Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per profilare l'interazione tra ospite e agente patogeno durante l'infezione da proteomica a base di spettrometria di massa. Questo protocollo utilizza la quantificazione senza etichette per misurare i cambiamenti nell'abbondanza proteica sia dell'ospite (ad esempio, macrofagi) che dell'agente patogeno (ad esempio, Cryptococcus neoformans)in un singolo esperimento.

Abstract

I risultati tecnologici della proteomica quantitativa basata sulla spettrometria di massa (MS) aprono molte strade sconosciute per analizzare il proteoma globale di un organismo in condizioni variabili. Questa potente strategia applicata alle interazioni degli agenti patogeni microbici con l'ospite desiderato caratterizza in modo completo entrambe le prospettive verso l'infezione. Nel presente documento, il flusso di lavoro descrive la quantificazione senza etichette (LFQ) dell'infettivoma dei neoformani Cryptococcus, un agente patogeno intracellulare facultativo fungino che è l'agente causale della criptococcosi della malattia mortale, in presenza di cellule macrofagi immortalate. Il protocollo descrive in dettaglio le corrette tecniche di preparazione delle proteine sia per le cellule patogene che per le cellule di mammifero all'interno di un singolo esperimento, con conseguente adeguata sottomissione peptidica per l'analisi liquido-cromatografia (LC)-MS/MS. L'elevata produttività della natura generica dell'LFQ consente un'ampia gamma dinamica di identificazione e quantificazione delle proteine, nonché trasferibilità a qualsiasi impostazione di infezione patogena ospite, mantenendo un'estrema sensibilità. Il metodo è ottimizzato per catalogare ampi profili di abbondanza proteica imparziali di un agente patogeno in condizioni di imitazione delle infezioni. In particolare, il metodo qui dimostrato fornisce informazioni essenziali sulla patogenesi c. neoformans, come la produzione proteica necessaria per la virulenza e identifica le proteine ospiti critiche che rispondono all'invasione microbica.

Introduction

La prevalenza di infezioni fungine invasive è in costante aumento ed è correlata a tassi di mortalità inaccettabilmente elevati, più comunemente riportati in individui con predisposizioni immunodifese¹. Cryptococcus neoformans è un noto agente patogeno fungino opportunistico in grado di sopravvivere intracellulare all'interno delle cellule macrofagi ospiti. Un intervento antimicotico inadeguato si traduce in diffusione fungina e manifestazioni potenzialmente letali di meningite criptococcica e meningoencefalite^2,3. L'aumento globale dello status immunocomprotologico ha richiesto un parallelo aumento dell'uso di agenti antifungini, in cui molte specie fungine, tra cui c. neoformani, hanno sempre più evoluto la resistenza verso^4,5,6. Pertanto, è imperativo implementare tecnologie solide ed efficienti per rispondere a domande biologiche vitali riguardanti la risposta alla difesa dell'ospite e la patogenesi microbica.

La nuova era del progresso tecnologico nella spettrometria di massa (SM), compresa la generazione di potenti condotte computazionali e bioinformatiche, fornisce le basi per una visione integrativa per l'analisi su larga scala della ricerca ospite-patogeno^7,8. L'analisi proteomica convenzionale basata sulla patogenesi profila comunemente la vista dell'infezione dal punto di vista dell'ospite o dell'agente patogeno, incluse metodologie complete come il profilo di correlazione proteica, la cromatografia di affinità combinata con la proteomica e l'interaomica⁹. Le indagini sulla virulenza di agenti patogeni pericolosi in un sistema ospite sono di immensa importanza clinica; tuttavia, l'applicazione di un'analisi duale prospettica in un singolo esperimento era precedentemente considerata irraggiungibile. Ad esempio, la prospettiva dell'agente patogeno verso l'infezione è spesso sopraffatta da proteine ospiti altamente abbondanti con conseguente ridotta sensibilità per il rilevamento di proteine fungine a basso contenuto abbondante⁷. Inoltre, l'elevata complessità del campione invita molti obiettivi a indagare in un unico sistema sperimentale e si rivela difficile chiarire i meccanismi di azione per una specifica proteina patogena.

