Articolo metodologico

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

DOI:

10.3791/61879

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14 marzo 2021

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Abstract

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La generazione di cardiomiociti umani (CM), fibroblasti cardiaci (CF) e cellule endoteliali (EC) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha fornito un'opportunità unica per studiare la complessa interazione tra diversi tipi di cellule cardiovascolari che guida lo sviluppo e la malattia dei tessuti. Nell'area dei modelli di tessuto cardiaco, diversi sofisticati approcci tridimensionali (3D) utilizzano cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-CM) per imitare la rilevanza fisiologica e l'ambiente tissutale nativo con una combinazione di matrici extracellulari e reticolanti. Tuttavia, questi sistemi sono complessi da fabbricare senza competenze di microfabbricazione e richiedono diverse settimane per auto-assemblarsi. Ancora più importante, molti di questi sistemi mancano di cellule vascolari e fibroblasti cardiaci che costituiscono oltre il 60% dei non miociti nel cuore umano. Qui descriviamo la derivazione di tutti e tre i tipi di cellule cardiache dalle iPSC per fabbricare microtessuti cardiaci. Questa facile tecnica di stampaggio replica consente la coltura di microtessuti cardiaci in piastre di coltura cellulare multi-pozzo standard per diverse settimane. La piattaforma consente un controllo definito dall'utente sulle dimensioni delle microtissue in base alla densità iniziale di semina e richiede meno di 3 giorni per l'autoassemblaggio per ottenere contrazioni cardiache del microtissueo osservabili. Inoltre, i microtessuti cardiaci possono essere facilmente digeriti mantenendo un'elevata vitalità cellulare per l'interrogazione monocellulare con l'uso della citometria a flusso e del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Prevediamo che questo modello in vitro di microtessuti cardiaci contribuirà ad accelerare gli studi di convalida nella scoperta di farmaci e nella modellazione delle malattie.

Introduzione

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La scoperta di farmaci e la modellazione delle malattie nel campo della ricerca cardiovascolare devono affrontare diverse sfide a causa della mancanza di campioni clinicamente rilevanti e di strumenti traslazionali inadeguati1. Modelli pre-clinici altamente complessi o modelli monocellulari in vitro troppo semplificati non presentano condizioni fisiopatologiche in modo riproducibile. Pertanto, diverse piattaforme miniaturizzate di ingegneria tissutale si sono evolute per contribuire a colmare il divario, con l'obiettivo di raggiungere un equilibrio tra facilità di applicazione in modo ad alta produttività e fedele ricapitolazione della funzione tissutale2,3. Con l'avvento della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), gli strumenti di ingegneria tissutale possono essere applicati a cellule specifiche del paziente con o senza stato di malattia cardiovascolare sottostante per rispondere alle domande di ricerca4,5,6. Tali modelli di ingegneria tissutale con composizione cellulare simile al tessuto cardiaco potrebbero essere utilizzati negli sforzi di sviluppo di farmaci per testare la cardiotossicità e la disfunzione indotte da cambiamenti patologici nel comportamento di uno o più tipi di cellule.

I microtessuti o organoidi autoassemblati derivati da iPSC umane sono strutture tridimensionali (3D) che sono assemblaggi simili a tessuti in miniatura che presentano somiglianze funzionali con le loro controparti in vivo. Esistono diversi approcci che consentono la formazione di organoidi in situ attraverso la differenziazione diretta di iPSC o attraverso la formazione di corpi embrioidi4. Gli organoidi risultanti sono uno strumento indispensabile per studiare i processi morfogenetici che guidano l'organogenesi. Tuttavia, la presenza di una varietà di popolazioni cellulari e le differenze nell'auto-organizzazione possono portare a variabilità nei risultati tra diversi organoidi5. In alternativa, le cellule prese differenziate che sono auto-assemblate in microtessuti con tipi di cellule tessuto-specifiche per studiare le interazioni cellula-cellula locali sono modelli eccellenti, in cui è possibile isolare i componenti autoassemblati. In particolare nella ricerca cardiaca umana, lo sviluppo di microtessuti cardiaci 3D con componenti multicellulari si è dimostrato impegnativo quando le cellule sono derivate da diverse linee di pazienti o fonti commerciali.

