco). (C) Le sezioni seriali trasversali galleggiano sulla superficie dell'acqua all'interno del bacino del coltello AT. Tutte le immagini sono state acquisite in modalità SEM elettronica secondaria utilizzando il rilevatore a specchio con il contrasto inverso. (D) Immagine a mosaico cucita di sezioni seriali trasversali su un wafer. La barra della scala è di 1000 μm. (E) Sezione trasversale attraverso l'intestino di Drosophila. Scala bar 20 μm. L'immagine è un mosaico cucito di 7 x 7 immagini di fascia media. Inserti - immagini a ingrandimento e risoluzione più elevate delle regioni specifiche di interesse: (ii) nucleo, (iii) bordo del pennello e (i) mitocondri. Scala bar 5 μm per tutti. (F) Un'immagine a medio raggio di una sezione trasversale attraverso l'intestino che prende di mira la posizione delle cellule in via di sviluppo (quadrato). La barra di scala è di 20 μm. (G) L'array mirato di sezioni seriali raccolte in base all'area localizzata durante l'analisi della sezione presente nel pannello F. La barra della scala è di 10 μm. (H) Il modello 3D viene renderizzato in base alla sequenza di stack di 50 sezioni ottenuta dall'acquisizione seriale mirata nel pannello G. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Casi di studio per gli scenari di applicazione dell'AT. (A) Localizzazione di diverse strutture cellulari nell'organoide intestinale. (i) Microchip di silicio incorporato. Barra della scala = 200 μm. (ii) Un'immagine a mosaico cucita di 127 sezioni trasversali attraverso la parte centrale del chip. Barra di scala = 1500 μm (iii) Quattro immagini a bassa risoluzione di una sezione trasversale completa attraverso la porzione dell'organoide intestinale. Le frecce indicano il potenziale sito di interesse. La barra di scala è di 20 μm. (iv) Diversi ROI, mirati su micrografie a bassa risoluzione selezionate per ulteriori analisi. Barra di scala = 10 μm. (v) Immagine ad alta risoluzione della cellula infetta di interesse. L'analisi della stessa regione nelle sezioni adiacenti può fornire informazioni 3D mirate, se necessario. Scala bar = 5 μm. (B) Localizzazione midbody in Drosophila melanogaster pupal notum. (i) Una visione schematica di una pupa di Drosophila sezionata. Notum esposto per la dissezione (beige) dopo aver rimosso la parte della cuticola protettiva (marrone). La linea nera indica la direzione di sezionamento (ii) Una sezione trasversale attraverso l'area presentata nel diagramma. L'immagine combina immagini SEM ad alta risoluzione scattate in sequenza 3x7 cucite su un pannello a mosaico. Il rettangolo nero delimita l'area che contiene una cella in divisione. La barra della scala è di 15 μm. (iii) Un'immagine ingrandita sulla cella divisoria dal pannello ii. A questo ingrandimento e risoluzione, il midbody è evidente (frecce bianche). L'intera sezione viene analizzata per trovare le celle in divisione. Saltare tra diversi nastri di sezioni in intervalli di 20-30 sezioni durante la fase di screening laterale consente di localizzare numerose coppie di cellule divisorie. La barra della scala è di 5 μm (iv) quando una cella divisoria è localizzata, immagini sequenziali del midbody raccolte da quattro sezioni intorno al midbody delimitate da un quadrato giallo nel pannello (iii). La barra della scala è 1 μm. (C) Localizzazione dei piedi terminali dei tanyciti nell'ipotalamo di topo. (i) Immagine di fluorescenza di una fetta di vibratoma. I tanycytes esprimono la proteina fluorescente tdTomato (rossa). Un rettangolo bianco delimita l'area di interesse. Scala