La proteomica bottom-up è una tecnica MS popolare che consente la preparazione gestibile del campione, in cui i peptidi sono generati dalla digestione enzimatica specifica della sequenza seguita dalla separazione, identificazione e quantificazione della cromatografia liquida da parte di MS^10,11. Qui presentiamo un metodo che dimostra una strategia di acquisizione dipendente dai dati volta a ottenere una copertura imparziale di un proteoma o "infectome" basato sull'infezione. In particolare, la quantificazione senza etichette (LFQ) perde la dipendenza dalle etichette chimiche o metaboliche per un'identificazione robusta e accurata dei cambiamenti del livello proteico tra più proteomi, riducendo le fasi di manipolazione e^{lavorazione del campione 12,13}. Questa applicazione universale interroga le proteine prodotte in un dato momento all'interno di una cellula indipendente da qualsiasi produzione proteica prevista; pertanto, si possono scoprire nuove intuizioni che sono fondamentali per l'infezione.

Il flusso di lavoro descritto nel presente documento è ottimizzato per esplorare i cambiamenti a livello proteico dei neoformani C. durante le condizioni di imitazione delle infezioni con le cellule immunitarie ospiti (Figura 1). Piuttosto che basarsi sull'isolamento e la separazione dei tipi di cellule, questo approccio estrae insieme il proteoma ospite e patogeno e utilizza la separazione bioinformatica utilizzando due database specifici dell'organismo per distinguere la produzione proteica specifica delle specie. Questo metodo offre vantaggi per un numero illimitato di campioni da trattare senza le costose fasi di preparazione necessarie negli studi sull'etichettatura o nel frazionamento a base di isotopi. Inoltre, questo flusso di lavoro supporta protocolli di estrazione proteica ottimizzati trasferibili a una vasta gamma di agenti patogeni fungini e batterici in grado di colpire e infettare le cellule immunitarie ospiti. Nel complesso, questo protocollo delinea i passaggi per completare un'estrazione di proteine imparziali e l'elaborazione del campione per la SM ad alta risoluzione, seguita da dati e analisi statistiche, in grado di fornire una ricchezza di conoscenza delle proteine fungine significative per l'infezione combinate con una profilazione completa della risposta della difesa ospite.

Protocol

Una linea immortalata di macrofagi derivati dai topi BALB/c è stata utilizzata per il seguente protocollo approvato dal Protocollo 4193 dell'Università di Guelph Sull'Utilizzo degli Animali. In particolare, altri ceppi di topi o altre fonti di cellule immortalate possono essere applicati al protocollo delineato con test sufficienti per ottimizzare i parametri dettagliati. Il protocollo seguente consente di esplorare i passaggi che iniziano con una fiala bloccata di celle di macrofagi. Le cellule sono conservate in 10% FBS (siero bovino fetale), 1% L-glutammina e 5% miscela Pen/Strep (Penicillina-Streptomicina) a DMEM (Medium aquila modificata di Dulbecco) e 20% DMSO (solfossido di dimetile).

1. Coltivazione di C. neoformans

1. Utilizzando uno stock di glicerolo, striato wildtype C. neoformans strain (H99) su estratto di lievito peptone destrosio (YPD) piastra agar per isolare singole colonie.
2. Incubare durante la notte per 16 ore a 37 °C in un incubatore statico.
3. Selezionare una singola colonia di ceppo e coltura di neoformani di tipo selvatico C. in 5 ml di brodo YPD in una provetta da 10 ml vagamente limitata. Eseguire in quadruplicazione.
4. Incubare durante la notte per 16 ore a 37 °C in un'incubatrice tremante a 200 giri/min.
5. Il giorno seguente sottocultura ogni cultura notturna in una diluizione 1:100 in brodo YPD da 3 mL.
6. Misurare i valori di densità ottica (OD_600nm)delle impostazioni cultura fungine per determinare la fase di registro intermedio. A seconda dello spettrofotometro, il ceppo del tipo selvatico C. neoformans raggiunge la fase di registro medio comunemente seguendo l'incubazione da 6 a 8 ore nell'YPD con valori generali di_{OD 600nm} compresi tra 1,0 e 1,5.
7. Una volta che le cellule raggiungono la fase di registro intermedio, prendere un'aliquota di 10 μL di sospensione cellulare fungina in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml e diluire 1:100 in soluzione salina tamponata 1x fosfato sterile (PBS). Contare il numero di cellule usando un emocitometro.

2. Coltivazione di cellule macrofagi

NOTA: Assicurarsi che l'ambiente di lavoro sia sterilizzato prima del lavoro di coltura cellulare.