Per migliorare la nostra comprensione meccanicistica dei comportamenti cellulari in un modello fisiologicamente rilevante, personalizzato, in vitro, idealmente tutti i tipi di cellule componenti dovrebbero essere derivati dalla stessa linea di pazienti. Nel contesto di un cuore umano, un modello cardiaco in vitro veramente rappresentativo catturerebbe la diafonia tra i tipi di cellule predominanti, vale a dire, cardiomiociti (CM), cellule endoteliali (EC) e fibroblasti cardiaci (CF)6,7. La ricapitolazione fedele di un miocardio non richiede solo un allungamento biofisico e una stimolazione elettrofisiologica, ma anche la segnalazione cellula-cellula che deriva da tipi di cellule di supporto come EC e CF8. I CF sono coinvolti nella sintesi della matrice extracellulare e nel mantenimento della struttura tissutale; e in uno stato patologico, i CF possono indurre fibrosi e alterare la conduzione elettrica nei CM9. Allo stesso modo, le CE possono regolare le proprietà contrattili delle CM attraverso la segnalazione paracrina e fornendo richieste metaboliche vitali10. Quindi, c'è bisogno di microtessuti cardiaci umani composti da tutti e tre i principali tipi di cellule per consentire di condurre esperimenti ad alto rendimento fisiologicamente rilevanti.

Qui, descriviamo un approccio bottom-up nella fabbricazione di microtissue cardiaci per derivazione di cardiomiociti umani derivati da iPSC (iPSC-CM), cellule endoteliali derivate da iPSC (iPSC-EC) e fibroblasti cardiaci derivati da iPSC (iPSC-CF) e la loro coltura 3D in array di microtissue cardiaci uniformi. Questo facile metodo di generazione di microtessuti cardiaci che battono spontaneamente può essere utilizzato per la modellazione della malattia e la sperimentazione rapida di farmaci per la comprensione funzionale e meccanicistica della fisiologia cardiaca. Inoltre, tali piattaforme di microtessuto cardiaco multicellulare potrebbero essere sfruttate con tecniche di editing del genoma per emulare la progressione della malattia cardiaca nel tempo in condizioni di coltura cronica o acuta.

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Protocollo

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1. Preparazione del mezzo, reagente, piastra di coltura