bar 500 μm. (ii) La stessa sezione di vibratoma preparata per EM sarà accuratamente tagliata intorno all'area di interesse, in base alla correlazione indiretta delle informazioni fluorescenti dal pannello (i). La linea bianca tratteggiata rappresenta l'area di sezionamento ultrasottile. La barra della scala è di 50 μm per entrambi i pannelli. (iii) Sezione trasversale attraverso la fetta di vibratome nell'area di interesse. L'immagine del mosaico SEM è composta da 75 immagini cucite. Diverse sezioni sono prese di mira dallo screening laterale e fotografate con parametri simili. Le sezioni vengono analizzate "offline" per trovare il ROI - l'endfeet dei tanycyte. Il rettangolo nero rappresenta l'area che contiene le estremità dei tanycyte. Questa sezione servirà da ancoraggio per ulteriori analisi. La barra della scala è di 15 μm. (iv) Immagine ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento degli occhi dei tanycyte che circondano un vaso sanguigno. Dopo la localizzazione iniziale del ROI su una sezione, la sequenza z viene raccolta dalle sezioni adiacenti a monte della sezione di ancoraggio (pannello iii). Barra della scala 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: I problemi durante l'ultra-microtomia, la raccolta delle sezioni e lo stoccaggio delle sezioni possono portare a artefatti. (A) Sezioni di campioni di cervello su un wafer. La maggior parte della resina vuota si staccò dal tessuto e si ripiegò su se stessa (seppia). La casella nera tratteggiata indica un'area utilizzata per contenere l'intera sezione. Scala bar 500 μm. (B) Una piccola piega locale sulla superficie di una sezione di zebrafish spessa 50 nm. Scala barra 1 μm. (C) Segno di coltello sulla superficie di una sezione cerebrale di topo a 70 nm. Scala barra 5 μm. (D) I capelli (asterisco) sulla superficie del wafer che copre parzialmente una sezione muscolare di zebrafish. In giallo, il tessuto è mirato per l'analisi. In rosa, una cella utilizzata come riferimento per le dimensioni dell'area interessata. Scala barra 50 μm. (E) Zebrafish notochord con rughe in basso a destra (frecce nere), dove il tessuto neurale denso (ombreggiato in blu) confina con tessuto muscolare più morbido e resina vuota (frecce nere). Scala bar 10 μm. (F) Segmentazione del volume di una pila di 50 immagini come in E, mostrando che questa regione ha mostrato rughe nella maggior parte delle sezioni. Il poligono tratteggiato delinea l'area mostrata nella barra della scala G. 10 μm. (G) XY vista della stessa segmentazione del volume come in F, mostrando le rughe come brevi tratti neri nella metà destra del blocco. Si noti che l'allineamento della pila nelle parti rimanenti del tessuto non è influenzato dalle rughe. Scala barra 5 μm. (H) Proiezione XZ della stessa area di G, che mostra le rughe in tutte le 50 sezioni. Barra della scala 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato supplementare 1: Un'immagine di montaggio ad alta risoluzione di una sezione trasversale attraverso il midgut anteriore di Drosophila. Immagine a mosaico di un'immagine SEM SE-MD invertita. 352 tessere immagine separate sono state acquisite automaticamente a 5 nm di risoluzione e cucite per presentare l'intera sezione trasversale. È possibile ingrandire per maggiori dettagli e ottenere una copertura esaustiva dei dati, utilizzando la stessa immagine. Giunzioni strette, microtubuli, diversi tipi di vescicole possono essere quando si ingrandisce. La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per scaricare questo filmato.