1. Preparazione del mezzo di coltura cellulare
   1. Mezzo integrato con antibiotici: Aggiungere il 10% di FBS (siero bovino fetale), l'1% di L-glutammina e il 5% di miscela Pen/Strep (Penicillina-Streptomicina) al DMEM (Medium Aquila Modificata di Dulbecco). Filtrare il mezzo attraverso un sistema di filtrazione completo da 0,2 μm e conservare a 4 °C.
   2. Mezzo privo di antibiotici: seguire il protocollo identico ma omettere la miscela Pen / Strep.
2. Cellule di macrofagi di semina
   NOTA: Il mezzo integrato con antibiotici (2.1.1.) deve essere riscaldato a 37 °C prima del lavoro di coltura cellulare.
   1. Scongelare rapidamente il flaconcino delle cellule del macrofago in un bagno di perline a 37 °C.
   2. Lavare le cellule di soluzione congelante rimospensendo le cellule in un mezzo integrato con antibiotici da 1 mL.
      NOTA: È necessaria un'ulteriore precauzione per garantire che le cellule non si lenino a causa della tubazione dura.
   3. Trasferire le cellule rimorsi in un tubo sterile da 15 ml.
   4. Celle a pellet centrifugando a 400 × g per 5 min a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere con cura il supernatante con una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
   6. Resuspend delicatamente pellet in 10 mL di mezzo integrato antibiotico.
   7. Pipettare delicatamente le cellule risospendate in un piatto trattato con coltura cellulare da 60 x 15 mm.
   8. Incubare il piatto a 37 °C con il 5% di CO_{2 durante la} notte.
3. Passaggio iniziale delle cellule macrofagi
   NOTA: Le scorte di cellule congelate conterranno in genere da 5 a 10 milioni di cellule per flaconcino (circa 1 mL). Il giorno successivo, le cellule macrofagi sopravvissute al protocollo di semina aderirono al fondo del piatto di coltura cellulare e saranno pronte per la passaging.
   1. Mezzo caldo integrato con antibiotici (fase 2.1.1) a 37 °C prima del lavoro di coltura cellulare. Assicurarsi che l'ambiente di lavoro sia sterilizzato prima del lavoro di coltura cellulare. Visualizza le cellule usando un microscopio a luce per garantire che le cellule siano rispettate e sane.
   2. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dal piatto con una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
   3. Aggiungere delicatamente 5-7 mL di PBS sterile a temperatura ambiente (salina tamponata da fosfati) al piatto da 60 x 15 mm.
   4. Inclinare delicatamente il piatto per lavare le cellule aderenti.
   5. Rimuovere pbs utilizzando una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
   6. Aggiungere 1 mL di PBS freddo (conservato a 4 °C) alle celle, inclinare la piastra per distribuire PBS su tutte le celle e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
   7. Rilasciare le cellule toccando delicatamente il piatto, pipettando PBS freddo contro le cellule o utilizzando un raschietto cellulare.
   8. Aggiungere 9 mL di mezzo integrato con antibiotici al piatto.
   9. In un nuovo piatto da 60 x 15 mm, aggiungere 9 mL di mezzo fresco integrato con antibiotici e 1 mL di cellule risosopendate dal piatto originale.
   10. Una volta riempito il numero di piastre di passaging desiderate, le celle risosopendate dal piatto originale possono essere scartate.
   11. Incubare il nuovo piatto alle impostazioni sopra menzionate (fase 2.2.8).
   12. Eseguire la successiva passaging quando le celle hanno raggiunto il 70-80% di confluenza (approssimativamente ogni 2 giorni a seconda della linea cellulare e del mezzo utilizzato).
       NOTA: Le cellule di macrofagi devono essere passaggio almeno cinque volte prima degli esperimenti di infezione. A seconda della linea cellulare, gli esperimenti di infezione devono essere eseguiti da 25 a 30 passaggi. Dopo 25-30 passaggi, le cellule devono essere congelate o scartate. Le sezioni 2.4 o 2.5 possono essere scelte sulla base dei piani sperimentali. La sezione 2.4 sarà utilizzata per le seguenti sezioni.
4. Semina di cellule macrofagi prima dell'infezione
   1. Eseguire i passaggi del protocollo di passaging da 2.3.1 a 2.3.7.
   2. L'uso di un emocitometro o di un contatore di cellule automatizzato determina la densità cellulare (cellule/mL).
   3. Trasferire 0,3 x 10⁶ cellule macrofagi in un unico pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzi.
   4. Regolare il volume totale del pozzo a 1 mL utilizzando un mezzo integrato con antibiotici (fase 2.1.1).
   5. Ripetere i passaggi 2.4.3 e 2.4.4 fino a riempire 8 pozzi (4 pozzi riempiti in due piastre separate).
   6. Facoltativamente, riempire i restanti due pozzali con 1 mL di PBS a temperatura ambiente per mantenere i livelli di umidità durante l'incubazione.
   7. Consentire alle cellule di crescere in condizioni di incubazione menzionate nel passaggio 2.2.8 per 2 d prima dell'infezione.
5. Semina di cellule macrofagi il giorno dell'infezione
   1. Eseguire i passaggi del protocollo di passaging da 2.3.1 a 2.3.7.
   2. L'uso di un emocitometro o di un contatore di cellule automatizzato determina la densità cellulare (cellule/mL).
   3. Semina 1,2 x 10⁶ cellule di macrofagi in un unico pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzi.
   4. Regolare il volume totale del pozzo a 1 mL utilizzando un mezzo integrato con antibiotici (2.1.1).
   5. Ripetere 2.4.3 e 2.4.4 fino a quando non sono stati riempiti 8 pozzi (4 pozzi riempiti in due piastre separate).
   6. Facoltativamente, riempire i restanti due pozzali con 1 mL di PBS a temperatura ambiente per mantenere i livelli di umidità durante l'incubazione.
   7. Incubare le cellule in condizioni menzionate nel passaggio 2.2.8 per 3 ore per consentire alle cellule di aderire ai pozzi.