  1. Soluzione di lavaggio cellulare per colture cellulari: utilizzare 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) senza calcio o magnesio.
  2. Mezzi di differenziazione dei cardiomiociti
    1. Preparare il mezzo di differenziazione #1 aggiungendo 10 mL di integratore (50x B27 più insulina) a 500 mL di terreno basale cardiomiocitario (RPMI 1640).
    2. Preparare il mezzo di differenziazione #2 aggiungendo 10 mL di integratore (50x B27 meno insulina) a 500 mL di mezzo basale cardiomiocitario (RPMI 1640).
    3. Preparare il mezzo di purificazione #3 aggiungendo un integratore (50x B27 più insulina) a 500 ml di terreno basale cardiomiocitario (RPMI 1640) meno glucosio.
  3. Mezzi di crescita endoteliali e reagenti MACS (Magnetic-activated cell sorting)
    1. Preparare il mezzo di crescita endoteliale (EGM) con il kit di supplemento per la crescita delle cellule endoteliali disponibile in commercio.
    2. Preparare la soluzione tampone di selezione della separazione cellulare diluendo la soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) a 1:20 con soluzione di risciacquo.
  4. Mezzo di differenziazione dei fibroblasti cardiaci: preparare il mezzo di differenziazione dei fibroblasti cardiaci con il mezzo basale dei fibroblasti (DMEM-glucosio alto) e il kit Dei fattori di vita dei fibroblasti senza siero.
  5. Mezzo di fabbricazione e manutenzione di microtissue cardiaci: Preparare il mezzo filtrato con mezzo basale cardiomiocitario (RPMI 1640) con integratore (50x B27 più insulina) ed EGM in rapporto 70/30 v/v%.
  6. Soluzioni stock di piccole molecole e fattori di crescita
    1. Per la differenziazione di tutti e tre i tipi di cellule, preparare aliquote da 200 μL dell'inibitore GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]ammino]etil]ammino]-3-piridinecarbonitrile); Inibitore Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-il)-N-8-chinolinil-benzamide; e inibitore del fattore di crescita trasformante beta (TGF-β) SB431542 (4-(1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamid) alla concentrazione di 10 mM nel solfossido di dimetile (DMSO).
    2. Per il differenziamento iPSC-EC umano, preparare aliquote 100 μL del fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) (20 μg/mL), del fattore di crescita endoteliale vascolare 165 (VEGF165; 50 μg/mL) e della proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4; 20 μg/mL) nello 0,1% (p/v) di BSA in acqua distillata ultrapura. Conservare le aliquote a -20 °C; per la conservazione a lungo termine, le aliquote possono essere conservate a -80 °C per un massimo di 1 anno.
  7. Piastre di pre-rivestimento per la manutenzione di iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF.
    1. Preparare piastre a 6 pozzetti a matrice di membrana a membrana basale a rivestimento medio per la ripildatura iPSC-CM diluendo il mezzo della matrice della membrana basale GFR (Growth Factor Reduced) in DMEM/F12 in un rapporto 1:200. Aggiungere 2 mL di mezzo a matrice di membrana basale diluita a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e lasciarlo riposare per almeno 2-4 ore.
    2. Piastra pre-rivestita a 6 pozzetti o piatto da 10 cm con gelatina. Liquefare la soluzione di gelatina al 2% a bagnomaria a 37 °C e preparare la gelatina filtrata allo 0,2% (v/v) in PBS in un volume appropriato secondo necessità. Rivestire la piastra di coltura con 10 ml di gelatina allo 0,2% per almeno 30 minuti a 37 °C prima dell'uso.
      NOTA: le piastre di gelatina possono essere utilizzate sia per iPSC-CF che per iPSC-EC dopo MACS.
  8. Fabbricazione di stampi in microtessuta: preparare una soluzione di agarosio a bassa fusione al 2% in PBS in una bottiglia di vetro asciutta da 100 ml. Sterilizzare l'agarosio a 121 °C, 15 psi per 20 minuti prima dell'uso. Autoclave i microstampi in silicone colata a 121 °C, 15 psi per 15 min.
  9. Soluzioni per digestione, immunocolorazione e citometria a flusso
    1. Per la digestione del microtissue, preparare un tampone di digestione enzimatica di Dispase I (1 U/mL) e Liberase (3 U/mL) in PBS. Mantenere questa soluzione sul ghiaccio.
    2. Sia per la fissazione cellulare che per quella microtessuta, utilizzare un reagente di fissazione disponibile in commercio a freddo ghiacciato contenente il 4,2% di paraformaldeide (PFA).
    3. Preparare lo 0,25% di Triton X-100 in PBS per la permeabilizzazione e lo 0,1% di Tween-20 per i lavaggi. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente.
    4. Per le analisi facs di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, preparare il tampone FACS [PBS o HBSS con siero bovino fetale al 2% (FBS)] e conservare a 4 °C.
    5. Per l'immunocolorazione, preparare il 2% di siero normale di capra/ asino / coniglio in PBS. Scegli le specie di siero in base all'ospite in cui sono stati allevati gli anticorpi.

2. Differenziazione e purificazione cardiaca

NOTA: Tutte le iPSC devono essere mantenute a una confluenza compresa tra il 75% e l'80% prima della differenziazione dei cardiomiociti. Le iPSC utilizzate per questo protocollo sono state derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando la riprogrammazione del virus Sendai eseguita presso la Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

