Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.
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Articolo metodologico
Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
I modelli di malattia complessi richiedono strumenti all'avanguardia in grado di fornire informazioni fisiologicamente e patologicamente rilevanti e fruibili e di svelare processi altrimenti invisibili. Saggi cellulari avanzati che imitano da vicino lo scenario in vivo si stanno affermando come nuovi modi per visualizzare e misurare l'interazione bidirezionale tumore-ospite che influenza la progressione del cancro. Qui descriviamo due protocolli versatili per ricreare co-colture 2D e 3D altamente controllabili in microdispositivi, imitando la complessità del microambiente tumorale (TME), sotto sorveglianza immunologica naturale e indotta dalla terapia. Nella sezione 1, viene fornito un setting sperimentale per monitorare la diafonia tra cellule tumorali aderenti e popolazioni immunitarie fluttuanti, mediante microscopia time-lapse a campo chiaro. Come scenario applicativo, analizziamo gli effetti dei trattamenti antitumorali, come i cosiddetti induttori immunogenici della morte delle cellule tumorali sul reclutamento e l'attivazione delle cellule immunitarie. Nella sezione 2, i microambienti 3D tumorali-immunitari sono assemblati in un layout competitivo. L'infiltrazione immunitaria differenziale viene monitorata mediante istantanee di fluorescenza fino a 72 ore, per valutare strategie terapeutiche combinate. In entrambi i contesti, le fasi di elaborazione delle immagini sono illustrate per estrarre una pletora di parametri delle cellule immunitarie (ad esempio, migrazione e interazione delle cellule immunitarie, risposta agli agenti terapeutici). Questi metodi semplici e potenti possono essere ulteriormente adattati per simulare la complessità della TME che comprende l'eterogeneità e la plasticità dei sottotipi di cancro, cellule stromali e immunitarie, nonché le loro reciproche interazioni come motori dell'evoluzione del cancro. La conformità di queste tecnologie in rapida evoluzione con l'imaging ad alto contenuto di cellule vive può portare alla generazione di grandi set di dati informativi, portando nuove sfide. In effetti, il triangolo "co-colture/microscopia/analisi avanzata dei dati" stabilisce il percorso verso una precisa parametrizzazione del problema che può aiutare protocolli terapeutici su misura. Prevediamo che la futura integrazione dell'on-a-chip immune al cancro con l'intelligenza artificiale per l'elaborazione ad alto rendimento rappresenterà un grande passo avanti nello sfruttare le capacità come strumenti predittivi e preclinici per l'oncologia di precisione e personalizzata.
Introduzione
L'evoluzione di diverse branche della medicina come discipline sperimentali è dipesa dalla capacità di manipolare la popolazione cellulare e le funzioni degli organi in condizioni controllate1. Tale capacità ha le sue radici nella disponibilità di modelli misurabili in grado di ricapitolare i processi che avvengono nel nostro corpo.
Nell'era dell'immunoterapia e del profilo genomico unicellulare 2, la biologia del cancro deve trarre vantaggio dai modelli emergenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato 2,3
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Protocollo
1. Progettazione di chip per co-colture 2D di cellule aderenti e galleggianti
NOTA: Il layout di co-coltura 2D (Figura 1A-C) è caratterizzato da tre camere (100 μm di altezza) interconnesse da due serie di array di microcanali (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). La camera intermedia forma due compartimenti chiusi senza uscita che bloccano le cellule immunitarie fluttuanti che traboccano nel sito del tumore durante la fase di carico 2.5. Questo tipo di dispositivo è utile per misure bidimensionali in tempo reale della motilità a singo....
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Risultati
L'infiltrazione immunitaria tumorale è un parametro della risposta antitumorale dell'ospite. I tumori sono eterogenei nella composizione, densità, posizione e stato funzionale dei leucociti infiltranti le cui interazioni con le cellule tumorali possono essere alla base di informazioni clinicamente rilevanti per prevedere il decorso della malattia e la risposta alla terapia. In questo senso, le tecnologie microfluidiche potrebbero essere utilizzate come strumenti complementari e privilegiati in vitro per esplorare il cont.......