3. Infezione delle cellule macrofagi con C. neoformans

NOTA: Una volta raggiunta la confluenza del 70-80%, ci saranno circa 1,2 x 10⁶ cellule macrofagi per pozzo. Per ottenere la molteplicità di infezione desiderata (MOI) di 100:1, sono necessarie 1,2 x^{10 8} cellule fungine per ogni reazione. Le colture devono essere fissate di conseguenza in quadruplicazione biologica.

DISCLAIMER: Un MOI di 100:1 ha raggiunto risultati desiderabili nel nostro gruppo di ricerca ed è inteso come suggerimento per i lettori. Un MOI inferiore può essere richiesto per ceppi di C. neoformani più infettivi o per linee cellulari di macrofagi meno resilienti. La verifica dell'infezione (sezione 3.5) può essere utilizzata per determinare il MOI ideale per particolari combinazioni di C. neoformani - macrofagi.

1. Preparazione di cellule fungine
   1. Seguire il passaggio 1 per la crescita dei neoformani C. alla fase di registro intermedio.
   2. Raccogliere e centrifugare le cellule a 1.500 x g per 10 minuti, lavare delicatamente il pellet con PBS sterile a temperatura ambiente e ripetere per un totale di tre lavaggi.
   3. Resuspend cellule in un mezzo di coltura cellulare privo di antibiotici (fase 2.1.2) per raggiungere una concentrazione di 1,2 x 10⁸ cellule/mL.
2. Preparazione di cellule macrofagi
   1. Visualizza ogni bene nella piastra a 6 pozzi per assicurarti che le cellule abbiano raggiunto il 70-80% di confluenza. In alternativa, le cellule possono essere misurate per ottenere circa 1,2 x 10⁶ cellule macrofagi per pozzo.
   2. Seguire i passaggi da 2.3.1 a 2.3.4.
3. Co-coltura di C. neoformani e cellule macrofagi
   1. Aggiungere 1 mL delle cellule di C. neoformans rimescolate (fase 3.1.3) a 4 pozzi contenenti cellule di macrofagi preparate nella sezione 3.2.
      NOTA: Il numero di piastre richieste dovrà essere calcolato prima di iniziare l'esperimento. Aggiungere 1 mL di mezzo privo di antibiotici (fase 2.1.2) ai pozzi vuoti.
   2. Lasciare incubare le cellule in condizioni elencate (fase 2.2.8) per 3 ore.
   3. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalla piastra con una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto.
   4. Aggiungere delicatamente 1 mL di PBS sterile a temperatura ambiente.
   5. Inclinare delicatamente la piastra per lavare le cellule extracellulari C. neoformans non attaccate o non fagocitose.
   6. Rimuovere il PBS utilizzando una pipetta sierologica o un aspiratore sottovuoto, ripetere per un totale di tre lavaggi. Ripetere da 3,3,4 a 3,3,5 altre due volte.
4. Macrofagi non infetti
   1. Allo stesso modo, utilizzare 4 pozzi di una piastra da 6 pozza di pozzo per fungere da campioni di solo macrofagi. Aggiungere 1 mL di mezzo privo di antibiotici (fase 2.1.2) a questi pozzi.
   2. Ripetere i passaggi da 3.3.2 a 3.3.6.
5. Verifica dell'infezione
   NOTA: Utilizzando un test di citotossicità, è possibile misurare la competenza dell'infezione. Il seguente protocollo evidenzierà l'applicazione di un prodotto di citotossicità per misurare il rilascio di LDH (lattato deidrogenasi). Possono essere utilizzati anche altri prodotti di citotossicità.
   1. Preparazione dell'infezione da C. neoformans delle cellule del macrofago
      1. Ripete i passaggi 1, 2 e 3 (fino a 3,5). Il saggio LDH può essere eseguito in triplice copia, se lo si preferisce.
      2. Dopo il passaggio 3.3.6, aggiungere 1 mL di mezzo privo di antibiotici (2.1.2) ad ogni pozzo nella piastra a 6 po porsi.
      3. Ripetere i passaggi 2.4.3 e 2.4.4 fino a quando sono stati riempiti 3 pozzi più pozzi da 3n (dove n è il numero di punti di tempo misurati).
      4. Incubare le cellule in condizioni elencate al passaggio 2.2.8.
      5. Nei punti di tempo selezionati (ad esempio, 1, 3, 6, 12 e 24 ore) raccogliere il supernatante per la misurazione del rilascio di LDH secondo le istruzioni del produttore
      6. Allo stesso tempo, le cellule macrofagi non infette verranno lisciviate al valore determinato per la massima citotossicità.
      7. Calcolare la citotossicità come segue:
         