  1. Prima della differenziazione, coltura colonie iPSC fino al passaggio (P20).
  2. Rimuovere il terreno di coltura iPSC dalla piastra a 6 pozzetti e lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS.
  3. Il giorno 0, iniziare l'induzione del mesendoderma aggiungendo 2 ml di differenziamento Medium #1 con CHIR (6 μM finale) in ogni pozzetto. La concentrazione finale può variare da 6 a 9 μM per diverse linee iPSC. Pertanto, si raccomanda di testare diverse concentrazioni di CHIR su una piastra a 6 pozzetti per identificare l'induzione ottimale del mesoderma cardiaco.
  4. Il giorno 2, recuperare le cellule sostituendo con 2 ml di media #1 fresco in ogni pozzetto.
  5. Il giorno 3, sostituire il mezzo in ciascun pozzetto con 2 mL di differenziazione Medium #1 con l'inibitore Wnt IWR-1-endo (5 μM) per indurre la specifica del lignaggio cardiaco.
  6. Il giorno 5, recuperare le cellule sostituendo il mezzo con 2 ml di medio fresco #1 in ogni pozzetto.
  7. Il giorno 7, sostituire medium con 2 mL Medium #2 in ogni pozzetto. Il battito spontaneo dei cardiomiociti può essere osservato già dal giorno 8-9. Per alcune linee, le cellule che battono possono apparire fino al giorno 11.
  8. Per la purificazione della coltura di differenziazione, sostituire con 2 ml meno glucosio Medio #3 in ciascun pozzetto il giorno 10.
  9. Il giorno 13, recupera le cellule cambiando il mezzo con 2 ml più glucosio Medium #2 in ogni pozzetto.
  10. Il giorno 16, eseguire il secondo ciclo di purificazione con 2 ml di Medium #3 in ogni pozzo.
  11. Recupera le cellule il giorno 19 con 2 ml più glucosio Medio #2.
  12. Il giorno 20, lavare i pozzetti una volta con 1 mL pbS e dissociare le cellule usando 1 mL 10x Tripsina per 6 minuti a 37 °C. Dopo l'incubazione, le cellule vengono sollevate dalla superficie del pozzo in singole cellule per meno di 15 s e aggiunte a 15 mL di tubo conico con uguale volume di Medium #2 per neutralizzare l'enzima. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 min a 270 x g.
  13. Risospesciare il pellet cellulare in 3 mL Medium #3. Contare le cellule e aggiungere il volume appropriato di Medium #3 per placcare un totale di ~ 3 milioni di cellule in ogni pozzetto di una nuova matrice di membrana basale con piastra a 6 pozzetti rivestita in media. Il secondo giorno dopo la ri-placcatura, sostituire il mezzo con 2 mL medium #2 fresco e ricostituire con 2 mL Medium #2 a giorni alterni fino alla tripsinizzazione dei cardiomiociti per il congelamento o esperimenti futuri.

3. Differenziamento delle cellule endoteliali e MACS

  1. Con una confluenza iPSC compresa tra il 75% e l'80%, lavare la piastra con PBS, 2 ml per pozzetto.
  2. Iniziare la differenziazione al giorno 0 sostituendo con 2 ml di differenziazione Medium #1 con 6 μM CHIR.
  3. Il giorno 2, sostituire il mezzo con 2 ml di differenziazione Medium #1 con 2 μM CHIR.
  4. Il giorno 4, sostituire il mezzo con 2 ml di EGM integrati con 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 e 20 ng BMP4.
  5. Cambia il mezzo con 2 ml di EGM integrato con fattori di crescita ogni 2 giorni dal giorno 6 al giorno 10. L'aggiunta di inibitore del TGFβ (SB431542) alla concentrazione di 8 μM è facoltativa per promuovere l'espansione endoteliale e sopprimere la differenziazione di altri tipi di cellule di origine mesenchimale.
  6. Il giorno 12, inizia i passi per MACS risciacquando ogni pozzetto con 1 mL di PBS seguito da dissociazione cellulare usando 1 mL di tripsina 10x in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per 8 minuti a 37 ° C.
  7. Preparare un volume uguale di mezzo EGM in un tubo conico da 50 ml per neutralizzare l'enzima di dissociazione. Posizionare un filtro cellulare da 40 μm sul tubo conico da 50 ml e far passare la sospensione cellulare dissociata attraverso il filtro. Cambiare il filtro per ogni 2 o 3 pozzetti dissociati.
  8. Enumerare le cellule vitali totali utilizzando lo 0,4% di blu di trypan utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  9. Pellet la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti in una centrifuga pre-raffreddata impostata a 4 °C.
  10. Scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare nel volume appropriato del tampone di selezione in base al conteggio totale nel passaggio 3.8.
    NOTA: aggiungere 80 μL di buffer di ordinamento per 107 celle totali.
  11. Per l'etichettatura magnetica delle perline, aggiungere 20 μL di reagente di blocco FcR per 107 cellule e incubare per 5 minuti.
  12. Aggiungere 20 μL di microsfere CD144 o CD31 per 107 celle e mescolare bene. Incubare la sospensione cellulare al buio a 4 °C per 15 min.
  13. Aggiungere 20 mL di tampone di selezione per lavare le celle etichettate e pellet le celle 300 x g per 5 minuti in una centrifuga pre-raffreddata impostata a 4 °C.
  14. Risospendare il pellet cellulare in 3 mL di tampone di selezione e lasciarlo sul ghiaccio.
  15. Preparare una colonna di separazione magnetica posizionando la colonna nella tacca del separatore.
  16. Equilibrare la colonna risciacquando con 3 mL di tampone di selezione e raccogliere il flusso attraverso un tubo conico di scarico.
  17. Una volta che il tampone di risciacquo scorre attraverso, risospesere accuratamente la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi e applicare la sospensione cellulare sulla colonna.
  18. Dopo che la sospensione cellulare è passata, lavare la colonna con 3 mL di tampone di smistamento tre volte per rimuovere eventuali celle non etichettate.
  19. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla in un tubo conico da 15 mL per l'eluizione cellulare CD144+/CD31+.
  20. Aggiungere 5 mL di buffer di smistamento sulla colonna e lavare immediatamente le celle etichettate magneticamente con lo stantuffo.
  21. Determinare il numero di cellule vitali utilizzando lo 0,4% di blu di trypan utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  22. Centrifugare la sospensione cellulare in una centrifuga pre-raffreddata a 300 x g per 3 min.
  23. Risospesso il pellet cellulare in volume appropriato di EGM con 5-8 μM di inibitore del TGFβ (SB431542) in base al conteggio totale nel passaggio 3.21.
  24. Placcare queste cellule di passaggio 0 (P0) ad una densità cellulare appropriata (4 x 104 celle/cm2) su una piastra di gelatina pre-rivestita allo 0,2%.
  25. Per P0 e P1, continuare a ricostituire il mezzo con EGM fresco ogni 2 giorni con inibitore del TGFβ. Da P2, le cellule possono essere coltivate in terreno di crescita endoteliale senza inibitore del TGFβ.