Filmato supplementare 2: Rendering delle cellule intestinali di Drosophila. Cinquanta immagini a mosaico allineate delle sezioni nell'area di divisione delle cellule intestinali. Rendering IMOD dei bordi cellulari (blu, turchese e arancione) e dei nuclei (bianco). Clicca qui per scaricare questo film.

Materiali supplementari. Fare clic qui per scaricare questo file. 

Discussion

La microscopia elettronica fornisce informazioni sull'ultrastruttura delle cellule e degli organismi, per i quali è spesso auspicabile visualizzare strutture di interesse nel loro contesto tridimensionale. Nonostante le numerose tattiche EM per l'analisi ultrastrutturale, non esiste ancora una soluzione "gold standard". Il motivo principale è l'ampia varietà di campioni, molte domande biologiche, che spesso richiedono un approccio su misura. Il flusso di lavoro AT proposto è progettato per ridurre al minimo il tempo necessario per l'elaborazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, la valutazione e l'archiviazione. Inoltre, il coltello modificato fornisce uno strumento utile per semplificare l'acquisizione dell'array. Il layout compatto delle sezioni sui wafer è conveniente, sia per l'osservazione che per la successiva conservazione dei campioni. Questa disposizione consente lo "screening laterale" dei campioni spostandosi orizzontalmente da un nastro all'altro e scansionando solo una sezione su ciascuno, riducendo significativamente il tempo necessario per localizzare un ROI. Gli scenari di acquisizione dati proposti facilitano il targeting di aree piccole e distribuite in modo casuale. Una volta trovato, AT/SEM limita l'imaging ad alta risoluzione esattamente al volume di interesse, sia che venga eseguito manualmente o con l'aiuto della funzione automatica. L'AT per volumi limitati può essere completato manualmente, con l'operatore che naviga attraverso il campione e definisce le regioni di imaging una per una. Il modulo automatizzato del software fornisce una strategia flessibile di acquisizione delle immagini per l'imaging di piccole aree su sezioni di grandi dimensioni. L'automazione in questo software consente di registrare immagini ad alta risoluzione di grandi dimensioni su centinaia di sezioni, raggiungendo volumi simili a SBFI. La registrazione delle immagini panoramiche di tutte le sezioni semplifica la localizzazione del ROI e riduce il tempo trascorso al microscopio. Poiché le sezioni non vengono danneggiate durante la registrazione di panoramiche e anteprime ad alta risoluzione, AT/SEM consente di riutilizzare il campione per raccogliere ulteriori dati di altri ROI o a una risoluzione più elevata.

Il tempo di acquisizione delle immagini è uno degli aspetti più importanti (e più costosi) dell'EM 3D e dovrebbe quindi essere considerato nella progettazione dell'esperimento. Sebbene non sia sorprendente che l'imaging di grandi aree richieda più tempo rispetto all'imaging di piccole aree, è facile sottovalutare l'impatto: a seconda dei parametri di imaging selezionati, il tempo di acquisizione su ciascuna sezione può variare da secondi a ore. I parametri di imaging critici includono la dimensione del campo visivo, la risoluzione e il tempo di permanenza. Supponendo una risoluzione target di 10 nm per pixel e un tempo di permanenza di 1 μs, l'imaging di un campo di 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm o 500 μm x500 μm richiede 4 secondi, 100 secondi o 2.500 s per registrare. Possiamo moltiplicare questi tempi di imaging per sezione per il numero di sezioni per stimare il tempo necessario per il lavoro di imaging completo. Lunghi tempi di imaging per sezione possono essere accettabili se il numero di sezioni è piccolo o se il tempo dello strumento del microscopio non è preoccupante.

Tuttavia, è necessario limitare il tempo di registrazione a un lavoro notturno o a un lavoro nel fine settimana nella maggior parte dei casi. Un aspetto altrettanto critico dell'EM 3D che dovrebbe essere considerato, è la quantità e la struttura dei dati di immagine risultanti. La registrazione dei campi di imaging sopra menzionati in 100 sezioni genera rispettivamente 400 MB, 10 GB o 250 GB di dati immagine; le immagini da 500 μm x 500 μm pongono il problema aggiuntivo di essere più grandi di 2 gb ciascuna. Molti dei programmi software utilizzati per la valutazione dei dati non possono aprire immagini di queste dimensioni.