4. Raccolta dei campioni

1. Co-coltura e raccolta di macrofagi non infetti
   1. Aggiungere 1 mL di PBS freddo alle celle (da 3,3,6 e 3,4,2) e lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
   2. Rilasciare le celle dalla piastra toccando delicatamente la piastra o tubazionando delicatamente pbs freddo contro le cellule.
      NOTA: Il raschietto cellulare deve essere evitato in quanto ciò potrebbe causare llisi delle cellule.
   3. Pipetta ha rimospensito le celle in un tubo da 15 ml.
   4. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.
   5. Le celle di processo (come descritto nella fase 5) immediatamente o flash congelate in azoto liquido e conservate a -80 °C per una successiva lavorazione.

5. Proteoma cellulare

NOTA: La lisi sufficiente deve essere ottimizzata per il tipo di cella analizzato (cioè, la quantità di cicli e ampiezze dipende dalle dimensioni del pellet cellulare e dalla percentuale di potenza del modello di sonicatore della sonda).

1. Lisi cellulare del macrofago infetto
   1. Cellule pellettate resuspend (fase 4.1.5) in 300 μL di Tris-HCl (pH 8.5) da 100 mM di tris-HCl (pH 8.5) costituite da una compressa da cocktail inibitore della proteasi appena sciolta.
      NOTA: Una compressa da cocktail inibitore della proteasi viene aggiunta a 10 mL di ghiaccio freddo 100 mM Tris-HCl (pH 8.5) prima di iniziare l'esperimento.
   2. Sondare le cellule sonicate in un bagno di ghiaccio per 15 cicli di 30 s on e 30 s off, per lire le cellule.
   3. Centrifugare brevemente le cellule per 30 s a 400 x g,fare attenzione a non formare un pellet, solo per rimuovere il liquido sui lati dei tubi seguito dal trasferimento del campione in un tubo di microcentrifugo Lo-bind da 2 ml.
   4. Aggiungere 1:10 volume del 20% di SDS a una concentrazione finale del 2%.
   5. Aggiungere 1:100 volume di 1 M ditiothiothreitol (DTT) ad una concentrazione finale di 10 mM e mescolare accuratamente il campione con pipettazione, seguito dall'incubazione su un blocco riscaldante termico a 95 °C per 10 minuti a 800 giri/min di agitazione. Successivamente, raffreddare a temperatura ambiente (il raffreddamento può essere fatto sul ghiaccio).
   6. Aggiungere 1:10 volume di 0,55 M iodoacetamide (AIA) per ottenere una concentrazione finale di 55 mM e mescolare accuratamente il campione mediante pipettazione. Incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti.
   7. Aggiungere acetone al 100% per ottenere una concentrazione finale di acetone all'80% e conservare il campione durante la notte a -20 °C per far precipitare le proteine.
2. Digestione proteica
   1. Il giorno successivo, raccogliere il pellet precipitato per centrifugazione per 10 minuti a 10.000 x g e 4 °C. Scartare il supernatante e lavare il pellet con 500 μL di acetone all'80%. Ripetere per un totale di due lavaggi. Pellet secco all'aria a temperatura ambiente dopo lavaggi.
   2. Risolubilizzare il pellet proteico in 100 μL di 8 M urea/40 mM HEPES, per garantire completa solubilizzazione, vortice o sonicazione in un bagno d'acqua ghiacciata per 15 cicli di 30 s on e 30 s off.