4. Differenziazione dei fibroblasti cardiaci

  1. Consentire alle iPSC di diventare confluenti dal 90% al 95%; lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS.
  2. Inizia la differenziazione al giorno 0 aggiungendo 2 ml di differenziazione Medium #1 con 11 μM CHIR. Per le linee iPSC sensibili, la concentrazione può variare tra 9-10 μM.
  3. Il giorno 1, osserva il piatto. È normale osservare una significativa morte cellulare con ~ 30% al 40% di cellule aderenti alla piastra.
  4. Il giorno 3, aggiungere 2 ml di differenziazione Medium #1 con 5 μM IWR-1-endo per promuovere l'espansione dei progenitori cardiaci.
  5. Il giorno 4, sostituire il mezzo con 2 ml di mezzo di differenziazione dei fibroblasti cardiaci. Sostituire con mezzo fresco ogni 2 giorni fino al giorno 16.
  6. Il giorno 18, staccare le cellule usando 1 mL di 10x Tripsina in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per 10 minuti a 37 °C.
  7. Interrompere accuratamente lo strato cellulare e far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo conico da 50 ml contenente lo stesso volume di mezzo DMEM/F12 integrato con FBS al 5%.
  8. Determinare il numero di cellule vitali utilizzando lo 0,4% di blu di trypan utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  9. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti per ottenere un pellet.
  10. Per la prima ri-placcatura, risospendere il pellet cellulare in un volume appropriato di mezzo di differenziazione e piastra a densità cellulare (6 x 104 celle / cm2) su una piastra rivestita di gelatina allo 0,2% fino al 90% di confluenza.
  11. Dividere la piastra e mantenere i fibroblasti cardiaci in DMEM / F12 regolare con siero al 10% su piastre rivestite di gelatina.