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Discussione
I metodi descritti cercano di progettare un approccio generale per ricapitolare, con grado modulabile di complessità, due aspetti significativi nel campo dell'onco-immunologia, che possono beneficiare dell'adozione di modelli in vitro più rilevanti. Il primo riguarda il lato della popolazione di cellule tumorali, dove affrontare le caratteristiche delle singole cellule può portare a una migliore descrizione dell'eterogeneità e del significato biologico e clinico correlato tra cui resistenza alla terapia, propensione alle.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare. AS è sostenuto dalla Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) e dal Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS e FM sono sostenuti dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) n. 21366 a G.S.).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali per colture cellulari Provette da | |||
| 50 mL | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | provette da centrifuga |
| 5-aza-2'-deossicitidina DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | Agente ipometilante del DNA |
| Piastre a 6 pozzetti | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | Piastre per | coltura |
| Pallone | trattato per colture cellulari da 75 cm2Corning, New York, NY | 430641U | fiasche di coltura |
| A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA< | br/> CVCL_B222 | linea cellulare di melanoma umano |
| Doxorubicina cloridrato | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | D1515 | antibiotico antraciclina |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, Milano, Italia | ECM0728L | Terreno di coltura per cellule SK-MEL-28 |
| Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco senza calcio senza magnesio | EuroClone Spa, Milano, Italia | Soluzione | tampone salina |
| Siero fetale bovino | EuroClone Spa, Milano, Italia | ECS0180L | ausiliario per colture cellulari |
| Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | separazione di cellule mononucleate dal sangue umano. |
| emocitometro | Neubauer | Contatore di cellule | |
| Fiale eparinizzate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Fiale per la raccolta di sangue venoso | |
| interferone alfa-2b | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | SRP4595 | citochina umana ricombinante |
| L-Glutammina 100X | EuroClone Spa, Milano, Italia | ECB3000D | ausiliario per colture cellulari |
| Azoto | |||
| Mezzi di separazione delle cellule dei linfoliti | Cedarlane Labs, Burlington, Canada | Separazione dei linfociti mediante centrifugazione a gradiente di densità | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norvegia | ||
| Matrigel | Corning, New York, NY | 354230 | fattore di crescita ridotto matrice della membrana basale |
| MDA-MB-231 | Collezione di cultura di tipo americano (ATCC), Manassas, VA | HTB-26 | linea cellulare di carcinoma mammario umano |
| Penicillina/ Streptomicina 100X | EuroClone Spa, Milano, Italia | ECB3001D | ausiliario per colture cellulari |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | Liquid handling |
| PKH26 Red Fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH26GL | colorante cellulare fluorescente rosso |
| PKH67 Linker cellulare fluorescente verde | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH67GL | colorante cellulare fluorescente verde |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, Milano, Italia | ECM2001L | per cellule MDA-MB-231 |
| (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | Puntali sterili per la manipolazione di liquidi |
| (1-10 μ L, 10-20 μ L, 20-200 μ L, 1000 μ L) | EuroClone Spa, Milano, Italia | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | punte per micropipette |
| Timer | |||
| Trypan Blue solution | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 15250061 | colorazione cellulare per valutare la vitalità cellulare |
| Trypsin | EuroClone Spa, Milano, Italia | ECM0920D | reagente di dissociazione per cellule |
| Apparecchiature per colture cellulari a fluorescenza strong> | |||
| EVOS-FL | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Microscopio a fluorescenza per cellule viventi | |
| Incubatore per colture cellulari umificate | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma Coicubatore a calore diretto; TC 230 | Incubazione di colture cellulari a 37 gradi C, 5% CO2 |
| Juli Microscopio | Nanoentek | ||
| Frigorifero da laboratorio (4 gradi; C) | FDM | ||
| (Classe II) | Steril VBH 72 MP | Cappa a flusso laminare | |
| Microscopio ottico | Centrifuga refrigerabile Zeiss | ||
| Beckman | Coulter | ||
| Bagno | |||
| Materiali di microfabbricazione < / strong> | |||
| 3-Aminopropyl)trietossisilano (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | agente silanizzante per l'incollaggio di PDMS a vetrino coprioggetto in plastica |
| Maschere al quarzo di cromo / 4 "x4", HRC / No AZ | MB W& A, Maschere | per fotolitografia | |
| Vetrino coprioggetti, D 263 M Schott vetro, (170 ± 5 µ m) | Ibidi, Germania | 10812 | |
| Soluzione di perossido di idrogeno 30% | Carlo Erba Reagenti | 412081 | reagenti per soluzione piranha |
| Metil isobutililchetone | Carlo Erba Reagenti | 461945 | PMMA e-beam resist |
| developer Vetrini per microscopio (confezione da 50 vetrini) 76,2 mm x 25,4 mm | Substrati Sail Brand | 7101 | per l'incollaggio di chip |
| Miltex Biopsy Punch con stantuffo, ID 1.0mm | Punzoni per biopsia dermica | Tedpella | |
| PMMA 950 kDa | Allresist, Germania | AR-P. 679.04 | Resistenze elettroniche positive per la modellazione di maschere ottiche |
| Vetrini coprioggetti polimerici non trattati | Ibidi, Germania | 10813 | substrati per l'incollaggio di chip |
| Prime CZ-Si Wafer, 4", (100), Boro drogato | Gambetti Xenologia Srl, Italia | 30255 | |
| Propan-2-olo | Carlo Erba Reagenti | 415238 | |
| Acetato di etere monometilico di glicole propilenico (PGMEA) | Sigma Aldrich | 484431-4L | SU-8 resiste allo sviluppatore |
| SU-8 3005 | Micro resist technology,Germania | C1.02.003-0001 | Negativo Fotoresist |
| SU-8 3050 | Tecnologia micro resist, Germania | C1.02.003-0005 | Fotoresist negativi |
| Suite di Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mm | Tedpella | 15111-40, 15111-60, 15111-80 | punzoni per biopsia dermica per serbatoi di chip |
| Acido solforico 96% | Carlo Erba Reagenti | 410381 | reagenti per soluzione piranha |
| SYLGARD 184 Kit di elastomeri siliconici | Dowsil, Dow Corning | 11-3184-01 | Elastomero siliconico (PDMS) |
| Trimetilclorosilano (TMCS) | Sigma Aldrich | 92360-100ML | per SU-8 masters |
| Apparecchiature di microfabbricazione | |||
| 100 kV litografia a fascio elettronico | Raith-Vistec EBPG 5HR | ||
| Sistema di litografia ottica | EV-420 allineatore | ||
| Sistema di mordenzatura ionica reattiva | Oxford plasmalab 80 plus | ||
| Essiccatore sottovuoto |
Riferimenti
- Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
- Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
- Cancer Cell. Models for Immu....
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Ristampe e permessi