      NOTA: La regolazione del volume di urea/HEPES è determinata in base alle dimensioni del pellet di cellule precipitate, se si verificano alterazioni, tutti i volumi a valle devono essere opportunamente regolati.
   3. Quantificare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico (ad esempio, un saggio proteico BCA) secondo le istruzioni del produttore e regolare per la misurazione dello sfondo mediante normalizzazione in bianco con HEPES da 8 M urea / 40 mM.
   4. Aggiungere 300 μL di bicarbonato di ammonio da 50 mM per ottenere una concentrazione finale di 2 M di urea.
      NOTA: Possibilità di normalizzare la concentrazione proteica per misurazioni a valle, suggerita per digerire 100 μg di proteine e conservare il campione rimanente non digerito mediante congelamento lampo in azoto liquido, quindi conservare a -20 °C a breve termine o a -80 °C per il lungo termine.
   5. Aggiungere 2:50 (v/w) rapporto enzima-proteina della miscela tripside/Lys-C proteasi sul ghiaccio e toccare delicatamente il tubo per mescolare, incubare durante la notte a temperatura ambiente.
   6. Dopo l'incubazione, interrompere la digestione aggiungendo soluzione di arresto del volume 1:10 (20% acetonitrile, 6% acido trifluoroacetico) e campioni di centrifuga a 10.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   7. Raccogliere il supernatante(costituito da peptidi digeriti)e scartare eventuali detriti o precipitati pelletati.
3. Dissalezione peptidica
   1. Attivare una punta C18 Stop And Go Extraction (STAGE) (composta da 3 strati di resina C18 in una punta di pipetta da 200 μL) aggiungendo 100 μL di acetonitrile al 100% e centrifuga a 1.000 x g per 2 min.
   2. Equilibrare la punta C18 STAGE aggiungendo 50 μL di tampone B (80% (v/v) acetonitrile, 0,5% (v/v) acido acetico) e centrifuga a 1.000 x g per 2 min.
   3. Equilibrare la punta C18 STAGE aggiungendo 200 μL di acetonitrile buffer A (2% (v/v), 0,1% (v/v) acido trifluoroacetico, 0,5% (v/v) acido acetico) e centrifuga a 1.000 x g per 3-5 min.
   4. Aggiungere ~50 μg di campione digerito sulla punta E sulla centrifuga C18 STAGE a 1.000 x g per 3-5 minuti, o fino a quando il campione non è passato attraverso la colonna di spin. Flash congelare il campione digerito rimanente in azoto liquido e conservare a -20 °C, fino a quando necessario.
   5. Lavare la punta C18 STAGE con 200 μL di Tampone A e centrifugare a 1.000 x g per 3-5 min.
   6. Aggiungere 50 μL Buffer B alla punta C18 STAGE e centrifugare a 500 x g per 2 min. Raccogliere peptidi elusi in tubi PCR da 0,2 ml.
   7. Asciugare i peptidi elusi in una centrifuga sottovuoto per 30-40 minuti alla massima velocità. I campioni completamente essiccati possono essere conservati a temperatura ambiente o a -20 °C fino alla lavorazione.
      NOTA: I peptidi essiccati e dissalti sono appropriati sottomissioni di campioni agli impianti di spettrometria di massa per la lavorazione e possono essere spediti a temperatura ambiente.