5. Fusione di muffe cardiometesse e semina cellulare

  1. Sciogliere l'agarosio in un forno a microonde in una bottiglia di vetro da 100 ml fino all'ebollizione. Spruzzare la bottiglia di agarosio e metterla nell'armadietto della biosicurezza. Lasciare raffreddare l'agarosio per ~ 3 minuti.
  2. Pipetta 700 μL di agarosio fuso in un microstampo in silicone di matrice 9 x 9. Evitare di generare bolle durante il pipettaggio.
  3. Posizionare con attenzione lo stampo su un blocco di ghiaccio pre-raffreddato per accelerare la gelificazione dell'agarosio.
  4. Assicurarsi che una volta che l'agarosio è gelificato, diventi traslucido. Piegare con attenzione i bordi del micro-stampo per allentare la replica dell'agarosio. Quindi, sbucciare delicatamente la replica da tutti i lati per staccare la replica di agarosio dal micro-stampo in silicone.
  5. Trasferire il vassoio in microtessuta di agarosio contenente 81 recessi circolari (diametro 800 μm; profondità 800 μm) in una piastra sterile a 12 pozzetti.
  6. Aggiungere 2 ml di PBS al vassoio di microtessuta di agarosio e ispezionare al microscopio eventuali bolle intrappolate o pozzetti di forma irregolare.
  7. Immergere il vassoio di agarosio in 2 mL di etanolo al 70% durante la notte, seguito dal trattamento UV nell'armadio di biosicurezza per 1 ora.
  8. Prima dell'uso, rimuovere l'etanolo al 70% e lavare due volte con acqua distillata e un lavaggio finale con 2 ml di PBS.
  9. Tripsinizzare, neutralizzare e contare iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF e posizionare le sospensioni cellulari sul ghiaccio.
  10. Rimuovere con attenzione il PBS dal pozzo e dalla camera di semina cellulare senza toccare i recessi.
  11. In un nuovo tubo, mescolare iPSC-CM, iPSC-ECs e iPSC-CF in rapporto 7:2:1, rispettivamente, per ottenere una densità cellulare finale di 106 celle/ml. Densità cellulari più elevate si tradurranno in microtessuti più grandi.
    NOTA: non superare 2 x 106 celle/ml.
  12. Aggiungere con attenzione i 200 μL della sospensione cellulare a goccia nella camera di semina.
  13. Lasciare che le celle si depositino a 37 °C in un incubatore a CO2 per 2 ore.
  14. Aggiungere il mezzo di fabbricazione di microtessuto che circonda lo stampo di agarosio per coprire solo la superficie della camera interna.
  15. Dopo 24 ore, le celle si auto-assemblano e si compattano in modo significativo nei recessi circolari. Sostituire con mezzo fresco ogni 2 giorni per manutenzione.

6. Fissazione e permeabilizzazione di cellule e microtessuti cardiaci per immunocolorazione

  1. Per ogni singolo tipo di cellula, coltivare le cellule separatamente su un mezzo di matrice di membrana basale o vetrini a camera rivestiti di gelatina (circa 2,5-3 x 105 cellule / ml). I microtessuti cardiaci possono essere raccolti in tubo conico da 15 ml lavandoli delicatamente dalle rientranze circolari.
  2. Aspirare il mezzo e risciacquare le cellule o i microtessuti con 1 mL di PBS; successivamente, fissare con il tampone di fissaggio contenente il 4,2% di PFA per 20 minuti per le diapositive della camera e 1 ora per le microtissue a temperatura ambiente.
  3. Aspirare il PFA e aggiungere 1 mL di soluzione permeabilizzante (0,25% Triton X-100 in PBS) per 5-7 min per i vetrini della camera e 20 min per i microtessuti in tubo conico da 15 mL.
    NOTA: Da questo passaggio in poi, i campioni possono essere delicatamente cullati su una piattaforma a dondolo da banco.
  4. Aspirare la soluzione permeabilizzante e risciacquare una volta con 2-3 ml di PBS.
  5. Incubare le cellule con 500-1.000 μL di soluzione bloccante (dal 2% al 5% di siero di capra normale o siero d'asino) per almeno 1 ora per i vetrini della camera e da 3 a 4 ore per i microtessuti.
  6. Incubare le cellule o i microtessuti cardiaci con anticorpi coniugati preparati nella soluzione bloccante sufficiente a coprire il campione. Incubare con troponina-T anti-cardiaca (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) e anti-DDR2/Vimentina (1:50) per 1 ora per i vetrini della camera e durante la notte a 4 °C per i microtessuti cardiaci.
  7. Lavare le diapositive della camera tre volte con 500 μL 0,1% Tween-20 per 5 minuti tra ogni lavaggio e un lavaggio finale con PBS.
  8. Per i microtessuti cardiaci, lavare con 2 mL 0,1% Tween-20 cinque volte con una durata di 20 minuti tra ogni lavaggio. Eseguire una fase di lavaggio finale per altri 20 minuti.
  9. Incubare le cellule o i microtissue con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 μg/mL) prima della microscopia confocale.
  10. Per i microtessuti cardiaci, trasferire con attenzione su una parabola di vetro da 35 mm e aggiungere PBS per immergere i microtessuti.
  11. Per l'imaging 3D, utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 20x o 40x ottenere il centro di messa a fuoco della microtessù e regolare i parametri di esposizione per ciascun fluoroforo.
  12. Per ottenere uno Z-stack, impostare la prima e l'ultima coordinata in modalità Live con una profondità di imaging totale di 100-200 μm con intervallo slice di 5-10 μm.