Per ridurre il tempo di imaging, è importante scegliere il tempo di permanenza dei pixel per soddisfare i requisiti del rapporto segnale-rumore per la successiva valutazione dei dati (ad esempio, ricostruzione, tracciamento) e limitare le registrazioni a ROI definiti. L'estensione AT del software facilita l'acquisizione di immagini in piccole aree in sezioni seriali. Il software supporta flussi di lavoro manuali e automatici e molte varianti semi-automatiche: le aree di imaging possono essere posizionate manualmente e focalizzate su ciascuna sezione, oppure l'utente può utilizzare il cercatore automatico di sezioni e le funzioni di allineamento della posizione. A seconda del livello di automazione scelto e supportato dal tipo di campione o dagli obiettivi di imaging, il tempo necessario per impostare l'acquisizione delle immagini in centinaia di sezioni può richiedere un'intera giornata lavorativa (eseguita manualmente) o solo pochi minuti. In linea di principio, la tomografia array rende più difficile rispetto ad altri metodi EM 3D acquisire piccoli ROI; il posizionamento impreciso della regione su sezioni consecutive deve essere compensato acquisendo aree più ampie. Ad esempio, se il ROI è di 20 μm x 20 μm e la variabilità di posizione da sezione a sezione dei campi di imaging è di 10 μm, è necessario acquisire immagini da 40 μm x 40 μm per essere sicuri che il ROI sia completamente catturato in ogni immagine, su ogni sezione. La variabilità della posizione dell'immagine nel mondo reale varia da 100 μm a < 10 μm a seconda della disponibilità o della qualità delle funzionalità software per l'allineamento della posizione o della pazienza dell'utente. Con questo software, è possibile ottenere 10 μm senza troppi interventi manuali nella maggior parte dei campioni.

Come ogni tecnica, l'AT ha diversi punti deboli che possono influenzare l'acquisizione dei dati di successo e molti sono simili ad altri metodi basati sul sezionamento. La mancanza di una distribuzione omogenea della resina vuota rispetto al tessuto può causare matrici curve o rotte. In casi estremi, le sezioni possono staccarsi dal supporto (Figura 6A). La compressione variabile o lo stiramento durante il processo di taglio possono creare pieghe che possono interrompere il campione in regioni variabili nelle sezioni successive (Figura 6B). I segni dei coltelli possono apparire sulla superficie delle sezioni raccolte utilizzando un coltello danneggiato (Figura 6C). Le differenze nelle condizioni di sezionamento possono indurre occasionali compressioni di sezione e differenze di spessore. Particelle di polvere o sporco possono atterrare su una sezione e oscurare parzialmente la zona di interesse (Figura 6D). L'acquisizione delle immagini può fallire a causa delle funzioni imperfette di contrasto automatico, messa a fuoco automatica e auto-stigmatizzazione. Il posizionamento delle aree di imaging create automaticamente può essere variabile e potrebbe non riuscire a catturare il ROI in tutte le sezioni.

Diversi problemi possono sorgere nella fase di cucitura e allineamento. La cucitura automatica delle acquisizioni di tessere di mosaico può fallire, ad esempio, a causa del grande spazio vuoto all'interno del campione. A causa di un drastico cambiamento di forma in 3D, le pile di immagini possono essere difficili da registrare. Programmi appositamente sviluppati (ad esempio, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB o MAPS-AT) possono facilitare l'allineamento semi-automatico^32,38,39,40. Le sezioni più impegnative possono essere allineate manualmente utilizzando un software di fotoritocco. Sfortunatamente, alcuni set di dati potrebbero essere impossibili da allineare correttamente.