6. Spettrometria di massa

1. Ricostituire peptidi in tampone A da 10 μL e misurare la concentrazione necessaria per iniettare peptidi da ~1,5 a 3 μg sulla colonna MS. La quantità di campione dipenderà dalla strumentazione.
2. Utilizzare un gradiente predeterminato di acetonitrile (circa il 5-60%) nello 0,5% di acido acetico nel tempo desiderato (ad esempio, 2 ore) per separare i peptidi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, seguita da ionizzazione elettrospray nello spettrometro di massa.
3. Acquisire scansioni MS utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione in modalità di acquisizione dipendente dai dati(m/z da 300 a 1650).
   NOTA: la percentuale e la lunghezza del gradiente sono determinate dall'esperimento e dall'utente. Le impostazioni precise dello spettrometro di massa dipendono dalla strumentazione, dall'esperimento e dalle preferenze dell'utente.

7. Analisi dei dati

NOTA: I dati MS possono essere elaborati con numerose pipeline bioinformatiche. In questo protocollo, descriviamo l'elaborazione utilizzando le piattaforme MaxQuant e Perseus disponibili al pubblico, ma raccomandiamo ai singoli utenti di valutare gli strumenti bioinformatici appropriati per l'analisi, la preferenza e l'utilizzo.

1. Caricare file di dati non lavorati (direttamente dallo strumento MS) utilizzando il software MaxQuant. Identificare le proteine sotto i parametri di ricerca MaxQuant modificati; minimo di due peptidi unici necessari per l'identificazione delle proteine utilizzando un approccio di esca bersaglio per un tasso di scoperta falso dell'1%, implementare una quantificazione senza etichette con corrispondenza tra le corse, incorporare il file FASTA degli organismi ottenuto dal database UniProt (cioè Cryptococcus neoformans H99, Mus musculus) per identificare e quantificare i peptidi presenti con il motore di ricerca Andromeda. Consultare gli strumenti online pubblici maxquant per esercitazioni dettagliate (vedere Tabella dei materiali).
2. Caricare il file di output MaxQuant ('proteingroups.txt') in Perseus.
3. Filtrare le righe contenenti potenziali falsi positivi e contaminanti, nonché modificate solo dai peptidi del sito con il "Filtrare le righe in base alla colonna categorica".
4. Trasformare i valori dei dati nella_{scala del log 2.}
5. Creare gruppi di set di dati fornendo annotazioni categoriche alle righe.
6. Filtrare il set di dati in base a valori validi per definire un cut-off per il rilevamento delle proteine.
   NOTA: Per un'analisi rigorosa e robusta viene suggerito un tasso di identificazione >50%. Ad esempio, se quattro repliche fossero elaborate, verrà selezionato un numero minimo di tre valori validi.
7. Se lo si preferisce, imputare i dati sostituendo i valori mancanti dalla distribuzione normale.
   NOTA: I valori figurativi sono ottimizzati in base alla distribuzione normale e forniscono un'intensità LFQ casuale per sostituire i segnaposto "NaN" per simulare le misurazioni tipiche dell'abbondanza. Questa imputazione fornisce una piattaforma per l'analisi statistica downstream che richiedono dati quantificabili.
8. Aggiungere annotazioni alle file proteiche (ad esempio nomi proteici, termini di ontologia genica).
   NOTA: questo flusso di lavoro Perseus generato è ora un solido framework per ulteriori elaborazioni bioinformatiche, analisi statistiche e visualizzazione dei dati, consultare gli strumenti online pubblici di Perseus per esercitazioni dettagliate (vedi Tabella dei materiali).

Results

Il protocollo sopra delineato consente l'identificazione e la quantificazione delle proteine derivate sia dall'agente patogeno fungino, C. neoformans, che dalle cellule di macrofagi ospiti, in un unico esperimento. Seguendo la cocoltura, le cellule vengono raccolte e lavorate insieme e separate bioinformaticamente in base a profili peptidici specifici di ciascuna specie. Questo è un approccio potente per definire l'interazione della relazione ospite-patogeno durante l'infezione. Il numero di proteine identificat...