7. Digestione dei microtessuti cardiaci e preparazione delle cellule per la citometria a flusso

  1. Per digerire i microtessuti, sciacquare delicatamente i microtessuti con Medium #1 dai recessi circolari utilizzando una punta di pipetta da 1 mL a foro largo in un tubo conico da 15 mL.
  2. Lasciare depositare i microtessuti e aspirare accuratamente il mezzo e risciacquare le cellule o i microtessuti con 1 mL pbS e aggiungere 200-300 μL di tampone per la digestione enzimatica per 20 minuti a 37 °C. A 10 min, mescolare delicatamente i microtessuti per 1 minuto e incubare nuovamente a 37 °C per il resto del tempo.
  3. Dopo l'incubazione, utilizzare una punta di pipetta normale da 1 mL per mescolare vigorosamente i microtessuti per ottenere una sospensione a cellule torbide.
  4. Una volta che i microtessuti sono sufficientemente digeriti in singole cellule, neutralizzare immediatamente la sospensione cellulare con 5 mL di mezzo contenente il 5% di FBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Contare il numero totale di celle e centrifugare la sospensione monocellulare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Aspirare il surnatante e risospendere 1 x 105-1 x 106 cellule in tampone legante l'annessina da 100 μL con FITC Annexin V e 100 μg/mL di ioduro di propidio (PI) o colorante di esclusione delle cellule morte To-Pro3 per 10 minuti sul ghiaccio.
  6. Dopo l'incubazione, aggiungere 300 μL del tampone legante l'annessina alla sospensione cellulare e trasferirla in un tubo FACS a fondo tondo per l'analisi della citometria a flusso. Utilizzare i laser e i filtri di emissione corretti per i fluorofori selezionati.
  7. Per la quantificazione dei marcatori di superficie cellulare utilizzando celle fisse, eseguire la fissazione e la permeabilizzazione del pellet cellulare come descritto nei passaggi 6.2 e 6.3.
  8. Dopo la permeabilizzazione, sciacquare il pellet cellulare e incubare le cellule con i rispettivi anticorpi coniugati per 1 ora. Lavare il pellet cellulare in tampone FACS da 4 mL (2% FBS in PBS) e centrifugare a 300 x g per 3 min. Ripetere il passaggio di lavaggio due volte.
  9. Risospesso le cellule in un tampone FACS da 200-300 μL per l'analisi della citometria a flusso.
  10. Regolare le proprietà di dispersione anteriore e laterale con un campione non macchiato e prendere in considerazione l'utilizzo di un controllo isotipico per ciascun fluoroforo per regolare le tensioni laser. Raccogli un minimo di 20.000 eventi per l'analisi dei dati.