Campioni di grandi dimensioni sono difficili per le sezioni seriali TEM che si adattano alle griglie; d'altra parte, molti progetti non giustificano lunghe acquisizioni automatiche utilizzando FIB/SEM o SBF-SEM. L'AT è un'alternativa semplice a una noiosa sezione seriale TEM in cui la raccolta e la manipolazione di sezioni seriali su un wafer sono più semplici rispetto alle griglie di slot. Sono state sviluppate diverse strategie per facilitare la raccolta degli array e condividiamo il nostro metodo per espandere il toolkit esistente. Nei casi in cui l'identificazione del ROI è impegnativa, AT-SEM fornisce un vantaggio fondamentale, con lo screening efficiente dei campioni in cui è richiesta una risoluzione su scala organello su 50-500 sezioni. Per volumi maggiori, le strategie AT di raccolta automatica possono essere raccolte in modo efficiente se sono necessarie più sezioni. I campioni AT possono essere ripresi più volte, facilitando l'imaging mirato di aree ad alta risoluzione basate su immagini panoramiche acquisite in precedenza. Riteniamo che l'analisi mirata e il sovracampionamento ridotto da parte di AT / SEM qui proposti riducano i requisiti di manodopera e archiviazione dei dati. In definitiva, le biblioteche di sezioni possono essere raccolte e mantenute per un successivo riutilizzo e consultazione. Per l'acquisizione di volumi, gli approcci FIB o SBF-SEM offrono una soluzione eccellente ogni volta che il ROI è facile da identificare sulla faccia del blocco o se sono necessari grandi volumi 3D per l'analisi. Tuttavia, FIB/SBF-SEM sono meno efficienti quando l'immagine dello stack ad alta risoluzione deve essere raccolta da un ROI definito in modo mirato. Per concludere, i metodi proposti per lo screening dei campioni AT e l'uso di immagini panoramiche a media risoluzione consentono di limitare l'acquisizione delle immagini alle parti rilevanti dell'array di sezioni. La mira precisa delle regioni di imaging accelera il time-to-data e semplifica la valutazione dei dati.

In sintesi, sebbene il concetto di AT/SEM non sia nuovo, il suo uso non è ancora così diffuso come suggerirebbero i suoi meriti. Nel complesso, fornisce una procedura complementare ad altri metodi EM esistenti. AT/SEM è compatibile con la più ampia gamma di protocolli di preparazione dei campioni e flussi di lavoro di imaging e può essere eseguita su qualsiasi microscopio FIB/SEM o SBF-SEM come tecnica di accompagnamento. In questo articolo, ci siamo concentrati sull'AT per la registrazione di dati ultrastrutturali da campioni che hanno meno probabilità di essere affrontati con successo con altri metodi. Ci auguriamo che la procedura descritta per una comoda raccolta di sezioni e strategie di acquisizione notevolmente automatizzate aiuti nei primi tentativi per coloro che non hanno mai incontrato il metodo e aiuti a perfezionarlo per coloro che hanno già una certa esperienza.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting
AT coltello da sezione	Diatome	DUATS3530	Coltello Jumbo Diatome
Coltello diamantato per rifilatura 90°	Diatomee	DTB90	Rifilatura di diatomee 20 gradi Coltello in vetro
Pattex adesivo a contatto	Pattex	PCL3C
Wafer di silicone	Ted Pella	16015	Resistenza: 1-30 Ohm Tipo P: (Boro) (1 piatto primario) Rugosità: 2 nm Nessun rivestimento superiore SiO2 TTV: = < 20 µ m Wafer è lucidato su un lato
Ultramicrotomo	Leica UC6		Alternativa: Kit
di taglio del wafer	EMS	7642	EMF, Mannaia per campioni piccola, CatNo. 7652
Acquisizione dell'immagine
FESEM	Thermo Fischer Helios	1072419	Alternative: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Mappe 3 per SEM con flusso di lavoro correlativo e Thermo	Fisher Scientific	1135932	Maps fornisce l'automazione dei flussi di lavoro di imaging SEM e consente l'importazione di dati di terze parti per CLEM e navigazione.
Analisi delle immagini
Amira x.y	Thermo Fisher Scientific	1131599	Amira è un software di visualizzazione e analisi dei dati 3D con diverse funzioni pratiche per la ricostruzione dei dati della tomografia array.
Elaborazione delle immagini	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)	IMOD, MIB (Vedi testo per i riferimenti)