Discussion

Le fasi critiche del protocollo includono la preparazione di cellule macrofagi e la raccolta di campioni di co-coltura per l'elaborazione delle proteine con un'interruzione minima delle cellule. È importante eseguire passaggi di lavaggio, inoculazione e rimozione delicata e attenta delle cellule macrofagi aderenti per prevenire l'analisi non necessaria delle cellule prima della raccolta. Stabilire il MOI corretto per l'esperimento è anche fondamentale in quanto l'inoculazione con un MOI eccessivamente elevato può causare...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8,5	Fisher Scientific	BP152-1	Mantenere a 4 gradi; C
60 x 15 mm Piatto, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific 174888
Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitrile, grado MS	Pierce	TS-51101
Acido acetico	Sigma Aldrich	1099510001
Acetone	Sigma Aldrich	34850-1L
Ammonio bicarbonato (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Preparare una soluzione madre di 50 mM di ABC, stabile a temperatura ambiente per un massimo di un mese.
Bel-Art&commercio; Sistema di raccolta con aspiratore a vuoto HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	Non è essenziale, le pipette sierologiche possono essere utilizzate per rimuovere i terreni.
resina C18	3M Empore	3M2215
	VWR	10062-906	Non essenziale, possono essere utilizzati altri metodi per rilasciare le cellule dei macrofagi.
Concentratore centrifugo a vuoto	Eppendorf	07-748-15
Unità di filtrazione completa	VWR	10040-436
Provette coniche per falco (15 mL)	Fisher Scientific	05-539-12
Contatore di cellule automatizzato Countess II	ThermoFisher Scientific	Non essenziale, l'emocitometro può essere utilizzato in alternativa.
CytoTox 96 Saggio di citotossicità non radioattiva	Promega	G1780
Ditiotreitolo (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Preparare una soluzione madre sfusa di 1 M DTT, congelata e conservata a -20 ° C fino all'uso. Gettare dopo ogni utilizzo (non congelare-scongelare ripetutamente).
DMEM, glucosio alto, GlutaMAX Integratore	ThermoFisher Scientific	10566016
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Inattivare il calore mediante incubazione a 60 gradi; C per 30 minuti. Preparare 50 ml di aliquote e congelare rapidamente. Scongelare prima della preparazione del terreno
Emocitometro	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Preparare 40 mM HEPES/8 M di urea in soluzione madre, surgelata, conservare a -20 gradi; C fino all'uso. Gettare dopo ogni utilizzo (non congelare-scongelare ripetutamente).
Sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni	ThermoFisher Scientific	LC140	La lunghezza del gradiente si basa sulla complessità del campione, gradiente consigliato di 120 minuti per i campioni di infettivo.
Spettrometro di massa ad alta risoluzione	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Preparare una soluzione madre sfusa da 0,55 M, congelata all'istante, conservare a -20 gradi; C fino all'uso. Gettare dopo ogni utilizzo (non congelare-scongelare ripetutamente).
L-glutammina	ThermoFisher Scientific	25030081	Può essere aliquotato e congelato per la conservazione. Scongelare prima della preparazione del terreno.
Provette per microcentrifuga LoBind	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant è una piattaforma pubblica che offre tutorial, come la MaxQuant Summer School, che delinea le fasi di analisi computazionale di grandi set di dati MS
Microcentrifuga	Eppendorf	13864457
Penicillina : Streptomicina 10k/10k	VWR	CA12001-692	Può essere aliquotato e congelato per la conservazione. Scongelare prima della preparazione del terreno.
Colonne di separazione peptidiche	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
Soluzione salina tamponata con fosfato	VWR	CA12001-676	Non è necessario. Il PBS può anche essere preparato, ma la filtrazione sterile deve essere eseguita prima dell'uso.
Pierce BCA Protein Assay	ThermoFisher Scientific	23225
Pipetta, sierologica monouso (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Pipetta, sierologica monouso (25 mL) Sonciatore	Fisher Scientific	14955235
ThermoFisher	Scientific	100-132-894
Compressa da cocktail con inibitore della proteasi	Roche	4693159001
Dodecil solfato di sodio	ThermoFisher Scientific	28364	20% (w/v)
Spettrofotometro (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE centrifuga ribaltabile	Sonazione	STC-V2
Agitatore termico	VWR	NO89232-908
Acido trifluoroacetico	ThermoFisher Scientific	85183
Miscela di proteasi tripsina/lis-C, Grado MS		Pierce A40007	Mantenere a -20 °C.
Bagno ad ultrasuoni	Bransonic	A89375-450	Conservato in cella frigorifera (4C)
Urea	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Preparare 40 mM HEPES/8 M di urea in soluzione stock, congelato all'istante, conservare a -20 ° C fino all'uso. Gettare dopo ogni utilizzo (non congelare-scongelare ripetutamente).
Estratto di lievito peptone destrosio brodo	BD Difco	BM20