8. Esecuzione di analisi di contrazione di microtessuti cardiaci che battono spontaneamente

  1. Registra video di microtessuti cardiaci per catturare almeno tre battiti. Impostare la risoluzione di registrazione su almeno 1280 x 720 pixel alla frequenza fotogrammi >30 fotogrammi al secondo e salvare il video in . Formato AVI.
  2. Esegui lo script MotionGUI11 in un ambiente MATLAB per avviare l'interfaccia utente.
  3. Trova il file . Posizione del file AVI nella cartella per caricare il video. Quindi, immettete la frequenza fotogrammi alla quale il video è stato acquisito nel pannello Input.
  4. Nel pannello di input avanzato, è possibile specificare una dimensione in pixel in base alla risoluzione e all'ingrandimento dell'acquisizione.
  5. È possibile specificare una dimensione di pixel macroblocco adatta (predefinita 16) e un movimento dei pixel rilevabile a seconda della forza della contrazione della microtissue.
  6. Dopo aver regolato i parametri, fate clic su Ottieni vettori di movimento per iniziare l'analisi.
  7. Selezionare una regione di interesse con il pulsante di opzione Scegli AOI per escludere le aree circostanti la singola microtessuta nella rientranza circolare.
  8. Utilizzare la funzione Map Time Ave per generare una mappa di calore di contrazione media basata sul movimento rilevato sugli assi X e Y.
  9. Per i dati di tracciamento dei picchi, utilizzare la funzione Ottieni dati di contrazione per misurare automaticamente i picchi di contrazione e rilassamento.
  10. In caso di un basso rapporto segnale-rumore, applicare una soglia di altezza e distanza di picco per annotare correttamente la velocità massima di contrazione (punto blu) e la velocità massima di rilassamento (triangolo rosso).
  11. Dopo aver impostato le soglie corrette, selezionare Analizza picchi per ottenere i valori di contrazione e rilassamento con beat rate e beat interval.
  12. Ottenere misurazioni da un minimo di 25 microtissue individuali per analisi statistiche.

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Risultati

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Caratterizzazione immunocolorante e citometria a flusso di CM, EC e CF derivati da iPSC
Per generare microtessuti cardiaci composti da iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF, tutti e tre i tipi di cellule sono differenziati e caratterizzati individualmente. La differenziazione in vitro delle iPSC in iPSC-CM è migliorata negli ultimi anni. Tuttavia, la resa e la purezza degli iPSC-CM differiscono da linea a linea. L'attuale protocollo produce oltre il 75% di iPSC-CM puri che iniziano spontaneamente a batt...

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Discussione

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Per generare microtessuti cardiaci da iPSC-CM pres differenziati, iPSC-EC e iPSC-CF, è essenziale ottenere una coltura altamente pura per un migliore controllo del numero di cellule dopo la compattazione cellulare inibita dal contatto all'interno dei microtessuti cardiaci. Recentemente, Giacomelli et. al.18 hanno dimostrato la fabbricazione di microtissue cardiaci utilizzando iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF. I microsessu cardiaci generati utilizzando il metodo descritto sono costituiti da ~ 5.000 cellu...

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Dichiarazioni

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J.C.W. è cofondatore di Khloris Biosciences ma non ha interessi in competizione, in quanto il lavoro qui presentato è completamente indipendente. Gli altri autori non riportano conflitti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo la dottoressa Amanda Chase per il suo utile feedback sul manoscritto. Il sostegno finanziario è stato fornito dal Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) dell'Università della California, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre a 12 pozzettiFisher Scientific08-772-29
Microstampi 3D MicrotessutiPiastreformato
Fisher Scientific08-772-1B
Soluzione di risciacquo AutoMACSThermo Fisher ScientificNC9104697
Integratore B27 senza InsulinLife TechnologiesA1895601
Integratore B27 più InsulinLife Technologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, matrice qualificata hESCBD Biosciences354277
Anticorpo Troponina T cardiacaMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Caderina) MicrosfereMiltenyi130-097-857
CD31 AnticorpoMiltenyi130-110-670
CD31 MicrosfereMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
Kit per apoptosi a cellule morte con Annexin V FITC e PIThermo Fisher ScientificV13242
Dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, alto contenuto di glucosio (4,5 g/L), senza glutammina, 11960044
DMEM/F-12, terreno basaleGibco11320033
soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), senza calcio, senza magnesioLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Feto bovino sieroLife Technologies10437
FibroLife Kit LifeFactors senza siero FibroLifeLifeLIne Cell TechnologyLS-1010
RPMI senza glucosio medioLife Technologies11879-020
Siero di capraLife Technologies16210-064
FGF umano di baseThermo Fisher Scientific13256029
Human VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS Colonne di smistamentoMiltenyi130-042-401
MACS BSA Soluzione madreMiltenyi130-091-376
MACS Tampone di risciacquoMiltenyi130-091-222
Separatore MidiMACSMiltenyi130-042-302
RPMI mediavita Tecnologie11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Anticorpoconiugato
scientifico R& Sistemi DIC2105G
a 6 pozzetti 12-81 Vimentin Alexa Fluor® 488 rosso

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166(2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
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