Questo protocollo introduce un metodo per sviluppare un'impalcatura utilizzando reni di ratto decellularizzati. Il protocollo include processi di decellularizzazione e ricellularizzazione per confermare la biodisponibilità. La decellularizzazione viene eseguita utilizzando Tritone X-100 e solfato di dodecil di sodio.
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Articolo metodologico
Preparazione di impalcature renali decellularizzate nei ratti
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ingegneria tissutale è una disciplina all'avanguardia in biomedicina. Le tecniche di coltura cellulare possono essere applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Le impalcature sono necessarie per facilitare la generazione di organi o tessuti tridimensionali utilizzando cellule staminali differenziate in vivo. In questa relazione descriviamo un nuovo metodo per lo sviluppo di impalcature vascolarizzate che utilizzano reni di ratto decellularizzati. In questo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley di otto settimane, ed l'eparina è stata iniettata nel cuore per facilitare il flusso nei vasi renali, permettendo all'eparina di perfondersi nei vasi renali. La cavità addominale è stata aperta e il rene sinistro è stato raccolto. I reni raccolti sono stati perfusi per 9 ore usando detergenti, come Triton X-100 e solfato di dodecil di sodio, per decellularizzare il tessuto. Le impalcature renali decellularizzate sono state poi lavate delicatamente con l'1% di penicillina/streptomicina ed eparina per rimuovere detriti cellulari e residui chimici. Il trapianto di cellule staminali con le impalcature vascolari decellularizzate dovrebbe facilitare la generazione di nuovi organi. Pertanto, le impalcature vascolarizzate possono fornire una base per l'ingegneria tissutale degli innesti di organi in futuro.
Introduzione
Le tecniche di coltura cellulare sono applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Il trapianto di organi allogenici è attualmente il trattamento più comune per danni irreversibili agli organi; tuttavia, questo approccio richiede l'uso di immunosoppressione per prevenire il rigetto dell'organo trapiantato. Inoltre, nonostante i progressi nell'immunologia dei trapianti, il 20% dei riceventi di trapianti può sperimentare un rigetto acuto entro 5 anni e, entro 10 anni dal trapianto, il 40% dei riceventi può perdere l'innesto trapiantato o morire1.
I progres....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dalla somministrazione della Pusan National University of Medicine ed è stato condotto in conformità con le linee guida etiche per l'uso e la cura degli animali. (certificato n. 2017-119). Prima di qualsiasi studio sugli animali, dovrebbe essere ottenuta l'approvazione istituzionale.
NOTA: Tutti gli strumenti/attrezzature chirurgiche e anestetiche e i reagenti raccomandati per una presentazione chirurgica di successo e l'imaging di organi addominali sono dettagliati nella tabella 1.
1. Procedure di preparazione per la raccolta dei reni del ratto
- In preparazione all'intervento chi....
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Risultati
La morfologia grossolana dei reni del ratto era rosso scuro(figura 1A). Dopo la decellularizzazione, il rene è diventato pallido e traslucido (Figura 1D). Il DNA genomico residuo è stato valutato con un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore, in impalcature renali decellularizzate e confrontato con quello nei reni nativi (controllo). L'analisi quantitativa ha confermato che il DNA genomico tissutale è stato quasi eliminato dopo la decellularizzazio.......
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Discussione
Vari protocolli sono stati utilizzati per la decellularizzazione di organi e altri tessuti. Il protocollo di decellularizzazione ottimale deve preservare l'architettura tridimensionale della matrice extracellulare (ECM). In generale, tali protocolli consistono nel lisciviare la membrana cellulare mediante elaborazione fisica o soluzioni ioniche, dissociare il citoplasma e il nucleo dall'ECM mediante lavorazione enzimatica o detergenti, quindi rimuovere i detriti cellulari dal tessuto3. I processi .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da una borsa di studio del Biomedical Research Institute del Pusan National University Hospital.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 1 cc (sonde per iniezione e soluzioni per veicoli | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 etilone per anastomosi vascolare | Ethicon | 9032G | |
| Ago guida da 25 pollici calibro (per cateteri vascolari) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS ratto con chiusura dell'incisione | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Ratto | con chiusura dell'incisione in proleneEthicon | 8832H | |
| 3-0 bobina di seta accesso/legatura vascolare nel ratto | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS chiusura incisione topo | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene chiusura incisione topo | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 bobina di seta accesso/legatura vascolare nel topo | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Forbici fini per tagliare fascia/tessuto connettivo | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Porta aghi Halsey | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Emostatico per ratti: morsetto muscolare per ridurre al minimo il sanguinamento quando tagliato | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Tubo Polyethelyne 50, tubo catetere 100 piedi | Braintree | Scientific.023" &volte; .038" | |
| Morsetti vascolari Schwartz microserrefine | Fine Science Tools | 18052-01 (dritto) | |
| 18052-03 (curvo) | |||
| Forbici chirurgiche per tagliare la pelle | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Forbici a molla per arteriotomia | Fine Science Tools | 15003-08 |
Riferimenti
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M.
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Ristampe e permessi
